一、培養(yǎng)基1、概念人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)。2、培養(yǎng)基的類型①液體培養(yǎng)基②固體培養(yǎng)基注：（固體培養(yǎng)基需添加凝固劑，如瓊脂；液體培養(yǎng)基不加凝固劑。）（工業(yè)生產(chǎn)）（微生物保存、分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)）課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)思考：微生物“吃”什么？3、培養(yǎng)基的一般成分：水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的培養(yǎng)基其他條件：A.生長(zhǎng)因子：乳酸桿菌加維生素

B.pH值:霉菌需酸性、培養(yǎng)細(xì)菌需中性或微堿性

C.氧氣：厭氧微生物無(wú)氧條件（識(shí)記：乳液是維一安全的，也可喝點(diǎn)酸霉子湯）二、無(wú)菌技術(shù)：（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；（2）將培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；（3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。防止外來(lái)雜菌的入侵。1、消毒與滅菌（1）消毒①概念：使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。有些細(xì)菌在一定的條件下，細(xì)胞里面形成一個(gè)橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對(duì)干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力。在生物體的一定部位產(chǎn)生一種特殊的生殖細(xì)胞叫孢子。孢子的特點(diǎn)是能直接長(zhǎng)成新個(gè)體。②常用方法:a、煮沸消毒法100℃煮沸5-6min，用于一般物品的消毒。b、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min，對(duì)一些不耐高溫的液體，如牛奶的消毒。c、化學(xué)藥劑消毒酒精、氯氣、石炭酸、煤酚皂溶液等，如酒精擦拭雙手、氯氣消毒水源等。d、紫外線消毒對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒。只適用于物體表面滅菌和空氣滅菌。（2）滅菌使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽孢和孢子。常用方法:a、灼燒滅菌用于金屬用具（接種環(huán)、接種針）、或接種過(guò)程中試管口和瓶口的滅菌；b、干熱滅菌160～170℃，1～2h。能耐高溫的需要保持干燥的物品，用于玻璃器皿、金屬用具的滅菌，所用設(shè)備是干熱滅菌箱

；c、高壓蒸汽滅菌121℃，100kPa，15-30分鐘。用于培養(yǎng)基、無(wú)菌水等的滅菌，所用設(shè)備是高壓蒸汽滅菌鍋。1.計(jì)算：

2.稱量：3.溶化：注：牛肉膏、蛋白胨易吸潮，稱取時(shí)動(dòng)作要快迅速、加蓋。牛肉膏、稱量紙、少量水加入燒杯→加熱溶解→取紙→蛋白胨、NaCl→攪拌溶解→→瓊脂→攪拌熔化→調(diào)pH并補(bǔ)水至100mL牛肉膏黏稠，保證粘附在稱量紙上的牛肉膏也溶于水中，減少誤差作為凝固劑防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂依配方計(jì)算100mL培養(yǎng)基所需各成分的用量玻棒挑取牛肉膏于稱量紙上稱取。三、實(shí)驗(yàn)操作(以培養(yǎng)大腸桿菌為例)（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：最常用的細(xì)菌培養(yǎng)基4、滅菌①培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌②培養(yǎng)皿：干熱滅菌思考1.在滅菌前,用牛皮紙、舊報(bào)紙包緊盛有培養(yǎng)基的錐形瓶的目的是什么？滅菌時(shí)能避免水蒸汽凝結(jié)時(shí)浸濕棉塞；取出培養(yǎng)基錐形瓶時(shí)也能起到隔絕空氣中雜菌污染的作用。2.培養(yǎng)皿能否用高壓蒸汽滅菌？不能,因?yàn)榕囵B(yǎng)皿要保持干燥,應(yīng)該用干熱滅菌。3.在培養(yǎng)微生物時(shí)，由于不同微生物適應(yīng)的PH不同，因此在熔化后必須調(diào)節(jié)PH，那么是先調(diào)PH還是先滅菌?先調(diào)PH，后滅菌。

培養(yǎng)基裝入錐形瓶，加棉塞，包牛皮紙?jiān)o，高壓蒸汽滅菌；培養(yǎng)皿5～8套作一包，放于干熱滅菌箱內(nèi)滅菌。5.倒平板：培養(yǎng)基冷卻至約50℃左右時(shí)6.無(wú)菌檢查：

防止污染和揮發(fā)滅菌時(shí)避免水蒸氣浸濕棉塞，取出培養(yǎng)基時(shí)，也起到隔絕空氣中雜菌的作用4.滅菌：

37℃倒置培養(yǎng)24～48h，觀察是否有微生物生長(zhǎng)。用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時(shí)即可開(kāi)始倒平板。灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。思考1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50℃時(shí)倒平板。用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？既可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染,又可以避免培養(yǎng)基中的水分過(guò)快地?fù)]發(fā)?？諝庵械奈⑸锟赡茉诿笊w與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？微生物接種方法常見(jiàn)的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。（1）平板劃線法

通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體稱菌落。（二）純化大腸桿菌1.將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直到接種環(huán)_______2.在_____旁冷卻接種環(huán)，并打開(kāi)盛有菌液的試管的棉塞3.將試管口通過(guò)火焰4.將已______的接種環(huán)伸入菌液中沾取一環(huán)菌液6.左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃__________條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。5.將試管口通過(guò)火焰，并塞上棉塞火焰冷卻三至五7.灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的_______開(kāi)始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。末端燒紅8.將平板_____放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

