ao工藝mbr處理生活污水中硝化菌群的研究

硝化菌生長緩慢，對環(huán)境因素敏感，因此硝化作用已成為生物脫氮處理的限制性步驟。膜生物裝置（mlr）的高效固液分離效應(yīng)可以將廢水過濾，防止生物流失。這是解決傳統(tǒng)制備中硝化能力不足的重要方法。近年來,各種分子生物學(xué)技術(shù)開始應(yīng)用到環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析上。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)—變性梯度凝膠電泳(PCR—DGGE)作為一種快速、簡便的指紋識別技術(shù)解決了傳統(tǒng)的生物分離培養(yǎng)的難題,也將微生物多樣性研究提高到分子水平上。熒光原位雜交(FISH)技術(shù)具有快速便捷的特點(diǎn),可原位檢測出活性污泥菌膠團(tuán)上的硝化菌的分布情況,結(jié)合稀釋方法,可對環(huán)境樣品中的硝化菌進(jìn)行定量分析。FISH技術(shù)既可定性,又可對環(huán)境中的硝化菌進(jìn)行直接計(jì)數(shù),是研究硝化菌群的空間和數(shù)量分布的有效檢測手段。筆者采用A/O工藝MBR,以生活污水為處理對象,考察該系統(tǒng)的脫氮特性,并應(yīng)用PCR—DGGE與FISH分子生物學(xué)技術(shù),對系統(tǒng)各個運(yùn)行階段的硝化菌群的時空分布進(jìn)行了分析。1材料和方法1.1生物處理技術(shù)實(shí)驗(yàn)裝置采用A/O工藝MBR生物脫氮系統(tǒng),流量調(diào)整槽+反硝化池和硝化池兩部分組成,具體見圖1。膜組件的尺寸為285mm×196mm×7mm,膜板是由ABS塑料制成的中空骨架,通過熱合方式將膜片與骨架粘結(jié),膜片與骨架間充填厚度1.5mm的無紡布以保證通水性能,膜板頂部為出水口。取城市污水處理廠曝氣池成熟活性污泥為接種污泥,以人工模擬生活污水為處理對象。采用間歇抽吸出水(抽10min,停2min),膜下用穿孔管鼓風(fēng)曝氣方式增加硝化池中的DO以及靠膜表面氣泡的剪切力減少膜污染。系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行60d,運(yùn)行參數(shù)為:DO2～4mg/L、pH7.0～7.8、溫度20～25℃、HRT8h、日處理量50L、污泥質(zhì)量濃度2000～6000mg/L、污泥回流比為0.75。1.2檢測過程和分析方法1.2.1污泥和廢水樣品分析在MBR系統(tǒng)運(yùn)行過程中,分別在1、4、7、10、15、22、27、30、33、38、41、45、48、50、55、60d進(jìn)行了污泥采樣和水質(zhì)分析。每次分析都對BOD5、COD、NH3-N、NO-3-N、NO-2-N、DO和pH進(jìn)行檢測,TN只在1、7、10、15、22、27、33、38、45、48、55、60d進(jìn)行檢測。對所有水質(zhì)參數(shù)都檢測的樣品進(jìn)行了分子檢測。1.2.2紫外分光光度法BOD5、COD、TN、NH3-N、NO-3-N、NO-2-N參照美國哈希公司的水質(zhì)分析方法,采用該公司生產(chǎn)的DR4000紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。DO、pH采用美國哈希公司的臺式多參數(shù)測定儀進(jìn)行檢測。1.2.3pcr擴(kuò)增和分析樣品取樣后在-40℃中保存。DNA提取采用凍溶+玻璃珠+溶菌酶+十二烷基硫酸鈉(SDS)的方法,粗制的總DNA純化采用凝膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化。