兔肺血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的分離提取

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ec3.4.15.1）被稱為石頭，是一種由單個異丙酮鏈組成的白糖蛋白。它在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,尤其在功能性食品——降血壓肽的檢測方面有著不可替代的重要作用。目前,國內(nèi)還沒有生產(chǎn)ACE的廠家,進(jìn)口的ACE價格極為昂貴(2000年SigmaChemicalCompany目錄上ACE的價格是0.1單位為$29.8)。因此,本實(shí)驗(yàn)嘗試一種簡便、價廉的ACE分離提取方法,為進(jìn)一步研究和開發(fā)降血壓肽奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1藥物、試劑和儀器兔肺:購于無錫市崇安寺菜市場;馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hip-His-LeuHHL):Aldrich公司;脫氧膽酸鈉(進(jìn)口分裝):購于中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司;脫氧膽酸鈉(國產(chǎn)):上?；瘜W(xué)試劑公司;DEAE-纖維素:Pharmacia公司;SephadexG-200:Pharmacia公司;乙酸乙酯:上?；瘜W(xué)試劑公司;核糖核酸酶:Pharmacia公司;γ-球蛋白(人類):Serva公司;牛血清白蛋白:上海明珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司;卵清蛋白:上海生化所東風(fēng)技術(shù)公司。1.2自動部分收集器及超濾器SCR20BC高速冷凍離心機(jī):日本HITAHI公司;SBS-100數(shù)控記滴自動部分收集器:上海滬西分析儀器廠;杯式超濾器:上海亞東核級樹脂有限公司;電熱恒溫水浴鍋:北京長安科學(xué)儀器廠;烘箱:浙江嘉興新塍電熱儀器廠;臺式離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1植物葉片活性峰的提取將體重約3～4kg的20只兔子殺死后立即取出肺,剔除結(jié)締組織并用冰冷的0.9%氯化鈉溶液沖洗,一直到?jīng)_洗液不再變紅為止,而后用5倍(w/v)體積的0.02mol/L磷酸緩沖液(pH8.3)勻漿,勻漿液差速離心后獲得以下三部分:P＿1為700×g離心20min的沉淀,S為700×g離心后的上清液在49000×g的條件下再離心1h的上清液,P2為49000×g離心1h的沉淀。沉淀P2溶于20倍的上述同樣的緩沖液中,再加入脫氧膽酸鈉均質(zhì)3min,放置12h后,在49000×g的條件下再離心1h,所得上清液為所提取的ACE粗酶液。為了除去脫氧膽酸鈉,用0.02mol/L磷酸緩沖液(pH8.3)透析ACE粗酶液10h,用濾紙過濾后即可上柱。將DEAE-纖維素預(yù)處理并裝柱(2.5×40cm),用大量0.02mol/L的磷酸鉀緩沖液(pH8.3)平衡12h,體積流量控制為80ml/h,而后將過濾后的粗酶液上柱,用1000ml的上述緩沖液洗脫,除去一些不能被DEAE-纖維素吸附的蛋白質(zhì),再用0～0.4mol/L的KCl(配制于0.02mol/L磷酸緩沖液)梯度洗脫,把具有酶活的洗脫液收集在一起,用超濾杯濃縮至8ml左右。按常規(guī)方法將SephadexG-200裝柱(2.5×90cm),用0.02mol/L的磷酸鉀緩沖液平衡,然后將濃縮后的酶液加入柱內(nèi),用上述緩沖液以8ml/h的流速洗脫,收集活性峰,用超濾杯濃縮。以上各個步驟均在0～10℃的條件下進(jìn)行。1.3.2蛋白質(zhì)的分子量本實(shí)驗(yàn)采用Sephedex-G200凝膠層析法測蛋白質(zhì)的分子量。以細(xì)胞色素C(分子量13.7KD)、卵清蛋白(45KD)、牛血清白蛋白(67KD)、γ球蛋白(165KD)作為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)。1.3.3活性物質(zhì)的測定方法ACE是一種從底物C末端專一水解二肽的酶,馬尿酰組氨酰亮氨酸(Hip-His-LeuHHL)被ACE從C末端水解去除二肽His-Leu后,生成馬尿酸,馬尿酸的生成量可通過分光光度法測定,它的生成量直接反映ACE的酶活。