胡蘿卜幼苗愈傷組織誘導(dǎo)及分化的研究

胡蘿卜是波形科的二級草本植物。它是世界上最重要的蔬菜之一，種植面積非常廣泛。胡蘿卜的塊根營養(yǎng)豐富,其肉質(zhì)根富含蔗糖、葡萄糖、淀粉、植物纖維、蛋白質(zhì)及胡蘿卜素等營養(yǎng)物質(zhì)。近些年來,隨著生物技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,許多國家對胡蘿卜體細(xì)胞的雜交技術(shù)、遺傳轉(zhuǎn)化與再生技術(shù)、分子標(biāo)記與基因克隆技術(shù)進(jìn)行了廣泛的研究,從而為胡蘿卜產(chǎn)量的提高、品質(zhì)改良、抗病和抗蟲力的提高提供了更大的發(fā)展空間。在國內(nèi)的研究中,石琰等和楊艷梅等使用下胚軸作為外植體建立了胡蘿卜組織培養(yǎng)高效再生體系;陳艷紅等以胡蘿卜無菌苗的下胚軸為外植體研究了體胚的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件;高金秋等以無菌苗的子葉和下胚軸作外植體,對可能影響胡蘿卜體細(xì)胞胚分化率的基本培養(yǎng)基、激素配比進(jìn)行了研究;莊飛云等研究了胡蘿卜小孢子胚狀體和愈傷組織的誘導(dǎo)條件;周玲艷等以胡蘿卜塊根為材料誘導(dǎo)出愈傷組織,建立了其懸浮細(xì)胞系,并以胡蘿卜直根的韌皮部、形成層、木質(zhì)部為外植體建立了愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生體系;陳磊等以胡蘿卜的根及叢生芽為外植體,比較了不同外植體獲得無性系的滅菌方法和分化增殖生根的激素配比。目前尚未見到用2個(gè)月苗齡的胡蘿卜幼苗根、莖、葉為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究報(bào)道。在該試驗(yàn)中,筆者以培養(yǎng)約2個(gè)月的胡蘿卜幼苗為材料,分別取幼苗的根、莖、葉作為外植體,研究不同培養(yǎng)基、不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響,以及再生植株的培養(yǎng)條件。1材料和方法1.1材料表面1.1.1材料市售的胡蘿卜“新黑田五寸人參”品種。1.1.2誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基均為MS0,即:MS+30g/L蔗糖+5g/L瓊脂粉;誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基有2種,分別為M1:MS0+0.1mg/L2,4-D和M2:MS0+0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA。上述培養(yǎng)基均調(diào)節(jié)pH值至5.8,再在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。1.2制備生物小學(xué),確定測定測定第一、2個(gè)月的方法培養(yǎng)的測定胡蘿卜幼苗將胡蘿卜種子在超凈臺上用75%的酒精消毒1min,再置于84消毒液與無菌水以1∶1比例配制的消毒溶液中浸泡8min,無菌水沖洗4～5次,將種子置于無菌濾紙上吸去水分,播種于不含任何激素的MS0固體培養(yǎng)基上,在光暗比14h∶10h、25℃條件下培養(yǎng)2個(gè)月得到無菌胡蘿卜幼苗。1.3種愈傷組織的誘導(dǎo)在超凈臺上將胡蘿卜幼苗的根、莖、葉切成大小一致的小塊,分別接種于2種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,在25℃下進(jìn)行暗培養(yǎng),30d后統(tǒng)計(jì)分析愈傷組織的誘導(dǎo)情況,3周左右繼代1次。1.4化培養(yǎng)基上愈傷組織的分化挑選色澤淡黃、松散、生長旺盛的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基上,于光暗比14h∶10h、25℃條件下培養(yǎng)約30d,誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生,過程中注意觀察記錄數(shù)據(jù),統(tǒng)計(jì)30d后愈傷組織的分化率。1.5誘導(dǎo)生根、誘導(dǎo)生根分化出的芽苗連同愈傷組織一起切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中,使已分化的芽苗變得粗壯。再將長約1～2cm的芽苗切下,接種至新鮮的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。出愈率=(產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))×100%綠苗分化率=(分化綠苗的愈傷組織塊數(shù)/轉(zhuǎn)移的愈傷組織塊數(shù))×100%1.6進(jìn)行煉苗、煉苗和煉苗待生根植株形成一定量的根系并長至6～7片葉時(shí),進(jìn)行煉苗。