藥食兩用活性成分測定的藥用植物丁香精油及丁香酚抑菌活性研究

微生物廣泛分布于自然界。在生產(chǎn)、包裝、儲存和銷售過程中，一定類型和數(shù)量的微生物會受到污染。當(dāng)環(huán)境條件適宜時,它們就會迅速生長繁殖,造成食品的腐敗與變質(zhì)。由于微生物侵染引起的食品腐敗不僅降低了食品的營養(yǎng)和衛(wèi)生質(zhì)量,而且還可能危害人體健康,同時造成巨大的資源浪費和環(huán)境污染。在生產(chǎn)中一般要添加防腐劑來減少食品的腐敗變質(zhì),延長貨架期。目前使用最多的為化學(xué)防腐劑,如苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類、硝酸鹽及亞硝酸鹽、對羥基苯甲酸酯類等。長期的科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐證明,這些化學(xué)防腐劑大多具有潛在毒性和安全隱患。因此,天然無毒、高效安全的食品防腐劑的研究與開發(fā)成為各國食品生產(chǎn)者及科研工作者的研究熱點。丁香(Eugeniacaryophyllata)的干燥花蕾是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品和中草藥,其性辛溫,揮發(fā)油的主要成分為丁香酚(eugenol),具有較強的殺蟲、抑菌和防腐保鮮作用。丁香酚是歐盟、美國及中國都允許使用的食品添加劑,由于對其抑菌譜及使用濃度尚未明確,其在食品工業(yè)并未得到廣泛應(yīng)用。本文旨在通過研究丁香精油及丁香酚對食品中常見的腐敗菌的抑制活性及量效關(guān)系,為丁香精油和丁香酚作為天然食品保鮮劑的開發(fā)及食品活性包裝提供依據(jù)。1材料和方法1.1菌株來源mt突破沙門氏菌(Salmonellaanatum)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、綠膿假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigellasonnei)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)由佛山市疾控中心提供。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨,參照周德慶的方法配制。1.2丁香精油的提取丁香購自江西省樟樹市華豐藥業(yè)公司,產(chǎn)地為廣西。將材料于40℃烘干,粉碎,過40目篩,取200g粉末加入超臨界流體萃取釜中,萃取溫度為40℃、壓力15MPa、萃取時間2h。得到丁香精油42g。丁香酚購自Sigma公司。1.3儀器和檢測儀器FW100干樣粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)、SPX-250型生化培養(yǎng)箱(上海楚定分析儀器公司)、SFE超臨界流體萃取儀(廣州輕工研究所)、YXQ-LS-SⅡ全自動電熱高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、AUY220電子分析天平(日本島津)、UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津)、SpectraMax190酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)。1.4菌種濃度的確定采用比濁法制備各種菌懸液。以上菌種經(jīng)活化接種于試管斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)(37℃,24~36h),用無菌水稀釋,菌液的濃度控制在107~108cfu/mL,備用。1.5帶菌平板的制備結(jié)合杯碟法和雙層平板法測定提取液對供試菌生長的抑制作用。先倒底層平板,再吸取10mL制好的菌液,混入冷卻至45℃左右90mL培養(yǎng)基中,使最終菌液濃度為106~107cfu/mL,制備上層帶菌平板。凝固后在平板上對稱放置無菌牛津杯,向牛津杯中加入200μL丁香精油或丁香酚,進行3次平行實驗,重復(fù)2次。37℃培養(yǎng)24~36h,十字交叉法測量抑菌圈的大小。以0.2%的苯甲酸鈉為陽性對照(根據(jù)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB2760—2011)。1.6分離人源型及微生物活性用微量稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)。將精油及丁香酚過0.22μm微孔過濾器,并用Tween-80稀釋。吸取100μL含菌培養(yǎng)基加入至96孔板中,再加入100μL濃度為5~200mg/L丁香酚及丁香精油(梯度為5mg/L)。置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,觀察菌體的生長情況,細菌生長完全被抑制時所對應(yīng)最低藥物濃度試驗孔即為精油及丁香酚的MIC。