第二章工業(yè)發(fā)酵菌種選育一、微生物工業(yè)對菌種的要求微生物資源豐富，廣布于土壤、水和空氣等自然界中，其中土壤中最多。現(xiàn)在微生物工業(yè)用菌有的是野生型，有的是通過誘變得到的突變體。

發(fā)展趨勢：從野生型變異株自然選育代謝控制育種誘變育種基因工程定向育種第一節(jié)工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)菌種（1）所需培養(yǎng)基易得，價格低廉；（2）培養(yǎng)和發(fā)酵條件溫和（糖濃度、溫度、pH、溶解氧、滲透壓等）（3）生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期短（4）單產(chǎn)高（選擇野生型、營養(yǎng)缺陷型或調(diào)節(jié)突變株）（5）抗病毒能力強(qiáng)（6）菌種純粹，不易變異退化，穩(wěn)定性好（7）菌體不是病源菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素（包括抗生素、激素和毒素），保證安全微生物工業(yè)對大規(guī)模生產(chǎn)用菌的要求原則：

二、工業(yè)發(fā)酵微生物及其代謝產(chǎn)物

什么是初級代謝？什么是次級代謝？P12

什么是初級代謝產(chǎn)物？什么是次級代謝產(chǎn)物？

初級代謝產(chǎn)物是指微生物產(chǎn)生的，生長和繁殖所必需的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸等。次級代謝產(chǎn)物是指由微生物產(chǎn)生的，與微生物生長、繁殖無關(guān)的一類物質(zhì)。抗生素、色素、毒素等是與初級代謝產(chǎn)物(如氨基酸、核酸)相對產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。1、微生物代謝產(chǎn)物的類型

2、微生物次級代謝與初級代謝的關(guān)系許多抗生素的基本結(jié)構(gòu)是由少數(shù)幾種初級代謝產(chǎn)物構(gòu)成的，所以次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為母體衍生出來的，次級代謝途徑并不是獨(dú)立的，而是與初級代謝途徑有密切關(guān)系的。糖代謝中間體，既可用來合成初級代謝產(chǎn)物，又可用來合成次級代謝產(chǎn)物，這種中間體叫做分支中間體。微生物次級代謝，其目的產(chǎn)物的生物合成途徑取決于微生物的培養(yǎng)條件和菌種的特異性。什么叫分叉中間體？問題次生代謝產(chǎn)物主要在哪個時期合成？次生代謝產(chǎn)物生成與初生代謝產(chǎn)物有關(guān)嗎？三、工業(yè)上常用的微生物微生物在工業(yè)上的用途很廣，包括化工、醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)、國防、紡織、石油勘探及石油化工等方面。微生物的代謝產(chǎn)物多，已超過1300多種，而用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的不足100多種；微生物酶有近千種，而工業(yè)上用的不過40－50種。微生物具有巨大的潛力可挖掘。工業(yè)上常用菌種：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌

1、常用的細(xì)菌

大腸桿菌應(yīng)用：對谷氨酸定量分析，生產(chǎn)天冬氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。

乳酸桿菌應(yīng)用：乳酸、干酪、奶子酒、發(fā)面、泡菜、酸奶等的制作枯草芽孢桿菌應(yīng)用：生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶等2、酵母菌種類：酒精酵母、啤酒酵母、假絲酵母紅酵母、面包酵母、畢赤氏酵母

應(yīng)用：生產(chǎn)酒精、啤酒、石油發(fā)酵脫蠟和制取蛋白質(zhì)、生產(chǎn)脂肪面包酵母啤酒酵母紅酵母3、霉菌曲霉屬應(yīng)用：生產(chǎn)有機(jī)酸、生產(chǎn)淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶應(yīng)用：醬油、醬類（淀粉酶）米曲霉應(yīng)用：產(chǎn)糖化酶和蛋白酶、主要用于釀酒制曲和醬油制曲應(yīng)用：生產(chǎn)甲義丁二酸

毛霉應(yīng)用：可以產(chǎn)生蛋白酶，我國多用于豆腐乳、豆豉等的制作根霉種類：米根霉、華根霉、少根根霉、爪哇根霉應(yīng)用：釀酒青霉菌應(yīng)用：生產(chǎn)青霉素、葡萄糖氧化酶4、放線菌氣生菌絲孢子絲孢子基內(nèi)菌絲培養(yǎng)基種類：龜裂鏈霉菌、金霉素鏈霉菌、灰色鏈霉菌、紅霉素鏈霉菌應(yīng)用：各類抗生素。土霉素、四環(huán)素、鏈霉素、紅霉素第二節(jié)、生產(chǎn)菌種的選育

二、菌種選育方法誘變育種代謝調(diào)控育種自然選育基因定向育種：基因工程，雜交，細(xì)胞工程一、選育的目的

改善菌種的特性，使產(chǎn)量提高，改進(jìn)質(zhì)量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用等。采樣→增殖培養(yǎng)→菌落的選擇→產(chǎn)品的鑒定如何使樣品中所含微生物的可能性大如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn)目的：高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物問題：三、自然選育的基本過程

（一）采樣1、采樣對象以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細(xì)菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。2、根據(jù)微生物的營養(yǎng)需求和代謝類型與其生長環(huán)境取樣如產(chǎn)纖維素酶菌、產(chǎn)殼聚糖酶菌、產(chǎn)蛋白酶菌或脂肪酶菌、產(chǎn)淀粉酶菌或糖化酶菌、極端微生物等。3、采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后，用小薩子除去表土，取離地面5-25cm處的土約10-25g，盛入無菌的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標(biāo)記，記錄采樣時間、地點(diǎn)、環(huán)境條件等，以備查考。（二）富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)：人為地增加分離概率，增加該菌種的數(shù)量，使目的微生物在種群中占優(yōu)勢。方法：控制一定的養(yǎng)分（碳源或氮源）；控制一定的培養(yǎng)條件（溫度、pH）。（三）培養(yǎng)分離

盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這一步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點(diǎn)，好一點(diǎn)。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法、組織分離法。培養(yǎng)條件控制營養(yǎng)成分控制、控制培養(yǎng)基的pH、添加抑制劑、熱處理、控制培養(yǎng)溫度、控制通氣量1、如何控制營養(yǎng)成分，分離自養(yǎng)型微生物、固氮菌、纖維素酶菌、幾丁質(zhì)酶菌？2、如何控制培養(yǎng)基pH分離產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉？3、分離放線菌、細(xì)菌、霉菌時，選擇哪些抑制劑？4、在培養(yǎng)基中添加去氧膽酸鈉的作用是什么？厭氧培養(yǎng)中加入焦性沒食子酸與NaOH的作用是什么？5、如何分離芽孢菌？問題？（四）篩選（生產(chǎn)能力的考察）

初篩：平板篩選法和搖瓶發(fā)酵篩選法。復(fù)篩：采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn)，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。（五）毒性試驗(yàn)

自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn)。（六）微生物選擇性分離的原理和方法1、控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件以利于待分離菌株的生長和抑制非目的微生物的生長；2、根據(jù)目的微生物的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計(jì)選擇性培養(yǎng)基，通過觀察微生物在選擇培養(yǎng)基上生長狀況或生化反應(yīng)進(jìn)行分離。酪素培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基變色圈法：如果膠酶產(chǎn)生菌、谷氨酸生產(chǎn)菌等；透明圈法：如淀粉酶生產(chǎn)菌、纖維素酶生產(chǎn)菌等；生長圈法：工具菌是營養(yǎng)缺陷型菌株。抑菌圈法：工具菌一般是抗生素敏感菌。拮抗菌對青枯病菌的抑制拮抗菌對白絹小菌核菌的抑制

四、誘變育種誘變育種的概念以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變育種包括誘變和篩選兩個部分。誘變成功的關(guān)鍵包括出發(fā)菌株的選擇、誘變劑種類和劑量的選擇。

1、誘變劑和誘變處理

物理誘變劑：射線如紫外線、X—射線、γ—射線，快中子；

紫外線的作用機(jī)制主要是形成胸腺嘧啶二聚體以改變DNA生物活性，造成菌體死亡和變異。化學(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5—氟尿嘧啶、烷化劑等?；瘜W(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點(diǎn)：就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。

選用最適劑量，充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)。2、誘變劑的選擇1）堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2）亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3）吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4）紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。3、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選出發(fā)菌株→純化→斜面→同步培養(yǎng)→離心洗滌→振蕩打散→過濾→菌懸液→誘變處理→平板分離→篩選→保藏/擴(kuò)大試驗(yàn)

（活菌計(jì)數(shù)）（計(jì)數(shù)）4、例子

紫外線的誘變育種

紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為250-240nm．燈與處理物的距離為15～30cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在70～80%為宜。

被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為106個／ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106～107個／ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約0.5～1.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。

操作步驟

1）將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000r／min離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。2）將菌懸液放入一巳滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá)108個／ml左右，作為待處理菌懸液。3）取2～4m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射10～50s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。4．取未照射的制備菌液和照射菌液各o.5ml進(jìn)行稀釋分離，計(jì)數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。5．取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120r／min振蕩培養(yǎng)4～6h。6．取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。7．挑取菌落進(jìn)行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌N—甲基—N‘-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，據(jù)認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強(qiáng)。操作步驟1．單孢子懸液制備取斜面，加入6ml0.1mol／LpH6.o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá)l06個／ml，此為待處理孢子懸液。2．MNNG溶液的制備用分析天平稱取2mg，加入2ml0.1mol／LpH6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。3．誘變處理吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30℃振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30℃3天后計(jì)數(shù)。4．死亡率計(jì)算將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離，30℃下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計(jì)算出死亡率。5．挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選．五、代謝控制育種改變代謝通路育種改變自我代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)育種六、基因育種基因重組育種：是運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，或者通過細(xì)胞間的相互作用，使一個細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另—個細(xì)胞的方法。基因重組１、獲得待克隆的DNA片段（基因）；２、目的基因與載體在體外連接；３、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；４、篩選、鑒定陽性重組子；５、重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá)。五、防止菌株衰退的措施菌種退化：菌種的發(fā)酵能力降低、繁殖能力降低、發(fā)酵產(chǎn)品的得率降低1、衰退的可能原因（1）、菌種保藏不妥（2）、菌種的生長要求沒得到滿足2、防止菌種衰退的方法

A、從菌種選育方面考慮B、盡量減少傳代次數(shù)（減小突變）C、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件D、利用不易衰退的細(xì)胞傳代E、采用有效的菌種保藏方法第三節(jié)、微生物菌種保藏◆目的把微生物菌種資源在一定條件下保存，使其存活、不丟失、不污染雜菌、不發(fā)生或少發(fā)生變異，保持菌株原有培養(yǎng)特性和生理活性。1、菌種保藏的目的及意義◆意義菌種是國家的一種重要資源，保持優(yōu)良菌種的優(yōu)良性能，可保證高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)；在基礎(chǔ)研究中，菌種保藏可保證研究結(jié)果獲得良好的重復(fù)性；◆原理根據(jù)菌種的生理、生化特點(diǎn)，創(chuàng)造條件使菌種的代謝活動處于不活潑狀態(tài)（休眠狀態(tài)）。2、菌種保藏基本原理及策略◆策略:保藏時首先要挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體（孢子、芽孢等），其次