植物組織培養(yǎng)中的褐變現(xiàn)象

20世紀(jì)初，德國(guó)植物生理專家哈維納提出了植物細(xì)胞全能性理論，成為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要組成部分。它在農(nóng)業(yè)、林業(yè)、醫(yī)藥等方面發(fā)揮著顯著的作用。雖然植物組織培養(yǎng)過(guò)程并不復(fù)雜,但在實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)過(guò)程中常常會(huì)遇到一些問(wèn)題,重者會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)和生產(chǎn)的失敗,給科研和生產(chǎn)造成損失。本文針對(duì)組織培養(yǎng)過(guò)程中常出現(xiàn)的幾個(gè)問(wèn)題提出相應(yīng)的防止措施。1.培養(yǎng)基的紅色褐變是組織培養(yǎng)中常遇到的問(wèn)題,外植體在培養(yǎng)過(guò)程中,自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì),使培養(yǎng)基逐漸變成褐色,外植體也隨之進(jìn)一步褐變而死亡的現(xiàn)象。1.1外植體的褐變植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的褐變現(xiàn)象是由多種因素綜合產(chǎn)生的結(jié)果,隨植物的種類、基因型、外植體生長(zhǎng)部位以及生理狀態(tài)、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等的不同而不同。豆科植物和蕓苔屬植物在原生質(zhì)體培養(yǎng)中容易發(fā)生褐變是一個(gè)普遍性問(wèn)題,在蕓苔及其衍生種或變種中的褐化問(wèn)題尤為嚴(yán)重。王永清等(1997)曾在櫻花于不同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況的比較中發(fā)現(xiàn),1/4MS在一定程度上能減輕櫻花外植體的褐變。培養(yǎng)條件如溫度、光照等對(duì)褐變均有影響。溫度過(guò)高或光照過(guò)強(qiáng),都可以提高PPO的活性,從而加速被培養(yǎng)組織的褐變。外植體的褐變是一種酶促褐變,這一點(diǎn)已為大多數(shù)的學(xué)者認(rèn)可。植物組織培養(yǎng)中褐變的發(fā)生與外植體組織中所含的酚類化合物多少和多酚氧化酶(PPO)活性有關(guān)。特別是木本植物都含有較高的酚類化合物。正常條件下,酚類化合物分布在細(xì)胞的液泡內(nèi),酚酶分布在各種質(zhì)體或細(xì)胞質(zhì)內(nèi),這種區(qū)域性分布使得底物多酚類化合物與多酚氧化酶(PPO)被質(zhì)膜分隔開(kāi)來(lái),因而比較穩(wěn)定。在建立外植體時(shí),細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)被破壞,酚類化合物外溢,在溢出過(guò)程中與多酚氧化酶發(fā)生氧化形成棕褐色的醌類物質(zhì)和水,醌類物質(zhì)又會(huì)在酪氨酸酶等的作用下,與外植體組織蛋白中的蛋白質(zhì)發(fā)生聚合,形成黑褐色物質(zhì)(羥醌與黑色素等),引起褐變發(fā)生。1.2防止棕櫚樹(shù)1.2.1不同切割長(zhǎng)度對(duì)組織培養(yǎng)苗成活率的影響由于所選擇的外植體材料的年齡、取材部位、材料大小等均能對(duì)褐變產(chǎn)生影響。Chevre分析了歐洲栗的酚類含量的變化,結(jié)果表明,幼齡材料酚類化合物含量少,而成齡材料比較多。