hvKP感染患者的臨床特征及分子情況差異回顧性分析[摘要]目的：調(diào)查高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentvariantofK.pneumoniae，hvKP）和經(jīng)典肺炎克雷伯氏菌（classicKlebsiellapneumoniae，cKP）感染之間的臨床特征及分子情況差異。方法：對(duì)2015年6月至2018年10月在本院接受肺炎克雷伯氏菌血流感染治療的35位患者進(jìn)行回顧性隊(duì)列研究。對(duì)分離的肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行黏液絲實(shí)驗(yàn)以篩查hvKP。采用Mueller-Hinton瓊脂上的KirbyBauer紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抗菌敏感性試驗(yàn)，并利用PCR方法對(duì)hvKP和cKP菌株的分子特性進(jìn)行了研究。結(jié)果：在分析的35株肺炎分離株中，有11株（31.4%）為hvKP，表現(xiàn)為4種血清型（K1、K2、K20和K57）；與cKP感染的患者相比，hvKP感染的患者往往沒(méi)有潛在的疾病。hvKP感染患者中社區(qū)獲得性感染（11/11，100%）人數(shù)顯著多于cKP感染（8/24，33.3%）（P<0.05）；cKP感染患者對(duì)抗菌藥物的耐藥性明顯高于hvKP感染患者；研究發(fā)現(xiàn)了1株產(chǎn)生ESBL的hvKP菌株；對(duì)于莢膜血清型，兩組之間在K1、K2和其他血清型中存在顯著差異（P<0.05）；pLVPK相關(guān)位點(diǎn)和毒力基因rmpA、iroN在兩組之間存在顯著差異（P<0.05）。結(jié)論：hvKP菌株很可能在臨床環(huán)境中引起嚴(yán)重感染，并且已發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)生ESBL的hvKP，因而迫切需要提高臨床意識(shí)和hvKP感染管理。[關(guān)鍵詞]肺炎克雷伯菌；高毒力；臨床特征；分子特征；廣譜β-內(nèi)酰胺酶Doi：RetrospectiveanalysisofclinicalfeaturesandmoleculardifferencesinpatientswithhvKPinfectionAbstractObjective:Toinvestigatetheclinicalcharacteristicsandmoleculardifferencesbetweenblood-derivedhypervirulentvariantofhvKPandcKP.Method:WeconductedaretrospectivecohortstudyofpatientstreatedinthehospitalforK.pneumoniaebloodstreaminfectionsbetweenJune2015toOctober2018.ThestringtestwasperformedtoscreenhvKPfromKlebsiellapneumoniae.AntimicrobialsusceptibilitytestingforisolatedK.pneumoniawascarriedoutbymeansofaKirbyBauerdiskdiffusiontestonMueller-Hintonagar,andthemolecularcharacteristicsofhvKPandcKPstrainswerestudiedbyPCR.Result:Ofthe35strainsofpneumoniaanalyzed,11(31.4%)werehvKP,,whichdisplayed4serotypes(K1,K2,K20,andK57).PatientswithhvKPinfectiontendedtohavenounderlyingdiseasescomparedtothosewithcKP.MorehvKP-positivepatients(11/11,100%)hadcommunity-acquiredinfectionthandidcKP-infectedpatients(8/24,33.3%)(P<0.05).ResistancetotestedantimicrobialswassignificantlygreaterincKP-thaninhvKP-infectedpatients.OneESBL-producinghvKPstrainswasfound.Forthecapsularserotypes,significantdifferenceswerefoundinK1,K2andnon-typeableserotypesbetweenthetwogroups