另外HHL與產(chǎn)物馬尿酸都不會被體外ACE粗提取物中的其它成分破壞,故HHL是當(dāng)前測定ACE活性的最佳底物。酶活檢測采用紫外分光光度法,實(shí)驗(yàn)在2ml的離心管中進(jìn)行,每次測試的總體積為0.25ml:含0.1mol/LpH8.3磷酸緩沖液,0.3mol/L氯化鈉,0.005mol/LHHL。在37℃恒溫水浴5min,然后加入適量的酶液啟動反應(yīng),恒溫保持30min后,加入0.25ml1mol/L的鹽酸終止反應(yīng),再加入1.5ml冰冷的乙酸乙酯,用力振蕩混合,3500r/min離心5min后,取出1.0ml酯層轉(zhuǎn)入試管中,在80～90℃的烘箱中烘1h,再將它溶入1.Oml的去離子水中,在228nm測定吸光值;空白對照值在反應(yīng)前先加入0.25ml1mol/L的鹽酸以終止反應(yīng)外,其余操作同反應(yīng)管完全相同。酶活力單位定義:1個酶活力是指在37℃的條件下,催化形成1μmol馬尿酸所需要的酶量。1.3.4蛋白質(zhì)試驗(yàn)蛋白質(zhì)的測定采用福林-酚法,牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。1.3.5測定了行駛?cè)萘坎捎帽椒?硫酸法測定ACE含糖量,以甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果與討論2.1ce與蛋白質(zhì)含量差速離心后,P1、P2、S各部分中蛋白質(zhì)和ACE的含量見表1。S中ACE的含量僅占兔肺中ACE總量的21.4%,但蛋白質(zhì)含量是兔肺總蛋白質(zhì)的48%,其比活力很低,P＿比活力也較低,它們均不適合進(jìn)一步分離純化;P＿2的比活力是S的6倍,其比活力較高,故作為進(jìn)一步分離純化的材料。2.2脫氧膽酸鈉純度對阿斯匹林阿斯匹林阿尼克氏原螯蝦阿司克氏原螯蝦阿斯塔納,第20e-烏蘇烷,ce,a.其為原料,c.其與蛋白質(zhì)比例對阿斯匹林阿尼克氏的合成ACE主要存在于兔的肺泡膜上,它是一種膜蛋白。脫氧膽酸鈉對膜蛋白具有增溶作用,它的純度以及它與蛋白質(zhì)的比例對ACE的比活力有很大的影響(見表2),國產(chǎn)脫氧膽酸鈉由于純度較低,其中的某些雜質(zhì)會使ACE變性,從而影響純化的效果。蛋白質(zhì)與進(jìn)口脫氧膽酸鈉比例為3:1時,達(dá)到最大增溶效果。2.3酶活力的分離ACE粗液通過DEAE-纖維素柱梯度洗脫后,得到三個峰(見圖1),經(jīng)活性測定表明:第一個峰具有酶活力,其氯化鉀濃度在0.04～0.1mol/L范圍之間。將上述具有酶活力的洗脫液濃縮為8ml,經(jīng)SephadexG-200層析時,上樣量為1.5ml,得到兩個蛋白峰(見圖2),其中第二個蛋白峰具有酶活力。當(dāng)上樣量大于1.5ml時,ACE不能得到良好的分離。通過以上一系列的分離提純,ACE的比活力增加了65.8倍,ACE的比活力達(dá)到12.3U/mg(見表3)。2.4測定了行駛?cè)萘客ㄟ^苯酚-硫酸法測得兔肺ACE中糖含量為19.3%(質(zhì)量百分比)。2.5異質(zhì)分子中ce含量的測定以四種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分配系數(shù)(Kav)和分子量的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3)。根據(jù)ACE的最大活力峰Kav為0.0878,求得ACE的分子量為302KD,這比文獻(xiàn)報(bào)道兔肺中ACE的分子量(300KD)稍大,這是由于分離提取的ACE的含糖量為19.3%,利用凝膠層析法測蛋白質(zhì)的分子量時,當(dāng)含糖量大于5%時,測得分子量值偏高。2.6最佳ph的確定以HHL為底物,在37℃測定不同pH時ACE的活力,可知ACE的最適pH為8.3。用不同的pH的緩沖液與ACE液于4℃放置24h,然后測定酶的殘余活力,結(jié)果表明ACE在pH7～10間穩(wěn)定性較高。2.7反應(yīng)溫度對酶活力的影響在pH8.3的緩沖液中,ACE與底物HHL在不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)后測定酶活力,結(jié)果表明酶活力隨反應(yīng)溫度的升高而上升,酶的最適反應(yīng)溫度為37℃,當(dāng)溫度超過37℃時,酶活力急劇下降。將酶和上述緩沖液在不同溫度下保溫60min后,測定殘余酶活力,結(jié)果表明ACE對溫度較敏感,在25℃以