基因工程制藥

（4.純化.質(zhì)控）

獲得目的基因↓組建重組質(zhì)?！龢?gòu)建基因工程菌(或細胞)↓培養(yǎng)工程菌↓

產(chǎn)物分離純化↓除菌過濾：↓半成品檢定↓成品檢定包裝

基因工程藥物生產(chǎn)的一般程序細菌過濾器：蔡氏濾器EKS、G5、G6玻璃濾器3.8基因工程藥物的分離純化一.特點和分離純化的基本過程1.特點：初始物料組成復雜目的產(chǎn)物含量較低

穩(wěn)定性差質(zhì)量、純度要求較高產(chǎn)品(目的產(chǎn)物)質(zhì)量的要求產(chǎn)品用途決定純度要求：體外診斷試劑允許一定量的雜質(zhì)存在，要求純度在80%以上；體內(nèi)治療用產(chǎn)品應具高純度98%以上。產(chǎn)品活性:產(chǎn)品劑型，貯存要求和穩(wěn)定性。2.分離純化的基本過程精細純化粗級分離

胞內(nèi)表達胞外表達二.分離純化技術(shù)

(1)細胞收集：離心分離，膜過濾

1.細胞破碎與固液分離（前處理）CENTRITECH?LAB細胞濃縮及回收系統(tǒng)CENTRITECH?CELL細胞濃縮及回收系統(tǒng)輕柔式離心，保持

高細胞活性自動連續(xù)分離細胞用于生物制藥工業(yè)機械破碎法(常用，速度快,處理量大)(2)細胞破碎：高速組織搗碎機超聲波細胞破碎儀

超聲波破碎法(中、小量)

非接觸式全自動超聲波破碎儀非機械破碎法:酶溶法:利用生物酶將細胞壁和細胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、殼多糖酶等。溶菌酶對細菌作用效果好。化學滲透法：利用有機溶劑(苯、甲苯)、抗生素、表面活性劑(SDS、Triton)、金屬螯合劑(EDTA)、變性劑(脲、鹽酸胍)等可以改變細胞壁或細胞膜的通透性,從而使內(nèi)含目的物有選擇地滲透出來。不同微生物的破壁方法選擇破碎法一般原則:若提取的產(chǎn)物在細胞質(zhì)內(nèi),需用機械破碎法；若在細胞膜附近則可用較溫和的非機械法;若提取的產(chǎn)物與細胞膜或壁相結(jié)合時,可采用機械法和化學法相結(jié)合的方法。

(3)固液分離(離心、膜過濾、雙水相分配)離心沉淀是固液分離的主要手段,包括高/超速離心。膜過濾技術(shù)有微濾、超濾和反滲透等。

微濾(0.05-12um)分離細胞、細胞碎片、包含體和蛋白質(zhì)沉淀物等固體顆粒;

超濾

(0.003-0.08um)濃縮、純化蛋白質(zhì)、多糖和核酸等大分子物質(zhì);

反滲透(0.001-0.01um)用于脫去抗生素、氨基酸等小分子中的水分。超濾膜僅截留相對分子質(zhì)量較大(約103_

106)的有機物質(zhì)

一般的反滲透膜可以截留幾乎所有的鹽和有機物

超濾純化雙水相萃取系統(tǒng)是由兩種水溶性高聚物或一種高聚物與無機鹽在水溶液中混合而成,由于兩相均含較多的水,稱為雙水相。常用的雙水相系統(tǒng)有聚乙二醇(PEG)/葡聚糖、聚乙二醇(PEG)/無機鹽。2.目的產(chǎn)物（重組蛋白質(zhì)）的分離純化美國GE公司蛋白質(zhì)分離純化裝置上海廈美公司蛋白分離層析系統(tǒng)分部收集器記錄儀蠕動泵梯度混合儀生產(chǎn)用的層析柱蛋白質(zhì)產(chǎn)物的性質(zhì)方法

電荷（等電點）離子交換（IEX）分子量凝膠過濾（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特異性結(jié)合親和（AC）

蛋白質(zhì)分離方法的選擇(1)親和色譜

(affinity

Chromatography

AC)（配基）載體

ReversiblespecificbindingSampleapplicationandwashEquilibration

Elution親和層析選擇性最強；不放在第一步；否則：雜質(zhì)多，壽命短；體積大，介質(zhì)貴一步純ProductionandpurificationoffusionproteinsSchematicoverviewofGSTfusionproteinpurificationusingGSTrap.

(2)離子交換色譜

(ionexchangechromatography,IEC)Chargedaminoacidsonthesurfaceofaproteincanbindtooppositelychargedligandsoftheionexchanger.ArrowsindicatesomechargedregionsoflysozymeThehigherthenetcharge,thehigherthesaltconcentrationrequiredfordesorption.