(P<0.05).ThepLVPK-relatedloci,repA,andiroNdifferedsignificantlybetweenthetwogroups(P<0.05).Conclusion:ThehvKPstrainislikelytocauseseriousinfectionintheclinicalenvironment,andonestrainofESBL-producinghvKPhasbeenfound,andthusthereisanurgentneedtoimproveclinicalawarenessandhvKPinfectionmanagement.Keywordsklebsiellapneumoniae;hypervirulence;clinicalcharacteristics;molecularcharacteristics;broad-spectrumβ-lactamase典型的肺炎克雷伯氏菌（classicKlebsiellapneumoniae，cKP）是引起醫(yī)院獲得性感染的主要病原體之一，尤其是在免疫功能低下的患者中，它是革蘭氏陰性菌血癥的第二常見原因[1]。20年前在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)了一種新的肺炎克雷伯氏菌（hypervirulentvariantofK.pneumoniae，hvKP）的高致病性變種，自那以后其在亞洲被頻繁報(bào)道[2-3]。這種新變體與經(jīng)典菌株的不同之處在于其在瓊脂平板上生長(zhǎng)菌落的外觀是高粘膜粘液。因此，它也被稱為高粘液性肺炎克雷伯氏菌。與cKP株相比，hvKP不僅能夠在免疫功能低下的患者中引起醫(yī)院感染，更重要的是，它能夠在健康個(gè)體中出現(xiàn)危及生命的社區(qū)獲得性感染[4]。此外，hvKP還具有從感染的原發(fā)部位擴(kuò)散到身體其他部位的能力，這是非免疫受損宿主中腸道革蘭氏陰性桿菌的一個(gè)不尋常特征[5]。最近，來(lái)自歐洲、美國(guó)和澳大利亞的hvKP感染報(bào)告越來(lái)越多[4,6]。盡管此類病例已在世界范圍內(nèi)被廣泛描述，但在亞洲，尤其是我國(guó)關(guān)于hvKP臨床特征的報(bào)道很少。在本報(bào)告中，我們調(diào)查了11名hvKP感染患者的臨床特征和分子特征。

1資料與方法1.1病例資料對(duì)2015年6月至2018年10月在本院接受肺炎克雷伯氏菌血流感染治療的患者進(jìn)行回顧性隊(duì)列研究。根據(jù)臨床微生物學(xué)部門的記錄對(duì)患者進(jìn)行鑒定?；颊邤?shù)據(jù)來(lái)自醫(yī)療記錄，包括人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征、臨床特征、住院時(shí)間、抗菌治療用藥、機(jī)械通氣和使用侵入性設(shè)備。對(duì)每個(gè)病例進(jìn)行醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染之間的區(qū)分。社區(qū)獲得性血流感染定義為入院后48小時(shí)內(nèi)采集的血培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)肺炎克桿菌。相反，醫(yī)院獲得性血流感染定義為住院患者入院48小時(shí)后出現(xiàn)菌血癥，包括與醫(yī)療器械相關(guān)的感染。1.2細(xì)菌菌株對(duì)35例確診為肺炎克雷伯氏菌血流感染患者的分離株進(jìn)行分析，采用常規(guī)微生物學(xué)方法鑒定肺炎克雷伯氏菌，并通過(guò)16SrRNA測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)。對(duì)所有分離物進(jìn)行“黏液絲實(shí)驗(yàn)”測(cè)試。當(dāng)細(xì)菌學(xué)接種環(huán)能夠通過(guò)在瓊脂板上拉伸菌落而產(chǎn)生長(zhǎng)度大于5mm的黏液絲時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性[5]。肺炎克雷伯菌經(jīng)陽(yáng)性黏液絲實(shí)驗(yàn)鑒定為hvKP。1.3抗菌藥敏感性試驗(yàn)通過(guò)Mueller-Hinton瓊脂上的KirbyBauer紙片擴(kuò)散對(duì)分離的肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行抗菌敏感性試驗(yàn)（共23種抗菌劑），具體操作和結(jié)果解釋參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）建立的指南進(jìn)行。