煙草赤星病菌株的分類鑒定與致病力測定

牧草赤星病是牧草生長后期的主要疾病之一。我國自60年代先后在河南、山東省較大流行以來,其后陸續(xù)在各煙區(qū)普遍發(fā)生,近年此病在廣東、云南等省均上升為煙草生產(chǎn)上頭等重要病害,損失嚴重。已有的研究對此病病原菌種的分類看法不一,但國內(nèi)多數(shù)學者趨向于鏈格孢菌(A.alternata)和長柄鏈格孢菌(A.longipes)。本研究旨在弄清云南煙草赤星病病原的種類和分布,主要生物學特性及致病力,篩選高效、低毒、低殘留的防治藥劑,為煙草赤星病的流行學和防治學提供科學依據(jù)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株篩選和培養(yǎng)在云南省玉溪、曲靖、楚雄和大理四個煙草生產(chǎn)區(qū)采集病斑典型,且僅此一種病害的病葉(莖),按常規(guī)方法分離培養(yǎng),共獲得80多個菌株,經(jīng)純化鏡檢和培養(yǎng)性狀測定,從每煙區(qū)各篩選出3個在形態(tài)和培養(yǎng)性狀上具代表性的菌株,其代號分別為玉溪的YX01B,YY26B,YY30B,曲靖的QJ3A,YJ03,YJ30A,楚雄的CX10,CX6,CX7,大理的YQ16A,X02A,X09C.用PDA(PH5.8～6.2)平板和斜面培養(yǎng)待用。1.1.2種子消毒液“株”以該省普遍種植的煙草品種紅花大金元為材料(由西南農(nóng)大農(nóng)學系提供),將已精選的種子用1%的硫酸銅溶液浸泡10分鐘,催芽、播種于盤內(nèi)消毒土中,2片真葉時轉(zhuǎn)移到盛消毒珍珠土的塑料缽中,每缽一株;5-6片真葉時移栽入盛消毒土的瓦缽中,每缽一株;常規(guī)管理待用。1.1.3供試農(nóng)藥及藥劑從30多種高效、低毒、低殘留、內(nèi)吸性、廣譜性、易降解的國內(nèi)外農(nóng)藥中初篩出以下三種藥劑供試:1.50%撲海因粉劑,重慶植保站提供。2.70%甲基托布津粉劑,省農(nóng)科院植保所提供。3.10%西奇愛乳劑,四川省農(nóng)科院植保所提供。1.2方法1.2.1測分生孢子鑒定將篩選的12個供測菌株在PDA平板上常規(guī)培養(yǎng),待充分產(chǎn)孢后,在光鏡下分別測量和觀察各菌株的分生孢子,咀孢和分生孢子梗大小、形狀、顏色、著生狀況和分隔情況,并按咀孢長度少于分生孢子長度1/3為鏈格孢菌和咀孢長度大于或等于分生孢子長度1/3為長柄鏈格孢菌的分類標準鑒定各菌株種類,顯微攝影。1.2.2升溫培養(yǎng)各菌株取5cm直徑菌塊轉(zhuǎn)移到PDA平板中心,分別在5℃,10℃,15℃,20℃,24℃,28℃,32℃和38℃,8個溫度梯度下恒溫培養(yǎng),三次重復。7天后,測菌落直徑和氣生菌絲高度,觀察菌落大小、形狀、顏色和底色等特點。1.3刺槐的培養(yǎng)當煙草長到8-9片真葉時,各菌株分別配制成濃度為5×104個孢子/ml的懸浮液,用針刺法接種到煙苗的下部三片葉上(葉中脈兩邊各刺3下,每個菌株3次重復,以滅菌水針刺為對照)。接菌后用薄膜將各煙草相互隔離,并保濕48小時,7天后按董漢松等分級標準調(diào)查發(fā)病情況計算發(fā)病率和病情指數(shù),確定各菌株致病力強弱和該煙草品種對各菌株的反應型,用柯赫氏證病律進行菌株驗證。1.4種藥劑的配制及對比藥劑的毒力程度用ED50表示,以采自云南、大理和曲靖地區(qū)的X09C和YJ30A分別代表鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌菌株進行研究,將上述三種藥劑配成不同濃度梯度(表2)的PDA培養(yǎng)基,接菌培養(yǎng)、觀察,各三次重復;用生長速率測定法和計算器機率值分析法測定各藥劑在不同濃度下對X09C和YJ30A的抑制率(菌落大小抑制百分率)。計算ED50求出回歸方程,并進行適合性檢驗。