123456陰離子交換樹脂6.Regeneration

2.Sampleapplicationand

wash1.Equilibration3.4.5Gradientelution分離純化采用的方式:正吸附:將目的產(chǎn)物離子化,然后被交換到介質(zhì)上,雜質(zhì)不被吸附而從柱中流出。

優(yōu)點：產(chǎn)物純度高,濃縮作用,適于處理目的產(chǎn)物濃度低、工作液量大的溶液;負吸附:將雜質(zhì)離子化后交換,目的產(chǎn)物不被交換而直接流出。

適用于處理目的產(chǎn)物濃度高的工作液,通常只可除去50%-70%的雜質(zhì),產(chǎn)物的純度不高。

蛋白質(zhì)是兩性分子；若在低pH范圍穩(wěn)定，帶正電，用陽離子交換劑；若在高pH范圍穩(wěn)定，帶負電，用陰離子交換劑；等電點處于極端位置：pI<5或者pI>8的基因工程產(chǎn)物首選離子交換色譜；鹽析樣品不宜直接上離子交換，可直接疏水色譜；洗脫時，采用pH梯度或離子強度梯度（常用）連續(xù)梯度步級梯度離子交換劑可以通過再生反復使用。

分辨率高、容量大、操作容易?。。?弱陰離子交換樹脂強/弱陽離子交換樹脂(3)凝膠過濾

（gelfiltration）

凝膠過濾色譜脫鹽，換緩沖液；分級分離（雜蛋白分子量一般大于30KD）(細胞因子分子量一般約15KD)(300-500bp；100多個氨基酸)；產(chǎn)品成形前去除多聚體或降解產(chǎn)物，避免不均一性；規(guī)模小，速度慢，一般放最后。(4)疏水色譜Hydrophobicinteraction

chromatography(HIC)

疏水色譜介質(zhì)疏水基團：苯基、辛基；蛋白質(zhì)疏水區(qū)域：苯丙氨酸、丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸側(cè)鏈；高鹽吸附,低鹽洗脫；鹽析樣品不宜用離子交換，可直接疏水色譜Gradient

elutionEquilibrationSampleapplicationandwash

Regeneration層析的一般過程：平衡；上樣，淋洗；洗脫，收集；再生3.非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)主要有DNA、熱原和病毒

(1)DNA的去除：pH＞4，DNA呈陰離子,目的蛋白質(zhì)pI＞6，可用陰離子交換劑吸附除去。蛋白質(zhì)為強酸性,選擇條件使其吸附在陽離子交換劑上,不讓DNA吸附上去。利用親和層析吸附蛋白質(zhì),而DNA不被吸附。疏水層析高鹽濃度上柱,使DNA—蛋白質(zhì)結(jié)合物離解,蛋白質(zhì)被吸附在柱上,而DNA不被吸附。(2)熱原的去除熱原質(zhì)：腸桿菌科所產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素,在細菌生長或細胞裂解時釋放出來,是G-細胞壁組分--脂多糖,相當穩(wěn)定,經(jīng)高壓滅菌不失活。防止熱原產(chǎn)生：分離純化在無菌條件下操作。層析介質(zhì)，洗脫液需先經(jīng)無菌處理,流出的蛋白質(zhì)溶液應無菌處理（0.2μm濾膜）熱原（脂多糖）是陰離子物質(zhì),用陰離子交換層析法去除。此時應調(diào)節(jié)pH使蛋白質(zhì)不被吸附。注射用藥必須無熱原！(3)病毒的去除

病毒最大的來源是由宿主細胞帶入。經(jīng)過色譜分離,一般能將病毒除去,也可以用紫外線（UV）照射使病毒失活,或用過濾法（NF）將病毒去除。

三.選擇分離純化方法的依據(jù)1.根據(jù)產(chǎn)物表達形式來選擇分泌型表達產(chǎn)物：發(fā)酵液體積大、濃度低,先濃縮（沉淀、超濾/最常用）。周質(zhì)表達產(chǎn)物：E.coli經(jīng)低濃度溶菌酶處理,再用滲透壓休克法，雜蛋白少，易純化。細胞內(nèi)可溶性表達產(chǎn)物（融合蛋白）：破菌后的可溶性離心上清液,首選親和層析分離方法（pBG-2融合表達），或選用離子交換色譜包涵體內(nèi)表達產(chǎn)物：包涵體對蛋白質(zhì)分離純化的影響:

1.很容易與胞內(nèi)可溶性蛋白雜質(zhì)分離,重組蛋白純化較容易完成;2.包涵體中重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物經(jīng)過了一個變性復性過程,較易形成蛋白產(chǎn)物的錯誤折疊和聚合體。包涵體的分離和重組蛋白質(zhì)的純化步驟:細菌收集與破碎包涵體的分離洗滌與溶解變性蛋白質(zhì)的純化重組蛋白質(zhì)的復性天然蛋白質(zhì)的分離

2.根據(jù)分離單元之間的銜接選擇先運用非特異、低分辨的操作單元(如沉淀、超濾和吸附等),縮小樣品體積,提高產(chǎn)物濃度,去除最主要的雜質(zhì)(包括非蛋白類雜質(zhì));再采用高分辨率的操作單元(如具有高選擇性的離子交換色譜和親和色譜);最后用凝膠色譜這類分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元,這樣可以提高分離效果，也可以換成產(chǎn)品的緩沖液。3·根據(jù)分離純化工藝的要求選擇