采用上游引物GC341F(5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCTACGGGAGGCAGCAG3’),下游引物EU500R(5’-GTATTACCGCGGCTGCTGG3’)對純化樣品進(jìn)行16SrDNA的巢式PCR擴(kuò)增。PCR采用50μL體系,擴(kuò)增條件為:94℃變性1min,57℃退火1min,72℃延伸2min,30個循環(huán);采用1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)。采用Bio-rad公司生產(chǎn)的DGGE電泳儀對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。聚丙烯酰胺變性梯度膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%,變性梯度為45%～70%,溫度60℃,電壓35V,1×TAE緩沖液中電泳16h后,用SYBRGreenⅠ核酸染色液(1∶10000稀釋度)染色10min,然后立即在紫外照射儀上觀察并照相。先采用硝化菌通用探針EU500R(5’-ACCGCGGCTGCTGG-3’)(5’端FITC標(biāo)記),再采用氨氧化菌探針NS0190(5’-CGATCCCTGCTTTTCTCC-3’)(5’端HEX標(biāo)記),然后同時采用亞硝酸氧化菌探針NIT3(5’-CCTGTGCTCCATGCTCCG-3’)(5’端HEX標(biāo)記)和競爭性探針CNIT(5’-CCTGTGCTCCAGGCTCCG-3’),均對4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛4℃固定和酒精脫水后的污泥樣品進(jìn)行FISH雜交。雜交條件為:46℃濕盒內(nèi)雜交2.5h。所有探針最終質(zhì)量濃度為5ng/μL。雜交后,所有探針在48℃清洗液中嚴(yán)格浸泡20min,之后用DEPC水沖洗清洗玻片。空氣風(fēng)干后,涂上薄層的反熒光退色劑(Citifluor),在MoticBA400T熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照,并采用MoticFluo1.0軟件對圖像進(jìn)行數(shù)字分析。2結(jié)果與討論2.1硝化池內(nèi)tn的去除及變化A/O工藝MBR處理人工模擬生活污水時,系統(tǒng)對TN及NH3-N的去除效果分別見圖2(由于10、38d的數(shù)據(jù)偏差過大,沒有進(jìn)行統(tǒng)計(jì))和圖3。由圖2可知,進(jìn)水TN保持在60mg/L左右;系統(tǒng)運(yùn)行初期,TN的去除率并不是很高,出水TN較高;隨著時間的延長,TN去除率逐漸提高,15d(第3次統(tǒng)計(jì)檢測)后達(dá)到85%以上。這是由于系統(tǒng)運(yùn)行初期,硝化菌自身生長繁殖較慢,同時異氧菌生長繁殖較快,對氨氧化菌的生長起一定的抑制作用。隨著系統(tǒng)的運(yùn)行,硝化菌的數(shù)量逐漸增加,TN的去除率逐漸提高,出水TN濃度逐漸降低。由圖3可知,進(jìn)水NH3-N在48d(第13次統(tǒng)計(jì)檢測)前控制在45mg/L左右,穩(wěn)定運(yùn)行后出水NH3-N在1mg/L左右;48d后將進(jìn)水NH3-N提高到60mg/L左右,出水NH3-N略有提高,在2mg/L左右,NH3-N去除率保持在95%以上。說明本系統(tǒng)對NH3-N負(fù)荷具有一定的抗沖擊能力。由圖4可知,由于進(jìn)水中不含NO-3-N和NO-2-N,所以系統(tǒng)運(yùn)行初期,硝化池中NO-3-N和NO-2-N濃度較低;隨著系統(tǒng)的運(yùn)行,水中的NH3-N逐漸轉(zhuǎn)化為NO-3-N和NO-2-N,水中的NO-3-N和NO-2-N濃度逐漸升高,但是由于亞硝酸氧化菌和反硝化菌生長繁殖較氨氧化菌慢,所以當(dāng)NH3-N去除率穩(wěn)定在95%時,硝化池中NO-3-N和NO-2-N的濃度繼續(xù)升高,直到系統(tǒng)運(yùn)行到30d(第8次統(tǒng)計(jì)檢測)后,NO-3-N和NO-2-N濃度開始逐漸降低,說明此時系統(tǒng)中的反硝化菌已處于對數(shù)生長期。