雙水相分配與超聲提取集成法提取分離連錢草總黃酮的工藝研究

連草是嘴唇科植物的活血丹。它具有潤(rùn)濕、解毒、散瘀、止血的作用。臨床上可用于治療熱淋、石淋、濕熱黃疸等疾病。在我國(guó),連錢草資源十分豐富。連錢草含有黃酮類、三萜類、揮發(fā)油以及無(wú)機(jī)鹽等化學(xué)成分。其中,黃酮類成分主要含有芹菜素、木犀草素等。目前,已有文獻(xiàn)報(bào)道采用超聲提取法、回流提取法和超聲循環(huán)法提取連錢草中黃酮類成分。其中,超聲提取是利用超聲波的“空穴作用”產(chǎn)生的沖擊波和射流破壞植物細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),使黃酮化合物的釋放和溶出過(guò)程溫度較低,可有效保持生物活性。雙水相分配技術(shù)是基于液-液萃取原理,同時(shí)保持生物活性所開(kāi)發(fā)的一種新型萃取分離技術(shù)。具有分離條件溫和、操作簡(jiǎn)單、可調(diào)節(jié)、易保持分離物生物活性、易與其他技術(shù)集成等特點(diǎn)。傳統(tǒng)的雙水相分配技術(shù)因使用黏度較大的聚合物,具有成本高、后續(xù)處理難等缺點(diǎn)。改良后,采用低級(jí)醇-鹽雙水相體系克服了上述缺點(diǎn),應(yīng)用領(lǐng)域十分廣闊。筆者將丙醇-硫酸銨雙水相分配技術(shù)與超聲提取技術(shù)集成,實(shí)現(xiàn)提取與分離一體化,研究連錢草總黃酮的提取與分離,為連錢草的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。1材料表面1.1儀器751-GW型分光光度計(jì)(上海分析儀器廠);CQ250型超聲波清洗儀(上海超聲波儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。1.2藥品、制劑連錢草(筆者采集)經(jīng)云浮市藥品檢驗(yàn)所鑒定為真品,粉碎,過(guò)80目篩;蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):008-9705);所用試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1丙醇及成相鹽用量對(duì)雙水相的影響低級(jí)醇-鹽雙水相體系參考文獻(xiàn),其中水溶性有機(jī)溶劑選擇丙醇,成相鹽選擇(NH4)2SO4,通過(guò)改變丙醇與水的比例及(NH4)2SO4的用量可以控制雙水相的形成。2.2總黃酮含量的測(cè)定準(zhǔn)確稱取連錢草粉末5.0g,置于250mL具塞錐形瓶中,加入一定量的丙醇和水,浸泡1h,再加入一定量的(NH4)2SO4成相,超聲提取一定時(shí)間,過(guò)濾,濾液于分液漏斗中靜置分層,上層以丙醇減壓濃縮,用60%乙醇定容至100mL,此溶液為總黃酮提取液,測(cè)定總黃酮含量,計(jì)算總黃酮得率。2.3黃酮的總含量2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸法參考文獻(xiàn)精密稱取120℃常壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品21.62mg,置于具塞錐形瓶中,加60%乙醇60mL,密塞,超聲使其溶解,放冷,加60%乙醇至刻度,搖勻,得蘆丁對(duì)照品溶液(0.2162mg·mL-1)。精密量取蘆丁對(duì)照溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分別置于25mL的容量瓶中,分別加水6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.0mL,加5%亞硝酸鈉溶液1mL,搖勻,放置6min,再加5%氫氧化鈉溶液10mL,加水至刻度,搖勻,以第一管作空白對(duì)照,在510nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以對(duì)照品濃度(Y)為縱坐標(biāo),吸光度(X)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為Y=0.0862X-0.0000489(r=0.9990)。結(jié)果表明,總黃酮在0~0.05mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。