(1)具有良好的穩(wěn)定性和重復性(2)盡可能減少組成工藝的步驟盡可能少(4-5個)(3)組成工藝的各操作單元要相互適應和協(xié)調(diào),工藝與設備也能相互適應,從而減少步驟間對物料的處理和條件調(diào)整

(4)在工藝過程中要少用試劑,以免增加分離純化步驟,或干擾產(chǎn)品質(zhì)量(5)分離純化工藝周期盡可能短（流程要快）

(6)工藝和技術(shù)必須高效,收率高,易操作,對設備條件要求低,能耗低(7)具有較高的安全性：無菌、無熱原、無污染。

3.8基因工程藥物的質(zhì)控

一、原材料的質(zhì)量控制確保編碼藥品的DNA序列正確性,重組微生物來自單克隆,所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定,保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性明確一系列特性:目的基因的來源、克隆經(jīng)過,表達載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分的來源與功能,構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜,抗生素抗性標志物;應提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學特性等二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制在工程菌菌種貯存中,要求種子克隆純而穩(wěn)定;在培養(yǎng)過程中,要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定,始終無突變;在重復生產(chǎn)發(fā)酵中,工程菌表達穩(wěn)定;始終能排除外源微生物污染。生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品應有種子庫,并證明種子庫不含致癌因子,無污染,并由原始種子庫建立生產(chǎn)用工作細胞庫。三、純化工藝過程的質(zhì)量控制產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學試驗數(shù)據(jù),確證提純物批間保持一致性;外源蛋白質(zhì)、DNA(100pg/劑量)與熱原質(zhì)控制在規(guī)定限度以下。精制過程中能清除宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分及精制工序本身引入的化學物質(zhì),并有檢測方法。

四.目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制

（蛋白質(zhì)藥物的質(zhì)量控制***）

產(chǎn)品的鑒別純度分析生物活性測定穩(wěn)定性考察產(chǎn)品一致性的保證IVIG(液體)檢定結(jié)果的比較

1.產(chǎn)品的鑒別

重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品常用的鑒定方法電泳方法:SDS,等電點聚焦,免疫電泳免疫學分析方法:放免法(RIA),放射性免疫擴散法(RID),酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),免疫印跡受體結(jié)合試驗(receptorbinding)高效液相分析法(HPLC)肽圖分析法EdmanN末端序列分析法圓二色譜(CD)核磁共振(NMR)

(1)肽圖分析肽圖分析：用酶法或化學法降解目的蛋白質(zhì),對生成的肽段進行分離分析。肽圖分析是檢測蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中細微變化的最有效方法。肽段的檢定通過AA組成分析及N末端測序(過去)；用高效液相色譜或毛細管電泳(CE)測定（現(xiàn)在）。肽圖分析可作為基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品或參考品作精密比較的手段。肽圖分析結(jié)果與AA成分和序列分析結(jié)果合并,作為蛋白質(zhì)的精確鑒別。對含二硫鍵的制品,肽圖分析圖可確證制品中二硫鍵的排列

A.酶切肽圖分析方法

(胰蛋白酶裂解)待檢樣品處理

將濃度為1mg/ml的待檢樣品及對照品分別對1%碳酸氫胺溶液充分透析，按酶與蛋白質(zhì)溶液之比為1：50（w/w）加入胰蛋白酶，37℃保溫24小時后，10000r/min離心5分鐘，收集上清(或者用0.45um的濾器過濾).

分析方法

用RP-HPLC對離心后上清進行分析。色譜柱為蛋白和多肽分析用的C8或C18柱，上樣量為100μl，流速為1ml/min。A液為含0.1%三氟乙酸的水溶液，B液為含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。連續(xù)梯度洗脫70分鐘(A液從100%至30%，B液從0至70%)，檢測波長為214nm。

HPLC

B.化學裂解肽圖分析方法

（溴化氰裂解）待檢樣品處理

取相當于50μg蛋白的待檢樣品及對照品分別用超純水透析至少16h，凍干。復溶于20μl裂解液中，室溫裂解24小時，然后裂解物加入180μl超純水，再凍干。凍干的裂解物用超純水復溶至適當濃度。

(2)氨基酸(AA)成分分析AA分析儀L－8800型日立全自動氨基酸分析儀一般含50個左右Aa殘基的蛋白質(zhì)的定量分析比較準確。而含100個左右的Aa殘基的蛋白質(zhì)的成分分析產(chǎn)生較大的偏差,相對分子質(zhì)量越大,偏差越嚴重。原因:不同Aa的肽鍵在水解條件下,有些水解不完全,有些則被破壞。完整的Aa成分分析結(jié)果,應為3次測定的平均值,包括甲硫氨酸、胱氨酸和色氨酸的準確值。(3)部分氨基酸序列分析

491型蛋白質(zhì)測序儀(4)重組蛋白質(zhì)分子量的測定

凝膠過濾法SDS法采用凝膠過濾法測定分