所有肺炎克雷伯菌的分離株都經(jīng)過(guò)篩選，并通過(guò)雙紙片協(xié)同試驗(yàn)確認(rèn)了是否產(chǎn)生廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）。本實(shí)驗(yàn)選擇肺炎克氏菌ATCC700603和金黃色葡萄球菌ATCC25923作為對(duì)照。1.4莢膜多糖PCR反應(yīng)如前所述，通過(guò)PCR鑒定K1、K2、K5、K20、K54和K57莢膜血清型。通過(guò)PCR使用先前記錄的引物確定編碼毒力因子（rmpA、mrkD、kfuBC、fimH、uge、wabG、ureA、ycfM、entB、ybtS、iroN和allS）和pLVPK相關(guān)位點(diǎn)（terW–iutA–rmpA–silS）的基因存在。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS17.0分析數(shù)據(jù)。分類變量采用Fisher’s精確檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)測(cè)試均為雙尾，P值<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1hvKP鑒定及血清型在35株肺炎克雷伯菌分離株中采用黏液絲實(shí)驗(yàn)用于區(qū)分的hvKP和cKP，有11株（31.4%）為hvKP，24株（68.6%）為cKP。肺炎克雷伯氏菌的血清型鑒定結(jié)果顯示。共有15株（42.9%）分離株檢測(cè)為K1、K2、K20或K57血清型陽(yáng)性，其中8例（53.3%）顯示K1血清型，4例（26.7%）分離株顯示K2血清型，2例（13.3%）分離株為K20血清型陽(yáng)性，1例（6.7%）為K57血清型陽(yáng)性。然而，未發(fā)現(xiàn)K5和K54血清型。2.2血清型與感染部位之間的關(guān)系與醫(yī)院獲得性感染患者相比，在社區(qū)獲得性感染患者中，K1和K2血清型比更常見（P<0.05）（表1）。表1從社區(qū)獲得性或醫(yī)院獲得性感染分離的肺炎克雷伯菌的血清型比較K血清型社區(qū)獲得性感染（n=19）醫(yī)院獲得性感染（n=16）P值K17（36.8）1（6.3）<0.001K24（21.1）00.011K202（10.5）00.145K571（5.3）00.835其他血清型5（26.3）15（93.8）<0.0012.3hvKP和cKP感染患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征比較在hvKP感染患者（90.9%）中，男性優(yōu)勢(shì)比cKP感染患者（62.5%）更為顯著（P<0.05）。兩組的年齡分布無(wú)差異。hvKP感染患者中社區(qū)獲得性感染（11/11，100%）人數(shù)顯著多于cKP感染患者（8/24，33.3%）（P<0.05），并且肝膿人數(shù)顯著增多（54.5%vs.0，P<0.05）（表2）。此外，36.4%（4/11）的hvKP感染患者沒(méi)有報(bào)告潛在疾??；相比之下，95.8%（23/24）的cKP感染患者報(bào)告有一種或多種潛在疾病。表2患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征特征hvKP感染組（n=11）cKP感染組（n=24）P值性別0.021男10（90.9）15（62.5）女1（9.1）9（37.5）年齡>60歲5（45.5）15（62.5）0.204獲得感染類型社區(qū)獲得性感染11（100）8（33.3）<0.001醫(yī)院獲得性感染016（66.7）<0.001肝膿腫6（54.5）0<0.001菌血癥2（18.2）4（16.7）0.935膽道感染1（9.1）4（16.7）0.740泌尿系感染1（9.1）00.835腹部感染01（4.2）0.747急性腸炎01（4.2）0.747腎盂腎炎01（4.2）0.747潛在的疾病無(wú)4（36.4）1（4.2）<0.001糖尿病3（27.3）5（20.8）0.758膽道疾病1（9.1）3（12.5）0.864心臟病02（8.3）0.301中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病02（8.3）0.301酒精性肝硬化1（9.1）1（4.2）0.926血液病01（4.2）0.747肺部感染1（9.1）2（8.3）0.984癌癥1（4.5）7（29.2）0.046使用侵入性裝置3（27.3）15（62.5）<0.001結(jié)局出院8（72.7）19（79.2）0.784死亡04（16.7）0.254失去跟進(jìn)3（27.3）1（4.2）0.0962.4藥敏試驗(yàn)與cKP感染組相比，hvKP感染組對(duì)氨芐西林舒巴坦、阿莫西林克拉維酸、替卡西林克拉維酸、哌拉西林他唑巴坦、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢吡肟、氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、慶大霉素、妥布霉素、甲氧芐啶磺胺甲惡唑敏感率顯著提高（P<0.05）。