微量稀釋法研究丁香酚的體外抑菌活性

目前，植物源性食品病蟲害具有天然且低毒，在國內外引起了廣泛關注。丁香在我國的使用已經有很長的歷史。其揮發(fā)油主要成分—丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚,engenol)具有較強的抑制細菌真菌作用,并且在100℃以內對熱穩(wěn)定,因而可用作食品防腐保鮮。食品中可能存在的污染菌種類較多,對環(huán)境的抵抗力也不相同,目前尚未見有關丁香酚對多種致病菌的MIC和MBC測定報道。本實驗測定了丁香酚對金色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、李氏特菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌等12種細菌的體外MIC、MBC及其抑菌特點。1材料和方法1.1材料和試劑1.1.1菌株和培養(yǎng)基金色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538、溶血性鏈球菌(Streptococcushaemol-yticus)NICPBP32210、單核增生李氏特菌(Listeriamonocytogenes)NICPBP54002、鼠傷寒桿菌(Salmonellatyphimurium)NICPBP50115、志賀痢疾桿菌(Shigellaedysenteriau)NICPBP51252、銅綠假單孢桿菌(Pseudomonasaeruginos)ATCC9027等購于廣州微生物研究所;大腸桿菌(E.coli)ATCC25922購于中國獸藥監(jiān)察所;都柏林沙門氏菌(Salmonelladublin)、豬霍亂沙門氏菌(Salmonellacholeraesuis)、豬鏈球菌(Streptococcussuis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)、大腸桿菌(E.coli)O54華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院藥理教研室。1.1.2南藥房公司的組丁香酚(含量98%,批號200306091)廣州中南藥業(yè)公司;MH肉湯(批號2004061621)、MH瓊脂(批號2004050331)、腦心浸湯(BHI)(批號2004062371)杭州天和微生物研究所。1.2方法1.2.1細菌激活從相應細菌的斜面培養(yǎng)基上挑起一環(huán)細菌,接種于相應肉湯中,標記,37℃,180r/min,培養(yǎng)12h,計數,備用。1.2.2丁香酚的乳化精確稱取丁香酚,先加入少量無水乙醇,再加入吐溫-20和水(吐溫和乙醇含量不超過0.5%),超聲乳化、定容、再次超聲乳化。1.2.3mic測量按微量稀釋法測定。1.2.4無藥mh和腦心浸湯法培養(yǎng)mh用多點接種器從已觀察MIC結果的微孔板上沾取培養(yǎng)液,接種于無藥MH瓊脂或腦心浸湯瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)24h(鏈球菌培養(yǎng)48h),觀察結果。以無細菌生長的最低濃度為細菌的MBC值。1.2.5丁香酚對大鼠傷害的細菌和福氏陽性細菌的時間-殺菌曲線的測定參照文獻方法。2結果與分析2.1mic和mic對菌株mic、bc的影響丁香酚對12種細菌均有較好的作用,其中對質控菌大腸桿菌ATCC25922的效果最好,MIC、MBC分別為5μg/ml和10μg/ml;對蠟狀芽孢桿菌的作用最弱,MIC、MBC分別為320μg/ml和640μg/ml;其次是銅綠假單孢桿菌,MIC和MBC為320μg/ml;而對多數菌的MIC則處在20~80μg/ml之間。具體結果如表1所示。2.2時間對抑菌作用的影響丁香酚濃度為0.5MIC時,對鼠傷寒桿菌和福氏志賀桿菌的抑制作用較弱;濃度為1MIC時細菌生長受到抑制,細菌的數量隨時間的延長出現先緩慢上升,再緩慢下降而降低,但在以上濃度時,抑菌作用并不隨時間的延長而增強;當濃度超過1MIC,則表現出殺菌作用;4MIC下在4h內將細菌全部殺滅,因此,丁香酚體外抑菌作用表現為較強的濃度依賴性和較低的時間依賴性,結果見表2、3。3丁香酚的抗菌特性3.1具有抗菌作用的植物藥在抗生素發(fā)現以前已有了很長的使用歷史,其中的香精油(有氣味揮發(fā)性的植物二級代謝產物)的抗微生物特性早在幾個世紀以前已為人們所認識,并被廣泛應用于民間醫(yī)藥、食品調味劑和保藏劑及香精工業(yè)。隨著人們對藥物在食品中殘留的危害有了更深的認識,從植物中尋找毒副作用小、安全、不易在食品中產生有毒殘留的天然保鮮劑,已成為新的研究熱點。丁香酚的資源豐富,生產成本低,并對多種微生物有較好的抑制作用,因此是一種潛在的、很有前途的食品添加劑。3.2丁香酚對金黃色葡萄球菌等12種細菌具有較好的抗菌作用,以對大腸桿菌ATCC25922(質控菌)的MIC(5μg/ml)來看,其作用強度與氯霉素(2~8μg/ml)、氨芐西林(2~8μg/ml)和頭孢噻吩(4~16μg/ml)相近;而比磺胺異噁唑(8~32μg/ml)好。結果比王浴生報道1∶2000~8000(約135~542μg/ml)要好;蠟狀芽孢桿菌可形成芽孢,丁香酚為有機酚類,其殺菌作用可能是作用于細菌細胞膜上的脂質和蛋白質,使之發(fā)生變性而發(fā)揮抗菌作用的。因此,丁香酚對芽孢的作用較弱,其MIC和MBC最高。3.3對福氏志賀桿菌和鼠傷寒桿菌殺菌活性的測定結果表明,高濃度的丁香酚具有較強的殺菌作用,呈現較強的濃度依賴性和較弱的時間依賴性,因此,應用丁香酚作為食品防腐保鮮劑使用時,應注意使