倒置微生物的恒溫培養(yǎng)將培養(yǎng)皿______（蓋在下），放于_____℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)__________小時(shí)。１２～２４倒置３７平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長(zhǎng)情況1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作結(jié)束后灼燒：殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境及感染操作者。思考第一步灼燒：消滅接種環(huán)上的微生物避免污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒：為了殺死上一次劃線結(jié)束后接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖的菌落。2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。(2)稀釋涂布平板法：將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋后，分別涂布到固體培養(yǎng)基表面。稀釋度足夠高時(shí)，能培養(yǎng)出單個(gè)菌落。稀釋涂布平板法操作過(guò)程分兩個(gè)步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。涂布器系列稀釋操作101102103104105106注意：1.移液管需要經(jīng)過(guò)滅菌2.操作時(shí)，試管口和移液管應(yīng)在離火焰1~2CM處將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中

取少量菌液（不要超過(guò)0.1ml）滴加到培養(yǎng)基表面

灼燒

待酒精燃盡后冷卻8～10s

涂布將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液涂布均勻涂布平板：稀釋涂布平板法的要點(diǎn)1、用移液管吸取菌液之前先搖勻3、所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行2、涂布器從酒精中取出后，要在火焰上將其上的酒精燒掉思考

將接種后和未接種（作為對(duì)照組）的培養(yǎng)基均放到370C的恒溫箱中，培養(yǎng)12～24h后進(jìn)行觀察并記錄結(jié)果。涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作？答：應(yīng)從操作的各個(gè)環(huán)節(jié)保證“無(wú)菌”。1.酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適；2.吸管頭不要接觸任何其他物體；3.要在火焰周圍迅速操作。未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)？如果有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明了什么？2、在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨(dú)立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、菌落的不斷生長(zhǎng)，使菌落不斷增大。無(wú)菌操作未達(dá)到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是接種時(shí)發(fā)生了污染；也可能是在培養(yǎng)的過(guò)程中受到了污染。3、培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同嗎？如果不同，請(qǐng)分析產(chǎn)生差異的原因？4、如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請(qǐng)分析其可能的原因。將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基，放入4℃冰箱中保存。以后每3~6個(gè)月，要將菌種轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基。四、課題延伸3ml甘油瓶中裝入1ml甘油后滅菌，再加入1ml菌液，混勻后放入-20℃冷凍箱保存。1.對(duì)于頻繁使用的菌種2.對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的菌種臨時(shí)保藏：甘油管藏：例2：下列有關(guān)細(xì)菌培養(yǎng)的敘述，正確的是（）A．在瓊脂固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單個(gè)菌落含有多種細(xì)菌B．在培養(yǎng)基中加入青霉素可抑制真菌而促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)C．向液體培養(yǎng)基中通人氧氣能促進(jìn)破傷風(fēng)桿菌的生長(zhǎng)D．在半固體培養(yǎng)基中接種細(xì)菌培養(yǎng)后可以觀察其運(yùn)動(dòng)D例3：某小組同學(xué)為了調(diào)查湖水中細(xì)菌的污染情況而進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)包括制備培養(yǎng)基、滅菌、接種及培養(yǎng)、菌落觀察計(jì)數(shù)。請(qǐng)回答與此實(shí)驗(yàn)相關(guān)的問(wèn)題。

(1)培養(yǎng)基中含有蛋白胨、淀粉分別為細(xì)菌培養(yǎng)提供了___________和__________。除此之外，培養(yǎng)基還必須含有的基本成分是__________和_____________。

(2)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌，應(yīng)該采用的方法是_______________。

(3)為了盡快觀察到細(xì)菌培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)將接種了湖水樣品的平板置于__________中培養(yǎng)，培養(yǎng)的溫度設(shè)定在37℃。要使該實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果可靠，還應(yīng)該同時(shí)在另一平板上接種_________作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。氮源碳源

無(wú)機(jī)鹽水高壓蒸汽滅菌恒溫培養(yǎng)箱無(wú)菌水(4)培養(yǎng)20小時(shí)后，觀察到平板上有形態(tài)和顏色不同的菌落，這說(shuō)明湖水樣品中有___________種細(xì)菌。一般說(shuō)來(lái)，菌落總數(shù)越多，湖水遭受細(xì)菌污染的程度越_____________。

(5)如果提高培養(yǎng)基中NaCl的濃度，可以用于篩選耐____________細(xì)菌，這種培養(yǎng)基被稱為_(kāi)_________。多高鹽(或NaCl)

選擇培養(yǎng)基例4：氯苯化合物是重要的有機(jī)化工原料，因其不易降解，會(huì)污染環(huán)境。某研究小組依照下列實(shí)驗(yàn)方案(如圖1)篩選出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培養(yǎng)基配方如下表。(1)配制Ⅱ號(hào)固體培養(yǎng)基時(shí)，除添加Ⅱ號(hào)液體培養(yǎng)基成分外，還應(yīng)添加______。

(2)培養(yǎng)基配制時(shí)，滅菌與調(diào)pH的先后順序是_______________。瓊脂先調(diào)pH、后滅菌(3)從用途上來(lái)說(shuō)，Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基和Ⅱ