此外，共有13株（13/35，37.1%）分離物產(chǎn)ESBLs，產(chǎn)ESBLs的cKP菌株的比例顯著高于hvKP菌株（50%與9.1%，P<0.001）。見表3。表3hvKP與cKP的藥敏差異藥物hvKP感染組（n=11）cKP感染組（n=24）P值哌拉西林5（45.5）9（37.5）0.434氨芐西林舒巴坦8（72.7）10（41.7）0.022阿莫西林克拉維酸10（90.9）14（58.3）0.011替卡西林克拉維酸10（90.9）11（45.8）0.002哌拉西林他唑巴坦10（90.9）17（70.8）0.028頭孢唑啉5（45.5）8（33.3）0.596頭孢西丁9（81.8）14（58.3）0.104頭孢呋辛9（81.8）10（41.7）0.004頭孢他啶10（90.9）12（50.0）0.002頭孢曲松10（90.9）12（50.0）0.002頭孢噻肟10（90.9）15（62.5）0.015頭孢吡肟11（100）19（79.2）0.047氨曲南10（90.9）14（58.3）0.015美羅培南11（100）23（95.8）0.967亞胺培南11（100）23（95.8）0.967環(huán)丙沙星10（90.9）12（50.0）0.002左氧氟沙星10（90.9）13（54.2）0.006四環(huán)素9（81.8）12（50.0）0.009米諾環(huán)素8（72.7）12（50.0）0.067慶大霉素11（100）16（66.7）0.001妥布霉素11（100）16（66.7）0.001阿米卡星11（100）20（83.4）0.083甲氧芐啶磺胺甲惡唑10（90.9）13（54.2）0.005ESBLs1（9.1）12（50.0）0.0012.5分子特征對(duì)于莢膜血清型，兩組之間在K1、K2和其他血清型中存在顯著差異（P<0.05）。毒力基因uge、wabG、fimH、entB、ybtS、kfuBC、mrkD、ycfM、ureA和allS在兩組中平均分布，而pLVPK相關(guān)位點(diǎn)、rmpA和iroN在兩組之間存在顯著差異（P<0.05）（表4）。表4hvKP組和cKP組之間的分子特征比較hvKP感染組（n=11）cKP感染組（n=24）P值K血清型K15（45.5）3（12.5）0.018K24（36.4）00.003K2002（8.3）0.157K571（9.1）00.835其他血清型1（9.1）19（79.2）<0.001毒力基因pLVPK相關(guān)位點(diǎn)6（54.5）0<0.001rmpA6（54.5）0<0.001uge11（100）24（100）-wabG11（100）24（100）-fimH11（100）24（100）-entB11（100）24（100）-iroN6（54.5）0<0.001ybtS4（36.4）17（70.8）0.214kfuBC00-mrkD11（100）21（87.5）1.000ycfM11（100）24（100）-ureA11（100）24（100）-allS3（27.3）00.104blaKPC11（100）24（100）-3討論cKP是一種重要的病原菌，可引起包括肺炎、菌血癥、敗血癥、化膿性感染和尿路感染等多種感染，這些都可能發(fā)生在社區(qū)或醫(yī)院環(huán)境中[7]。1986年，在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)了一種新的超強(qiáng)毒性臨床變種hvKP，繼而在美國(guó)、阿根廷、韓國(guó)和澳大利亞越來(lái)越多地報(bào)道了hvKP菌株[8-9]。hvKP可能引起侵襲性臨床綜合征（定義為感染），表現(xiàn)為社區(qū)獲得性肝膿腫，有或無(wú)肝外并發(fā)癥，如眼內(nèi)炎和壞死性筋膜炎[10]。此外，hvKP感染可在宿主不受損的情況下轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。在細(xì)菌表型特征方面，hvKP分離株不同于經(jīng)典菌株，因?yàn)樵诃傊桨迳仙L(zhǎng)的菌落出現(xiàn)了高粘液粘性，這對(duì)侵襲性感染中肺炎克雷伯菌的毒力有顯著影響，并且是hvKP存在的重要指標(biāo)[11]。在這項(xiàng)研究中，我們?cè)?1.4%（11/35）的肺炎克雷伯菌感染患者中發(fā)現(xiàn)了hvKP。此外，hvKP更常見于社區(qū)獲得性感染，特別是在沒(méi)有已知潛在疾病的患者中，表明這種菌株可能在社區(qū)獲得性感染中發(fā)揮重要作用。