繼續(xù)培養(yǎng)24h,觀察菌體的生長情況,無菌生長的最低樣品濃度即為MBC值。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。1.7抑制率及抑制中濃度計算毒力回歸方程的測定參照唐靜等的方法。根據(jù)抑制率,查幾率值表,可得抑制率幾率值(Y),將藥液濃度(mg/mL)換算成濃度對數(shù)(X),即可求出線性方程Y=aX+b,根據(jù)線性方程可求出抑制中濃度(IC50)。1.8數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用DPSv7.05對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,選擇Ducan新復(fù)極差法對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較。2結(jié)果與分析2.1苯甲酸鈉對從根芽孢桿菌抑菌圈直徑的影響從表1可以看出,丁香精油和丁香酚的抑菌譜廣,對所試的腐敗菌具有較強的抑制作用。除綠膿假單胞菌外,對其他菌的抑菌圈直徑均為20mm以上。與0.2%的苯甲酸鈉溶液相比,丁香精油及丁香酚對革蘭氏陽性菌的抑制效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性菌,特別是金黃色葡萄球菌及蠟樣芽胞桿菌,抑菌圈直徑超過30mm,顯著大于陽性對照苯甲酸鈉的抑菌圈直徑。丁香酚為丁香精油的主要成分,其對大腸桿菌、沙門氏菌及李斯特菌的抑制效果顯著大于丁香精油。2.2苯甲酸鈉與丁香精油的mic協(xié)同作用研究由表2可知,丁香精油對金黃色葡萄球菌的MIC最低,為20μg/mL;其次為蠟樣芽胞桿菌,MIC為25μg/mL;對綠膿假單胞菌的MIC最高,為130μg/mL。丁香酚對供試細菌的MIC與丁香精油的MIC有較好的相關(guān)性,通過線性分析,其相關(guān)系數(shù)為0.8661,說明丁香酚為丁香精油中的主要抑菌功效成分。對照苯甲酸鈉的MIC均在1200μg/mL以上,根據(jù)國標(biāo)2760—2011中規(guī)定,苯甲酸鈉在各類食品中的最大使用量為200~2000μg/g。由表3可以看出,非常低劑量的丁香精油和丁香酚即可完全抑制和殺死食品中的常見腐敗菌,特別是革蘭氏陽性菌。丁香精油和丁香酚具有芳香氣味,其添加到食品中有可能破壞食品的原有風(fēng)味,因此對其添加量要進行控制。通過試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),丁香精油和丁香酚對食品中常見腐敗菌的MIC和MBC均較低,作為防腐劑的使用劑量并不需要很大,因此對食品風(fēng)味的破壞可以減少到很低。2.3藥劑濃度對抑菌率的影響通過測定丁香精油及丁香酚對食品中常見腐敗菌的室內(nèi)毒力,獲得不同濃度處理對菌落生長抑制作用數(shù)據(jù),用DPS統(tǒng)計軟件進行回歸統(tǒng)計分析,得出以藥劑濃度對數(shù)值為X,抑菌率幾率值為Y的毒力回歸方程和IC50,其結(jié)果見表4。由表可知:丁香精油和丁香酚對金黃色葡萄球菌及蠟樣芽胞桿菌的毒力最強,丁香精油的IC50分別為4.3832μg/mL、5.0244μg/mL,丁香酚則分別為4.2845μg/mL、4.0466μg/mL。兩種物質(zhì)對綠膿假單胞菌的毒力最弱,IC50分別為26.5324μg/mL、25.6094μg/mL。3植物精油的抑菌效果隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展及人們消費觀念的變革,食品安全成為亟待解決的重要問題?；瘜W(xué)防腐劑如常用的亞硝酸鹽在人體內(nèi)可與仲胺類作用形成亞硝胺類,在體內(nèi)達到一定劑量時是致癌、致畸、致突變的物質(zhì),可嚴重危害人體健康。因此,生產(chǎn)者和科研工作者都致力于研究和開發(fā)新型的、安全的食品防腐劑。植物精油是存在于植物體中一類具有芳香氣味,在常溫下能揮發(fā),可隨水蒸氣蒸餾的油狀成分,主要含有酯、醛、酮、酚和萜烯類等物質(zhì)。許多植物精油被證實具有殺菌消炎、抗氧化的能力,是非常好的潛在食品防腐劑來源。丁香精油的對許多微生物都具有抑制作用,且發(fā)現(xiàn)其能延長西蘭花、黃花菜、草莓、葡萄、桃等果蔬的貯藏保鮮期。Go1i等研究發(fā)現(xiàn),丁香精油的氣相部分對E.coli、S.aureus、L.monocytogenes、E.faecalis具有抑制作用,當(dāng)與桂皮精油混合使用時,對E.coli的抑制存在拮抗作用,而對L.monocytogenes等細菌存在協(xié)同作用。Shan等研究發(fā)現(xiàn)S.aureus對酚類物質(zhì)最為敏感,而E.coli抗性最強。通過試驗,筆者發(fā)現(xiàn)丁香精油及精油中主要成分丁香酚對食品中常見的腐敗菌具有較強的抑制作用,金黃色葡萄球菌及蠟樣芽胞桿菌對其非常敏感。植物精油的抑菌作用早被發(fā)現(xiàn),但在食品工業(yè)中作為防腐劑應(yīng)用并不廣泛,限制其發(fā)展的重要原因是:精油含