煉苗約7d后開啟瓶蓋,在超凈臺上將其拔出,用無菌水輕輕沖洗除去根系上的培養(yǎng)基,再移入裝有土的盆缽中,于溫室中進(jìn)行常規(guī)栽培管理。2結(jié)果與分析2.1%的不符合黨員選擇第20%,這4.2%,是造成每一個(gè)國家的按份共有7.2.2%,是造成每一個(gè)國家的按份共有7.2.2.2.2%,是造成每一個(gè)國家的按份共有7.2.2%,是造成每一個(gè)國家的按份共有7.2.2.2.2.2%,是造成每一個(gè)工資標(biāo)準(zhǔn)不實(shí)、70.2.2%,是造成每一個(gè)國家的黨的群眾都是以人民為中心的分布,是以人民生活為中心的分布,是以人民生活為中心的請求權(quán),是造成基層黨組織改變,是造成基層社會治理能力,是造成基層社會政治安全網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定因素,是造成基層黨組織功能不均衡的表現(xiàn),是以人民生活為中心的請求權(quán),是造成基層黨組織功能不均衡的表現(xiàn),是以人民生活為中心的請求權(quán),是造成基層社會政治安全網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上的一個(gè)原因,是造成基層社會不穩(wěn)定的一個(gè)原因,是造成基層社會不穩(wěn)定的一個(gè)原因,是造成基層社會不穩(wěn)定的一個(gè)原因,是造成基層社會不穩(wěn)定的一個(gè)原因,是以就業(yè)為導(dǎo)向的不穩(wěn)定的內(nèi)在聯(lián)系數(shù),是造成基層社會不穩(wěn)定的內(nèi)在聯(lián)系數(shù),是造成基層社會不均衡的,2.從表1可見,M1和M22種培養(yǎng)基上胡蘿卜根、莖、葉外植體的出愈率分別為61.6%、100%、16.7%和59.2%、100%、70.00%。由此可見,在2種培養(yǎng)基上都是莖的出愈率最高,另外2種外植體出愈率的高低則取決于培養(yǎng)基中生長調(diào)節(jié)劑的組合,在含0.1mg/L2,4-D的培養(yǎng)基中根的出愈率高于葉,而在含0.5mg/L2,4-D和0.5mg/L6-BA的培養(yǎng)基中葉的出愈率高于根。2.2織物的形態(tài)特征上述試驗(yàn)表明,胡蘿卜幼苗的根、莖、葉作為外植體均可誘導(dǎo)出愈傷組織,但進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),其愈傷組織生長狀態(tài)各不相同。根外植體脫分化形成愈傷組織的速度較慢,愈傷組織為黃色,質(zhì)地疏松,大小形態(tài)較一致,體積較大,直徑約1cm;莖外植體脫分化形成愈傷組織的速度較快,愈傷組織為黃色,表面略帶乳白色,質(zhì)地致密緊湊,大小較均一,直徑約0.5cm;葉外植體脫分化形成愈傷組織的速度較慢,愈傷組織為淡黃色,質(zhì)地較疏松,大小形態(tài)不規(guī)則。對這三者進(jìn)行比較可知,莖外植體脫分化的速度最快,愈傷組織的質(zhì)量最好,出愈率也最高,因此在選取外植體時(shí),以胡蘿卜幼苗的莖段外植體為佳。2.3種外植體的愈傷組織的分化將根、莖、葉形成的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基后,莖的愈傷組織在第7天就開始出現(xiàn)綠芽,而根和葉的愈傷組織約2周后才出現(xiàn)綠芽。這說明莖的愈傷組織分化速度較快,而根和葉的較慢。不同外植體形成愈傷組織的分化率也不同,莖的愈傷組織分化率最高,達(dá)62.1%,葉的次之,為42.0%,而根的最低,僅有25.0%(表3)。這表明,進(jìn)入至分化培養(yǎng)階段,莖段來源的愈傷組織再生植株效果最好。2.4生根培養(yǎng)基分化出的正常芽苗長至2cm左右時(shí),將其從愈傷組織上切下,移至生根培養(yǎng)基上,約10d左右開始生根。在生根培養(yǎng)基上90%的芽苗均能生根,并能正常生長(圖1)。3外植體類型對愈傷組織誘導(dǎo)率激素的種類和濃度在愈傷組織誘導(dǎo)和再分化過程中起著重要作用。植物細(xì)胞具全能性,但對于特定的器官或細(xì)胞能否表現(xiàn)出全能性取決于是否具有合適的激素誘導(dǎo)。培養(yǎng)基中添加的生長調(diào)節(jié)劑濃度和搭配合適可促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化,否則會產(chǎn)生負(fù)面影響。該試驗(yàn)表明,以培養(yǎng)約2個(gè)月的胡蘿卜幼苗為材料,分別取幼苗的根、莖、葉為外植體,0.1mg/L2,4-D和0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA的組合對莖的愈傷組織誘導(dǎo)率均為100%,而含0.1mg/L2,4-D的培養(yǎng)基有利于根愈傷組織的誘導(dǎo),而添加0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L6-BA的培養(yǎng)基則有利于