迄今為止，hvKP感染主要在亞洲人群中報(bào)告。盡管最近我國(guó)其他地區(qū)有一項(xiàng)類似的研究報(bào)告[12-13]，但與目前的報(bào)告不同，關(guān)于hvKP血流感染特征的信息很少。更重要的是，我們發(fā)現(xiàn)了1種產(chǎn)生ESBL的hvKP菌株。迄今為止，對(duì)于hvKP菌株的耐藥性也很少被報(bào)道。記錄hvKP分離株對(duì)我國(guó)臨床醫(yī)生開展感染管理非常有用，因?yàn)樵谖鞣絿?guó)家hvKP感染的報(bào)告已越來(lái)越頻繁。肺炎克雷伯氏菌是被包囊的，至今已鑒定存在至少78種莢膜多糖血清型[14]。莢膜是重要的毒力因子，并且一些莢膜型，特別是K1、K2、K5、K16、K20、K54、K57和KN1，被認(rèn)為是肺炎克雷伯菌的超毒力變體[14]。K1和K2是臺(tái)灣、韓國(guó)和我國(guó)大陸報(bào)道hvKP的最常見血清型[15-16]。在這項(xiàng)研究中，我們確定了4種hvKP血清型（K1、K2、K20和K57），這與之前臺(tái)灣的報(bào)道一致[15]。然而，本研究的分離株中沒(méi)有一個(gè)對(duì)K5或K54呈陽(yáng)性，與前人研究相一致[15]。此外，研究還注意到K1血清型不僅與肝膿腫相關(guān)，還與社區(qū)獲得性肺炎相關(guān)，與先前研究一致[16]。最重要的是，在本研究中，hvKP能夠在非免疫功能低下的宿主中引起嚴(yán)重感染，因?yàn)?4.5%（6/11）的肝膿腫患者沒(méi)有潛在的疾病。hvKP在臨床上應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注，因?yàn)樗鼤?huì)引起嚴(yán)重的感染，因此在臨床上應(yīng)該優(yōu)先考慮。本研究結(jié)果也表明，hvKP比cKP更容易引起肝膿腫和侵入性感染，尤其是對(duì)于沒(méi)有報(bào)告潛在疾病的患者，以及感染前未住院的患者。調(diào)查顯示，pLVPK相關(guān)位點(diǎn)（terW-iutA–rmpA–silS）與膿腫形成和K1、K2血清型菌株的流行顯著相關(guān)[17-18]。本研究中，cKP感染組中未發(fā)現(xiàn)pLVPK相關(guān)位點(diǎn)，而hvKP感染組在超過(guò)一半的患者中發(fā)現(xiàn)了pLVPK相關(guān)位點(diǎn)，證實(shí)了上述研究觀點(diǎn)。其他基因，如囊膜基因wabG和uge，1型和3型菌毛基因fimH和mrkD，也被報(bào)道與毒力相關(guān)[19]，但本研究在hvKP和cKP菌株之間沒(méi)有觀察到這些基因表達(dá)的差異。此外，本研究發(fā)現(xiàn)毒力基因rmpA和iroN在hvKP中比在cKP中更普遍。repA和iroN基因均屬于調(diào)節(jié)基因，能夠產(chǎn)生異羥肟酸類鐵載體，可競(jìng)爭(zhēng)獲取血液中的鐵離子[20]，表明hvKP較cKP的鐵獲得能力較強(qiáng)，進(jìn)一步反應(yīng)了hvKP具有較強(qiáng)的毒力。綜上所述，本研究顯示了hvKP和cKP感染之間的臨床和分子差異，由于本研究所用的分析方法是回顧性，并且僅在一家醫(yī)院進(jìn)行，因此，還需要進(jìn)一步通過(guò)大型前瞻性多中心研究來(lái)證實(shí)我們的發(fā)現(xiàn)。鑒于hvKP菌株更可能在臨床環(huán)境中引起嚴(yán)重感染，例如肝膿腫和敗血癥，因此迫切需要提高臨床意識(shí)和hvKP感染管理。參考文獻(xiàn)LiuYM,LiBB,ZhangYY,etal.ClinicalandmolecularcharacteristicsofemerginghypervirulentKlebsiellapneumoniaebloodstreaminfectionsinmainlandChina.[J].AntimicrobAgentsChemother,2014,58(9):5379-5385.ShankarC,VeeraraghavanB,NabarroLEB.WholegenomeanalysisofhypervirulentKlebsiellapneumoniaeisolatesfromcommunityandhospitalacquiredbloodstreaminfection[J].BmcMicrobiol,2018,18(1):6.馬榮,王曉丹,聶大平.高毒力肺炎克雷伯菌血流感染的臨床特點(diǎn)[J].中國(guó)感染控制雜志,2018,17(1):26-30. 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