由圖5可知,系統(tǒng)運(yùn)行到48d(第13次統(tǒng)計(jì)檢測)時,出水NO-3-N和NO-2-N分別穩(wěn)定在15、5mg/L左右。NO-3-N濃度達(dá)到《城市污水再生利用地下水回灌水質(zhì)》(GB/T19772—2005)的要求,NO-2-N濃度略高。2.2酶反應(yīng)的結(jié)果2.2.1系統(tǒng)發(fā)育類菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖6可知,DNA提取、純化后片段為8000bp左右。由圖7可知,硝化菌的16SrDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段約為220bp,與預(yù)期的DNA片段大小相符。為了考察長期運(yùn)行過程中系統(tǒng)內(nèi)硝化菌群的動態(tài)變化,對運(yùn)行各階段污泥樣品進(jìn)行了DGGE分析,結(jié)果如圖8所示。雖然DGGE分析中不排除假陽性或假陰性結(jié)果,但通?？梢约僭O(shè)DGGE圖譜中1條帶代表1個種,同一圖譜中的對應(yīng)條帶的密度可代表此菌種的豐度。由圖8可知,各條泳道內(nèi)的條帶數(shù)隨運(yùn)行時間的延長呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,特別是在系統(tǒng)運(yùn)行22d后條帶數(shù)的變化最為顯著。一些在運(yùn)行初期存在的優(yōu)勢菌種并沒有隨著運(yùn)行時間的延長而消失,同時又出現(xiàn)了一些新的菌種。除了新菌種的出現(xiàn)外,生物種群結(jié)構(gòu)的另一個變化是,隨著運(yùn)行時間的延長,各菌種的豐度也發(fā)上了變化。A、B、C類菌為系統(tǒng)運(yùn)行初期的優(yōu)勢菌群,以B類菌密度最大,A類菌次之,C類菌密度最小,即B類菌占硝化菌的比例最大,C類菌占硝化菌比例最小。隨著系統(tǒng)運(yùn)行時間的延長,A、B、C類菌的豐度都有所增加,以C類菌最為突出。到系統(tǒng)運(yùn)行后期,C類菌的條帶密度變?yōu)樽畲?。同時,也出現(xiàn)了E、F等類新菌種。2.2.2fish檢測結(jié)果為了確定DGGE圖譜中的優(yōu)勢菌種,采用硝化菌中主要菌種氨氧化菌和亞硝酸氧化菌的特異探針對系統(tǒng)各檢測時間的污泥樣品進(jìn)行雜交。結(jié)合文獻(xiàn)的測序結(jié)果可以確定:DGGE圖譜中A類菌為氨氧化菌,B、C類菌為亞硝酸氧化菌。將不同檢測時間獲得的FISH圖片用MoticFluo1.0軟件對圖像進(jìn)行數(shù)字分析。對同一時間的樣品進(jìn)行FISH檢測時,每個探針雜交的FISH圖片都隨意選擇至少5個視野,然后根據(jù)圖片的熒光強(qiáng)度和面積對5個視野分析的統(tǒng)計(jì)結(jié)果,得到該時期氨氧化菌和亞硝酸氧化菌在系統(tǒng)中占硝化菌的比例,結(jié)果見圖9(FISH檢測與DGGE檢測對應(yīng)進(jìn)行)。由圖9可知,氨氧化菌從系統(tǒng)運(yùn)行初期到最后,始終占硝化菌的25%左右,亞硝酸氧化菌從系統(tǒng)運(yùn)行初期的35%增長到運(yùn)行后期的55%左右。3系統(tǒng)的脫氮特性(1)處理進(jìn)水濃度TN為60mg/L、NH3-N最高達(dá)60mg/L的中濃度模擬城市生活污水時,A/O工藝MBR可維持高效的硝化作用,系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后NO-3-N和NO-2-N可維持在1