當(dāng)莖尖小于0.5mm時(shí),褐變達(dá)70%以上,而隨著切割長(zhǎng)度增大,褐變減輕;以莖尖8~15mm褐變較輕,組織培養(yǎng)苗成活率達(dá)87%。此外,外植體受傷害程度直接影響褐變,切割時(shí)應(yīng)盡可能減小傷口面積,并縮短切口在空氣中的暴露時(shí)間。1.2.2對(duì)褐變的控制作用將易褐變的外植體材料放在黑暗條件下培養(yǎng)一段時(shí)間,連續(xù)轉(zhuǎn)移,可以減輕褐變。李煥秀等用6種不同的預(yù)處理來(lái)研究其對(duì)蒼溪梨外植體褐變和成活的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),低溫處理對(duì)降低褐變有一定作用。用抗氧化劑或PPO溶液進(jìn)行預(yù)處理也可起到減輕褐變的作用。1.2.3培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件對(duì)外植體分化的影響培養(yǎng)基的狀態(tài)、組成、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)及組合等要適宜,溫度、PH值要盡量調(diào)整到褐化物分泌最少的狀態(tài)(酸性環(huán)境不利于褐變的發(fā)生);大多數(shù)植物種類要求pH值在5.0~6.0。適當(dāng)降低培養(yǎng)基的PH值可以降低多酚氧化酶的活性和底物利用率,從而抑制褐變。張妙霞等(1999)在進(jìn)行柿樹(shù)組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),改良的MS培養(yǎng)基能促進(jìn)外植體分化,減輕外植體的褐變程度。培養(yǎng)基中加入的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)不當(dāng),也會(huì)使外植體產(chǎn)生褐變。張衛(wèi)芳等(2003)在對(duì)一年生薄殼核桃的莖尖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn),隨著培養(yǎng)基中6一BA濃度的升高,褐化率隨之增高,褐化反應(yīng)時(shí)間也提早;較低濃度的6一BA適宜莖尖的分化生長(zhǎng),褐化反應(yīng)慢,部分培養(yǎng)基已無(wú)明顯褐化現(xiàn)象;添加2,4-D、IAA的組合中,褐化反應(yīng)稍有推遲。培養(yǎng)過(guò)程中還要注意適宜的培養(yǎng)條件。因?yàn)樵诜宇愇镔|(zhì)的合成和氧化過(guò)程中,有許多酶系統(tǒng)參與,其中部分酶系統(tǒng)是光活性的。由于較強(qiáng)的光照和較高的溫度,都可以提高PPO的活性從而會(huì)使酶促褐變加強(qiáng)。所以建議在培養(yǎng)初期保持較低的溫度(15~0℃),黑暗或弱光下培養(yǎng),均可減輕培養(yǎng)材料的褐變。1.2.4氯社會(huì)體對(duì)酚類物質(zhì)的吸附組織培養(yǎng)時(shí),在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和其他抑制劑可抑制外植體的酶促褐變。在培養(yǎng)基中加入Vc可有效地防止褐變。一方面可以使多酚氧化酶失活阻止酚類物質(zhì)氧化;另一方面Vc在酶的催化下能消耗溶解氧,使酚類物質(zhì)因缺氧而無(wú)法氧化。在培養(yǎng)基中加入吸附劑可以抑制褐變。活性炭是吸附性較強(qiáng)的無(wú)機(jī)吸附劑,但在使用過(guò)程中,應(yīng)盡量使用最小濃度來(lái)防止褐變,因?yàn)榛钚蕴康奈阶饔檬菬o(wú)選擇性的。