香蕉枯萎病菌內(nèi)生菌的分離及拮抗活性篩選

香蕉萎縮，也稱為香蕉耿伊洛伊木馬萎縮，是由阻斷氨基酸（oxyspormf.c.）引起的。這是一種毀滅性的香蕉真菌病，屬于外部檢疫對(duì)象。該病害在許多國(guó)家地區(qū)均有發(fā)生,近幾年在我國(guó)危害尤為嚴(yán)重。目前尚未有理想的抗病品種及有效的化學(xué)防治方法。生物防治因其既能防治病蟲(chóng)害,又能保護(hù)生態(tài)平衡,成為人們研究的熱點(diǎn)。利用根際微生物及體表微生物防治該病菌已有一些報(bào)道,但這些生防菌易受周圍環(huán)境條件的影響,不易在病原物存在的環(huán)境中穩(wěn)定繁殖,從而嚴(yán)重影響其防效。作為生物防治重要微生物資源之一的內(nèi)生菌,它具備受外界環(huán)境影響小,易于在宿主上定殖,產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)新穎等特點(diǎn),因此利用拮抗性內(nèi)生菌來(lái)進(jìn)行生物防治具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。曹理想等首次報(bào)道了粉蕉內(nèi)生放線菌玫瑰淺灰鏈霉菌株對(duì)香蕉枯萎病菌有明顯的拮抗作用;殷曉敏等從生長(zhǎng)正常的香蕉假莖內(nèi)分離獲得1株枯草芽孢桿菌,能明顯抑制香蕉枯萎病菌菌絲生長(zhǎng),培養(yǎng)液濾液對(duì)孢子萌發(fā)具有良好抑制效果。可見(jiàn)分離篩選拮抗內(nèi)生菌株防治該病害切實(shí)可行。但香蕉枯萎病拮抗內(nèi)生菌的分離篩選研究主要集中于從香蕉植株中獲得,另外關(guān)于內(nèi)生菌防治香蕉枯萎病的盆栽試驗(yàn)報(bào)道較少。海南省自然資源豐富,熱帶植物種類繁多,變?nèi)~木、益智、陰香、檳榔、椰子和菠蘿蜜6種常見(jiàn)熱帶植物,取材方便。這些植物在熱帶地區(qū)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期演化,形成自身獨(dú)特的微生物區(qū)系,在熱帶地區(qū)具有廣泛的適應(yīng)性。為獲得對(duì)香蕉枯萎病具有高拮抗活性的內(nèi)生菌,本文從變?nèi)~木、益智、陰香、檳榔、椰子和菠蘿蜜6種植物中分離、篩選內(nèi)生拮抗菌株,并對(duì)拮抗效果理想的菌株進(jìn)行盆栽防效試驗(yàn),以期獲得具有潛在應(yīng)用價(jià)值的生防菌,為豐富香蕉枯萎病生防資源庫(kù)奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1南藥實(shí)行來(lái)源益智(AlpiniaoxyphyllaMiq.)、陰香(Cinnamomumburmannii)、檳榔(Arecacatechu):采集于海南熱帶植物園南藥圃;椰子(CocosnuciferaL)、變?nèi)~木(Codiaeumvariegatum)、菠蘿(Artocarpusheterophyllus):采集于海南大學(xué)儋州校區(qū)。香蕉(MusaABB)組培苗,由海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院提供。1.1.2ysporumsp.c設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cubense)4號(hào)生理小種。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號(hào)培養(yǎng)基。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1組織消毒和內(nèi)生放線菌分離將采集的新鮮健康供試植株根、莖、葉用自來(lái)水沖洗干凈,室內(nèi)晾干后,用75%酒精浸泡3～8min(根、莖8min,葉3min),無(wú)菌水沖洗3～4次,再用0.1%升汞浸泡2～3min,無(wú)菌水沖洗5次。無(wú)菌條件下將上述處理的各組織在培養(yǎng)基上作印跡,同時(shí)將表面消毒最后一次的無(wú)菌水涂抹于供試培養(yǎng)基上,做對(duì)照處理,檢測(cè)植物表面消毒是否徹底。采用組織塊法進(jìn)行內(nèi)生真菌分離,研磨法進(jìn)行內(nèi)生放線菌及細(xì)菌分離。分離平板適溫培養(yǎng)2～7d。