抑制率%=對照菌落直徑?處理菌落直徑對照菌落直徑×100%%=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑×100%2結(jié)果與分析2.1聯(lián)軸高斷序1/3對12個供試菌株鑒定結(jié)果:玉溪的YY26B,曲靖的YJ30A和楚雄的CX6為長柄鏈格孢菌。分生孢子尺度為7.4-40.8×7.4-21.2μm。倒棒錘形或橢圓形,褐色或黑褐色,單生或串生于分生孢子梗上,有縱橫分隔,縱隔0～3個,橫隔1～9個,有的稍彎曲,接近孢子梗的分生孢子較大。孢子鏈末端的孢子較小,橢圓形或豆形,只有一個橫分隔,咀孢較長,大于孢長度的1/3;多數(shù)幾乎與孢子等長,有時可達孢子長度的2倍,其尺度為3.0-5.66×3.4-6.2μm,褐色,具0-3個橫分隔,分生孢子梗線形,其尺度為4.9-123.0×3.4-5.4μm,褐色、叢生或散生,頂端彎曲,具有0～6個橫分隔。其余9個菌株均為鏈格孢菌,其分生孢子尺度為10.3-49.2×6.2-22.1μm,橢圓形,倒棒錘形或長圓筒形,褐色、黑褐色或墨綠色,單生或叢生,有縱橫分隔;縱隔0～3個,橫隔1～9個,有時稍彎曲,接近孢子梗的孢子較大。孢子鏈末端的孢子較小,橢圓形或豆形,只有一個橫分隔,咀孢有或無,褐色或黑綠色,長短不一,但通常不超過孢子長度的1/3,其尺度為0-24.6×2.5-8.6μm,常不分隔,只有部份具1～3個橫隔,分生孢子梗線形,尺度為2.5-123.0×2.5-6.4μm,褐色或墨綠色,叢生或散生,頂端彎曲,具0～6個橫隔。由上可知,云南省煙草赤星病的病原有鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌兩種,其中多數(shù)為鏈格孢菌,大理標樣均為鏈格孢菌,玉溪、曲靖和楚雄煙區(qū)兩者都有,以鏈格孢菌居多。2.2培養(yǎng)期及培養(yǎng)期對赤星病菌生長的影響從圖(1～6)可看出,鏈格孢菌和長柄鏈格孢菌的菌落相似,大多數(shù)為圓形,極少數(shù)為不規(guī)則形,有的具有與接菌點為中心的顏色不同的同心輪紋,有的中央隆起,隨溫度梯度升高和培養(yǎng)期延長,菌絲不斷增加,并老化和產(chǎn)孢,使菌落由白色、灰色漸至墨綠色或黑褐色,氣生菌絲也由白色漸至墨綠色,菌落底色基本上為墨綠和黑色,兩種赤星病菌生長的最低溫度為5℃,最適為24-28℃,最高為36℃,結(jié)果與近年國內(nèi)外對鏈格孢菌和長柄格鏈孢菌的研究報導一致(圖7)。2.3煙草金銀花大金由表1可知,鏈格孢菌的9個菌株平均發(fā)病率和病情指數(shù)分別為56.8%和19.89%,長柄鏈格孢菌的三個菌株平均發(fā)病率和病情指數(shù)分別為33.3%和8.3%,因此,鏈格孢菌的致病力強于長柄鏈格孢菌,但在鏈格孢菌中,致病強弱差異很大。CX7的病情指數(shù)只29.8,屬致病最弱的菌株,致病最強的是YY30B,次為YX01B(病情指數(shù)分別為38.9和33.3)X02A和X09C致病力也較強(病指數(shù)均為25.0)。表1還看出煙草紅花大金元對鏈格孢菌各菌株多表現(xiàn)為感病和耐病,對長柄鏈格孢菌為抗病或耐病。經(jīng)過柯赫氏證病律驗證,煙苗接病菌后,產(chǎn)生的癥狀較典型,鏈格孢菌與長柄鏈格孢菌的癥狀相似,接種葉片上出現(xiàn)直徑約0.5cm的褐色病班,病班具有同心輪紋,質(zhì)脆,易穿孔,病斑邊緣明顯,外圍有淡黃色暈環(huán),從病斑上分離培養(yǎng)的病原進行鏡檢,與接種前各菌株的分生孢子,咀孢和分生孢子梗的形態(tài)特征一致,證明接種前后的菌種相同。2.4求各加回歸方程通過生長速率測定法測得三種試驗藥劑各濃度下對煙草赤星病X09C和XJ30A的抑制率(見表2),經(jīng)機率值分析法計算其ED50,求出回歸方程(表3)。結(jié)果表明:三種藥劑中