2.3.2樣品的重量測(cè)量2.4最佳工藝條件的確定2.4.1超聲時(shí)間、料液比對(duì)總黃酮提取率的影響分別考察超聲提取時(shí)間、丙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比及(NH4)2SO4濃度對(duì)總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明,不加超聲時(shí),總黃酮提取率很低,隨著超聲時(shí)間的增加總黃酮提取率升高,在20~30min內(nèi)增加較快,當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)40min后,提取率開(kāi)始降低;總黃酮提取率隨提取溶劑比例的增大而升高,在料液比為1∶10~1∶25時(shí),總黃酮提取率增加較快,當(dāng)料液比超過(guò)1∶30后,總黃酮提取率開(kāi)始降低,同時(shí)料液比的增加導(dǎo)致溶劑用量加大,即增加成本,又給后續(xù)處理帶來(lái)麻煩;總黃酮提取率隨丙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增高,在丙醇體積分?jǐn)?shù)為30%~50%時(shí),總黃酮提取率增加較快,大于60%后,提取率開(kāi)始降低;(NH4)2SO4濃度在15%~35%之間,總黃酮提取率隨著(NH4)2SO4濃度增加而增高,45%后開(kāi)始降低。2.5測(cè)試測(cè)試在正交試驗(yàn)選取的最佳工藝提取條件下,進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),總黃酮平均得率為5.04%。2.6提取方法比較準(zhǔn)確稱取藥材粗粉5.0g,采用有機(jī)溶劑回流提取法、超聲提取法與雙水相分離與超聲提取耦合集成進(jìn)行比較。其中回流提取法:取藥材粉末,第1次加12倍量60%乙醇回流40min,第2、3次分別加10倍量60%乙醇回流30min;超聲提取法,即藥材粗粉加120倍量的60%乙醇,超聲提取50min。提取結(jié)束時(shí)測(cè)定溶液溫度。分別回收溶劑,減壓干燥,得總黃酮提取物,稱量后稱取部分以乙醇溶解,用60%乙醇配制成待測(cè)溶液,計(jì)算提取物中總黃酮含量。不同提取方法比較結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,3種方法總黃酮提取率相近,在5.01%~5.09%之間(P>0.05),但本法提取時(shí)間30min,低于回流提取法100min和超聲提取法50min(P<0.01),表明效率高;本法提取溫度37.2℃,低于回流提取法78℃,表明條件溫和;本法提取物黃酮含量21.05%,高于回流提取法11.96%和超聲提取法12.01(P<0.01),表明粗提物純,產(chǎn)品質(zhì)量高。3超聲-丙醇-硫酸銨雙水相體系丙醇能與水無(wú)限混溶,但加入一定量的無(wú)機(jī)鹽可形成穩(wěn)定的雙水相體系,雙水相形成是硫酸銨與丙醇爭(zhēng)奪水分子的過(guò)程,隨著硫酸銨的用量增加,其對(duì)水分子的束縛能力增強(qiáng),丙醇從鹽水相中析出,而水分子也離開(kāi)丙醇相,結(jié)果,丙醇相對(duì)濃度增加,對(duì)黃酮的萃取能力增強(qiáng),黃酮的提取率提高。無(wú)機(jī)鹽用量與丙醇體積分?jǐn)?shù)有關(guān),丙醇體積分?jǐn)?shù)越大,所需無(wú)機(jī)鹽量越小。黃酮具有較好的醇溶性,在丙醇-硫酸銨雙水相體系分配于丙醇相,其它水溶性成分則分配于鹽水相中。在本法提取過(guò)程中,在超聲波的作用下,黃酮和其它水溶性物質(zhì)同時(shí)分別從植物細(xì)胞中進(jìn)入丙醇相和鹽水相,從而在提取同時(shí)實(shí)現(xiàn)黃酮與其它無(wú)效水溶性物質(zhì)的分離,提高了產(chǎn)物純度。同時(shí),由于黃酮向丙醇相的轉(zhuǎn)移,改變了提取過(guò)程中的化學(xué)平衡,有利于黃酮的溶出。本研究表明,雙水相分配與超聲提取集成化提取連錢草總黃酮和傳統(tǒng)方法相比,所得總黃酮得率相近,但所需時(shí)間短,提取效率高;所需溫度低,有利于熱敏物質(zhì)的提取分離;由于提取分離同時(shí)進(jìn)行,操作簡(jiǎn)便;所得粗提物純度高,有利于提取物后續(xù)加工處理?？傊?本法操作簡(jiǎn)便、條件溫和、效率高,具有很大優(yōu)勢(shì)。精密量取樣品提取液1.0mL,然后按“2.3.1”項(xiàng)下方法測(cè)定總黃酮含量,計(jì)算總黃酮提取率。由表2、表3可知,各因素對(duì)總黃酮得率影響程度依次為B>A>D>C,即丙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲時(shí)間>(NH4)2SO4濃度>料液比。丙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、(NH4)2SO4濃度對(duì)總黃酮得率都具有顯著的影響,最終確定的連錢草最佳提取條件為B1A1D2C1,即丙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,超聲時(shí)間為30min,