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚類物質(zhì)的專一吸附劑,常用作酚類物質(zhì)的保護(hù)劑來(lái)防止褐變。2.組織畸形,為等重離子生長(zhǎng)玻璃化現(xiàn)象是指在培養(yǎng)過(guò)程中材料呈半透明狀,組織結(jié)構(gòu)發(fā)育畸形的現(xiàn)象,又稱過(guò)度水化。玻璃化的苗由于組織畸形,分化能力降低,不易成活。因此不宜用作繼代和移栽的材料。2.1玻璃制造迄今為止,對(duì)于玻璃化的成因尚無(wú)定論,目前認(rèn)為玻璃苗的形成可能有以下幾方面的原因。2.1.1培養(yǎng)基中各化學(xué)成分的變化試管苗培養(yǎng)過(guò)程中,光照、溫度、濕度、pH值均間接影響著玻璃化的發(fā)生。培養(yǎng)時(shí)光照遠(yuǎn)較自然環(huán)境下弱,一般僅為1000~3000lx,培養(yǎng)器皿內(nèi)相對(duì)濕度過(guò)高,氧氣供應(yīng)逐日下降,CO2濃度逐漸上升,培養(yǎng)基中各化學(xué)成分往往開(kāi)始濃度過(guò)高而后又供應(yīng)不足。肖玉蘭等研究發(fā)現(xiàn),光照度在l0O00~20000lx范圍內(nèi),隨著光照度提高,玻璃化苗顯著減少。降低培養(yǎng)溫度、相對(duì)濕度,提高pH值也可有效防止玻璃苗發(fā)生。2.1.2制約外植體生長(zhǎng)的物質(zhì)培養(yǎng)的植物種類、外植體類型及大小顯著影響著玻璃苗的發(fā)生。外植體越幼小,玻璃苗發(fā)生機(jī)率越大,這可能是外植體的較老組織中含有防止玻璃苗產(chǎn)生的物質(zhì),或者是較大外植體的分生組織遠(yuǎn)離培養(yǎng)基表面,而使其生長(zhǎng)環(huán)境的水分狀況得到改善。周菊花發(fā)現(xiàn)瑞香外植體取材部位顯著影響玻璃苗發(fā)生頻率,對(duì)枝條而言,取芽和莖基之間的中段莖作外植體易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象。2.1.3植物外源激素對(duì)植物碳源的影響許多研究表明,瓊脂的成分變化對(duì)玻璃苗的形成有重要影響。戴桂林等發(fā)現(xiàn),由于瓊脂中Ca、N、Mg、Mn、Fe、B、Zn等含量的差異,導(dǎo)致玻璃苗發(fā)生率明顯不同。瓊脂在固體組織培養(yǎng)中作為凝固劑,它的主要作用是使培養(yǎng)基在常溫下凝固,使用濃度常為0.6%~0.8%。一般認(rèn)為,瓊脂含量低容易導(dǎo)致玻璃化現(xiàn)象發(fā)生。糖在植物組織培養(yǎng)中作為碳源,為細(xì)胞提供合成新化合物的碳骨架,同時(shí)可以維持一定的滲透壓,與玻璃苗發(fā)生率呈顯著負(fù)相關(guān)。關(guān)于植物外源激素,普遍認(rèn)為較高的細(xì)胞分裂素易于誘發(fā)玻璃苗形成,而且BA+NAA比KT+TBA的激素組合更易誘發(fā)玻璃苗形成,且隨著濃度升高,玻璃化率升高。外源赤霉素和乙烯對(duì)玻璃化的發(fā)生沒(méi)有顯著影響。2.2玻璃苗的外植體培養(yǎng)措施隨著對(duì)玻璃化產(chǎn)生機(jī)理研究的深入,某些植物的玻璃化已得到了有效的控制。而且研究發(fā)現(xiàn),玻璃化現(xiàn)象只是一種表現(xiàn)特征,玻璃化的組織在一定條件下,可以恢復(fù)為正常苗。在控制玻璃苗發(fā)生時(shí),一般可采用如下措施:①選不易玻璃化的基因型及部位做外植體。②適當(dāng)提高光照強(qiáng)度,改善培養(yǎng)材料的通氣狀況;固體培養(yǎng)時(shí),增加瓊脂使用濃度,降低培養(yǎng)基中的水勢(shì),可以有效地降低玻璃苗的發(fā)生頻率。③培養(yǎng)基中增加K、P、Fe、Cu、Mn、zn元素的含量,降低B含量,增加硝態(tài)氮,降低銨態(tài)氮。