乙腈提取-氣相色譜法測(cè)定曲克蘆丁中的甲醇

特洛伊木丁是一種抗凝劑和溶菌劑。它可以抑制紅細(xì)胞和血小板的聚集，防止血栓形成，增加血液中的氧氣含量，改善微循環(huán)，促進(jìn)新血管的形成，并改善側(cè)支循環(huán)。曲克蘆丁是蘆丁和環(huán)氧乙烷經(jīng)過(guò)醚化反應(yīng)后得到的羥乙基蘆丁的有效成分。要達(dá)到注射要求的曲克蘆丁必需經(jīng)過(guò)精制,目前,通過(guò)甲醇對(duì)曲克蘆丁進(jìn)行精制提純是曲克蘆丁純化的通用手段。然而,甲醇對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有麻醉作用;對(duì)視神經(jīng)和視網(wǎng)膜有特殊選擇作用,引起病變;可致代射性酸中毒,食用5～10mL能雙目失明,大量食用會(huì)導(dǎo)致死亡。甲醇?xì)埩粲谇颂J丁中不可避免,曲克蘆丁中甲醇含量檢測(cè)是優(yōu)化其生產(chǎn)工藝必備的前提條件之一。目前,國(guó)內(nèi)只有藥典中有提到曲克蘆丁中甲醇的檢測(cè)方法,但是其方法中存在很多弊端,本方法采用乙腈作為溶劑,漩渦混合超聲提取,氣相色譜外標(biāo)法定量測(cè)定曲克蘆丁中甲醇,該法線性范圍寬、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。1實(shí)驗(yàn)部分1.1生物基苯磺酸鹽安捷倫7890A氣相色譜儀(帶FID檢測(cè)器);超聲波萃取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);漩渦混合器(浙江金壇市金城教學(xué)儀器廠)等。乙腈為優(yōu)級(jí)純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);甲醇為優(yōu)級(jí)純(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);曲克蘆丁(市售)。1.2平等進(jìn)樣口溫度載氣為99.99%高純氮?dú)?色譜柱:DB-WAX(30m-0.25mm-0.32mm);分流不分離進(jìn)樣口溫度為150℃,分流比20:1;檢測(cè)器溫度為200℃;柱流量為4ml/min,柱箱溫度條件:初始溫度60℃保持3min,以20℃/min升溫至120℃,保持5min。1.3甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備精密稱取甲醇0.5000g至100ml容量瓶中,用乙腈定容,混勻,得5mg/ml甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液用乙腈稀釋成0.05、0.1、0.2、0.5、1、2mg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.4超聲-超聲波法精密稱取曲克蘆丁樣品0.5000g,用乙腈作為溶劑,轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中,用乙腈定容,漩渦混合器混合2min,超聲波超聲20min,0.45μm微孔濾膜過(guò)濾于進(jìn)樣瓶中,待測(cè)。2結(jié)果與討論2.1色度條件的優(yōu)化和選擇2.1.1溫度對(duì)峰形及峰面積穩(wěn)定性的影響選擇進(jìn)樣口溫度為120、150、180、200℃時(shí),用10mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣5次,結(jié)果顯示,當(dāng)進(jìn)樣口溫度在120℃和150℃時(shí),峰形及峰面積穩(wěn)定性較好,當(dāng)進(jìn)樣口溫度在180℃和200℃時(shí),峰形及峰面積穩(wěn)定性波動(dòng)較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,溫度越低,實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性越好,主要原因可能是甲醇分子量小,沸點(diǎn)低,本身穩(wěn)定性較低,當(dāng)氣化溫度低時(shí),其膨脹系數(shù)相對(duì)小些,穩(wěn)定性就會(huì)更好。但是,如果溫度太低,供試溶液中其它雜質(zhì)就無(wú)法排除,因此進(jìn)樣口溫度選150℃更好。2.1.2溫度升溫的確定當(dāng)柱箱溫度從60℃至120℃之間變化時(shí),甲醇出峰時(shí)間一般在1分鐘到2分鐘之間,溫度為60℃時(shí)峰形更好,考慮到供試溶液中雜質(zhì)較多,采用程序升溫,最終溫度升溫至120℃,保持5min后再無(wú)雜質(zhì)峰出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,柱箱溫度條件應(yīng)該為:初始溫度60℃保持3min,以20℃/min升溫至120℃,保持5min。2.2試驗(yàn)條件的選擇2.2.1樣品前拖尾出現(xiàn)多次進(jìn)樣稱取樣品0.5000g,分別采用水、乙醇、乙腈作為溶劑進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)。其中水作為溶劑時(shí),樣品能全部溶解,甲醇的峰拖尾嚴(yán)重,拖尾因子達(dá)到1.8,當(dāng)多次進(jìn)樣后,基線不穩(wěn),雜峰增多,主要原因是大分子的曲克蘆丁無(wú)法去除,嚴(yán)重污染了進(jìn)樣口。當(dāng)采用乙醇作為溶劑時(shí),甲醇峰拖尾,拖尾因子達(dá)到1.5,而且甲醇與乙醇出峰時(shí)間過(guò)于靠近,不便于分析。當(dāng)采用乙腈作為溶劑時(shí),峰形較好,拖尾因子1.2雜質(zhì)較少,復(fù)合要求分析要求。因此,溶劑選擇乙腈。譜圖見(jiàn)圖1。2.2.2提取方式及提取回收率稱取樣品0.5000g,采用乙腈作溶劑溶解,分別采用漩渦混合提取5min,漩渦混合提取10min,漩渦混合提取5min加超聲提取10min,漩渦混合提取5min加超聲提取15min,漩渦混合提取5min加超聲提取20min。檢測(cè)回收率結(jié)果見(jiàn)表1,實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)明,單一采用漩渦混合方式回收率一般只能達(dá)到74%,漩渦混合加超聲提取效果明顯提高,回收率能達(dá)到90%以上,當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到20min時(shí),已經(jīng)基本能夠滿足檢測(cè)要求,回收率能達(dá)到98.6%。因此,提取方式選擇漩渦混合提取5min加超聲提取20min。2.3該方法的獨(dú)特性在上述色譜條件和實(shí)驗(yàn)條件下,分別取空白溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液與供試品溶液進(jìn)行測(cè)定,得到特征峰,結(jié)果表明,測(cè)定無(wú)干擾,譜圖見(jiàn)圖2。2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性關(guān)系將1.3節(jié)中所制備的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,以質(zhì)量濃度(mg/ml)為橫坐標(biāo)X,甲醇鋒面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1546.9X+2154.6(R=0.9998)結(jié)果表明,甲醇濃度在0.05～2mg/ml內(nèi)線性關(guān)系良好。甲醇的定量限為0.0042mgml。2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取一定量的甲醇儲(chǔ)備液,用乙腈稀釋得到濃度分別為1.2mg/ml的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液各5份進(jìn)行分析,計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明,兩個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的RSD均小于1.95%,符合檢測(cè)方法要求。2.6回收率的測(cè)定稱取0.5000g已知甲醇含量的曲克蘆丁樣品6份,分別加入質(zhì)量濃度分別為1、2mgml的甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml,每個(gè)濃度3份,在2.1和2.2的條件下進(jìn)行分析,計(jì)算回收率結(jié)果見(jiàn)表3。甲醇的回收率均處于98.1%～101.2%之間。2.7樣品的甲