1.2.2內(nèi)生菌的純化在空白對(duì)照組沒(méi)有任何菌株生長(zhǎng)的情況下,對(duì)分離出的內(nèi)生菌進(jìn)行純化。內(nèi)生真菌采用菌絲頂端逐步純化法進(jìn)行純化,內(nèi)生放線菌、細(xì)菌采用多次劃線法進(jìn)行純化,純化得到的菌株斜面保存,備用。1.2.3抗菌活性篩選將香蕉枯萎病病原菌及分離出的內(nèi)生菌擴(kuò)大培養(yǎng),備用。采用對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)分得的內(nèi)生真菌進(jìn)行拮抗活性篩選:利用5mm的打孔器打取純化好的內(nèi)生真菌菌餅,接種于PDA平板中央,兩邊2cm處對(duì)峙接種同樣大小的靶標(biāo)菌菌餅,以中間不接內(nèi)生菌為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)3次,在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d,用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑,按下面公式統(tǒng)計(jì)抑菌率:菌落直徑(mm)=測(cè)量菌落直徑平均值-5.0采用對(duì)峙劃線法對(duì)分得的內(nèi)生放線菌、細(xì)菌進(jìn)行拮抗活性篩選:用直徑為5mm的打孔器打取靶標(biāo)菌菌餅,接種于PDA培養(yǎng)基中央,在距離菌餅2cm處劃線接種內(nèi)生細(xì)菌。以不接內(nèi)生放線菌、細(xì)菌為對(duì)照,每個(gè)處理3次重復(fù),在25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～3d,測(cè)量抑菌帶大小。1.2.4內(nèi)生菌培養(yǎng)和病料處理按要求配置菌株發(fā)酵液及查氏培養(yǎng)液,分別接入內(nèi)生菌及靶標(biāo)菌,適溫180r/min振蕩培養(yǎng)3～5d,備用。從海南大學(xué)儋州校區(qū)周邊非香蕉種植地采集土壤,過(guò)20目篩,160℃滅菌2h,備用。取四葉期的香蕉組培苗,用清水將其根部沖洗干凈,定植于已滅菌的土壤中,在28℃、20001x光照、12h光照/12h黑暗的下培養(yǎng)。10d后灌根法接入50mL濃度為109cfu/mL內(nèi)生菌培養(yǎng)液,以無(wú)菌水為對(duì)照,每處理20次重復(fù),在28℃、20001x光照、12h光照/12h黑暗的下培養(yǎng)。施加內(nèi)生菌4d后,以傷根法接入20mL濃度為107cfu/mL靶標(biāo)菌培養(yǎng)液,于接種第14d第1次調(diào)查各處理的病情指數(shù)和防治效果,以后每隔8d調(diào)查1次,共調(diào)查3次。香蕉枯萎病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照何欣等進(jìn)行修改:0級(jí):健株;1級(jí):植株下部葉片出現(xiàn)枯萎;2級(jí):20%以下的葉片枯萎;3級(jí):有20%～40%葉片枯萎;4級(jí):有40%～60%葉片枯萎;5級(jí):有60%～80%葉片枯萎;6級(jí):整個(gè)植株枯萎,死亡。2.1植物內(nèi)生菌的種類和組織通過(guò)常規(guī)組織表面消毒法對(duì)供試植株:變?nèi)~木、益智、陰香、檳榔、椰子和菠蘿蜜的根、莖、葉進(jìn)行內(nèi)生菌分離,結(jié)果見(jiàn)表1由表1可知:從供試的6種植物中共分得內(nèi)生菌91株,其中從變?nèi)~木植物組織中獲得菌株最多,分得40株,從檳榔、椰子中獲得菌株較少,只有8株。6種植物獲得菌株數(shù)量順序?yàn)?變?nèi)~木>益智>陰香>菠蘿蜜>檳榔=椰子;從獲得菌株種類來(lái)看,分得細(xì)菌最多,占分離總數(shù)的49.5%,其次為真菌、放線菌最少,僅占分離總數(shù)的8.8%;由表1還可以看出,同一種植物的不同組織中內(nèi)生菌的數(shù)量不同,如變?nèi)~木40株內(nèi)生菌中有22株分自根部,而葉部只有7株;益智14株內(nèi)生菌株中有8株分自葉部,分自莖部的只有1株,總體來(lái)講,所分植物根部獲得菌株較多,莖部次之,葉部較少;另外不同植物相同組織內(nèi)生菌數(shù)量也不同,如變?nèi)~木莖部分離獲得11株內(nèi)生菌株,而益智莖部只分離獲得1株內(nèi)生菌株。