④選擇適宜的糖源及外源激素種類和濃度,并注意生長(zhǎng)素與分裂素的配合,在未出現(xiàn)嚴(yán)重玻璃化之前,適當(dāng)降低激素特別是細(xì)胞分裂素類激素的用量,可以減少玻璃苗的出現(xiàn)。⑤添加有機(jī)物,如添加根皮苷,可有效地抑制玻璃苗形成。添加植物激素合成前體如ACC等,對(duì)防止蘆薈玻璃化有效。3.污染和預(yù)防3.1污染原因在組織培養(yǎng)中污染經(jīng)常發(fā)生,其原因也是多種多樣,可歸結(jié)為兩個(gè)方面:一是接種前和操作過(guò)程的污染;二是接種后的污染。3.1.1接種時(shí)各高、專場(chǎng)消毒接種前的污染一是接種室環(huán)境雜菌含量過(guò)高。二是接種時(shí)各器具滅菌時(shí)間短,操作沒(méi)有嚴(yán)格按照要求進(jìn)行。另外,接種人員自身消毒不嚴(yán)。此類污染可通過(guò)完善操作、培養(yǎng)環(huán)境,嚴(yán)格操作程序來(lái)克服。3.1.2外植體帶菌污染原因。據(jù)外部植接種后真菌大面積污染可能原因一是接種室的孢子過(guò)多或超凈臺(tái)的濾布不潔。二是外植體消毒處理不完全。對(duì)外植體帶菌引起的污染,情況比較復(fù)雜,與外植體的種類、取材季節(jié)、部位、預(yù)處理方法及消毒方法等密切相關(guān)。三是繼代、生根培養(yǎng)等階段培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)接操作比較粗糙,將微生物帶入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),引起新的污染。操作人員無(wú)菌意識(shí)不強(qiáng)、無(wú)菌操作技術(shù)不熟練也是一個(gè)重要因素。3.2防止污染的措施針對(duì)以上原因,對(duì)整個(gè)組織培養(yǎng)工作進(jìn)行改進(jìn),采取了如下一些措施。3.2.1紫外消毒處理經(jīng)常對(duì)接種室進(jìn)行空間消毒。用70%的酒精噴霧降塵消毒,用消毒水擦試地面、墻壁、工作臺(tái)等;用紫外線照射消毒;用甲醛加少量的高錳酸鉀熏蒸滅菌。(甲醛用量4~6ml/m3,高錳酸鉀3~6g/m3。)使用前打開(kāi)超凈工作臺(tái)紫外燈,照射20-60min;操作前10min使超凈工作臺(tái)處于工作狀態(tài),讓過(guò)濾空氣吹拂工作臺(tái)面和四周臺(tái)壁,然后關(guān)閉紫外燈,用70%的酒精擦拭工作臺(tái)面,以確保工作臺(tái)處于無(wú)菌狀態(tài)。3.2.2消毒保鮮技術(shù)外植體的選擇要以污染少易啟動(dòng)(易培養(yǎng))為原則。如植物胚不易被污染且具有幼嫩的分生組織細(xì)胞是常用的外植體。在用莖尖作外植體時(shí),可在室內(nèi)或無(wú)菌條件下對(duì)枝條進(jìn)行預(yù)培養(yǎng),如將枝條用水沖洗干凈后插入無(wú)糖的營(yíng)養(yǎng)液或自來(lái)水中,使其抽枝,然后以這種新抽的嫩枝條作為外植體,污染率可下降到20~30%。在選擇莖段進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí),可采用2次滅菌法,如將月季莖段用70%酒精浸泡30S。以0.1%升汞處理8min,無(wú)菌水沖洗5次后,再用2%的次氯酸鈉液消毒10min,在無(wú)菌水沖洗3~5次后接種,效果較好。所以要想取得理想的無(wú)菌材料,除精選材料外,要求操作人員嚴(yán)格按照無(wú)菌操作順序操作。對(duì)材料內(nèi)部帶菌的組織,在培養(yǎng)基中加入適量抗生素,以達(dá)最佳消毒效果。田永亮等在葡萄組織培養(yǎng)接種初期使