2.2內(nèi)生真菌的抑菌率采用皿內(nèi)對(duì)峙劃線法對(duì)獲得的38株真菌進(jìn)行皿內(nèi)拮抗活性測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有4株內(nèi)生真菌對(duì)香蕉枯萎病病原菌具有拮抗作用,其余34株菌均沒(méi)有拮抗活性,有拮抗活性菌株抑菌率見(jiàn)表2。由表2可知分自變?nèi)~木莖部BYJ1-2皿內(nèi)拮抗效果相對(duì)較好,抑制率為30.75%,其余3株菌抑菌效果不理想,抑菌率均低于20%。2.3菌株抑菌效果將分離得到的內(nèi)生放線菌、細(xì)菌與靶標(biāo)菌經(jīng)對(duì)峙劃線培養(yǎng)3～4d后,發(fā)現(xiàn)放線菌對(duì)香蕉枯萎病病原菌沒(méi)有明顯的拮抗效果;有10株分自變?nèi)~木及陰香的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)供試靶標(biāo)菌有拮抗效果,4株抑菌效果較為明顯,相應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出,分自陰香根部的YXG2-3的抑菌效果最明顯,抑菌帶約在20mm左右(見(jiàn)圖1),其次BYG2-5、BYJ5-1、YXJ2-2也有很好的抑菌效果,抑菌帶均在15mm以上,其余6株內(nèi)生細(xì)菌抑菌帶不明顯,均小于5mm。2.4yxg2-3菌株的培養(yǎng)效果按照香蕉枯萎病發(fā)病規(guī)律,分別在接種香蕉枯萎病的第14d、22d、30d進(jìn)行香蕉枯萎病的病情指數(shù)和防治效果調(diào)查,結(jié)果如表4由表4可知:對(duì)供試香蕉苗接種病原菌后,從14d開(kāi)始發(fā)病,至30d達(dá)發(fā)病盛期。供試菌株均有一定的防治效果,其中YXG2-3效果最理想,防效為63.8%,達(dá)極顯著水平;其余3株供試內(nèi)生菌防效均低于30%,其中菌株BYJ5-1防效最不理想,防效僅為9.3%。另外由表4還可以看出,YXJ2-2接種14d時(shí)同YXG2-3效果相同,植株均沒(méi)有發(fā)病,但隨著接種時(shí)間延長(zhǎng),菌株防治效果明顯下降,說(shuō)明該菌株防治效果不穩(wěn)定,可能與該菌株在土壤中適應(yīng)能力有關(guān)。3內(nèi)生細(xì)菌抑菌和抗菌劑的篩選結(jié)果本實(shí)驗(yàn)利用常規(guī)組織表面消毒法對(duì)變?nèi)~木、益智、陰香、檳榔、椰子及菠蘿蜜6種植物的根、莖、葉進(jìn)行了內(nèi)生菌分離,并對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行了皿內(nèi)拮抗活性測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn):不同植物種類獲得內(nèi)生菌的數(shù)量有很大的差異,同一種植物不同部位菌株種類及數(shù)量分布也各不相同,其原因一方面可能是因?yàn)椴煌参镂锓N間以及同一植物不同部位內(nèi)生菌分布本身存在差異,另一方面與實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中組織消毒的時(shí)間也存在必然的聯(lián)系,如有的植物組織因?yàn)楸砥ぽ^薄,消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能會(huì)導(dǎo)致分離得到的菌株數(shù)量減少。另外有些內(nèi)生菌不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng),有些內(nèi)生菌則因?yàn)樯L(zhǎng)緩慢而被生長(zhǎng)相對(duì)較快的菌株所掩蓋,也是其中重要原因。皿內(nèi)拮抗作用篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn),分得內(nèi)生真菌抑菌效果均不夠理想,內(nèi)生細(xì)菌抑菌效果較好,尤其菌株YXG2-3抑菌帶達(dá)20mm左右。在盆栽實(shí)驗(yàn)中該菌株防效為63.8%,與其他處理相比達(dá)極顯著水平。分析獲得菌株多數(shù)抑菌效果不理想原因可能是因