高效毛細(xì)管電泳一、概述

outline二、基本裝置instrument三、基本原理basicprinciples四、主要分離模式

Mainseparatingform

五、毛細(xì)管電泳樣品收集和濃縮技術(shù)六、毛細(xì)管電泳的應(yīng)用

ApplicatioofHPCE七、毛細(xì)管電泳法的優(yōu)缺點(diǎn)與展望AdvantageanddevelopmentofHPCEhighperformancecapillaryelectrophoresis,HPCES0710123范逗逗導(dǎo)師:丁黎教授2023/10/18一.概述

CE是近年來發(fā)展較快的一種高效﹑快速的分離技術(shù)，在體內(nèi)藥物分析中得到廣泛應(yīng)用。CE具有分離模式多﹑樣品用量少﹑適用范圍廣﹑成本低等特點(diǎn)，是經(jīng)典電泳技術(shù)和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的產(chǎn)物。2023/10/18一.概述高效毛細(xì)管電泳（HighPerformanceCapillaryElectrophoresis，HPCE）又稱毛細(xì)管電泳（CapillaryElectrophoresis，CE）指以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)各組分樣品之間淌度和（或）分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的一種液相分離技術(shù)。2023/10/18二.基本裝置基本結(jié)構(gòu)大致包括:毛細(xì)管柱、進(jìn)樣系統(tǒng)、高壓系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)和數(shù)據(jù)收集系統(tǒng)等。2023/10/18二.基本裝置毛細(xì)管電泳示意圖1.高壓電源2.光電倍增管3.液葉冷溫控毛細(xì)管4.光源5.數(shù)據(jù)采集6.緩沖液或樣品7.緩沖液2023/10/18三.基本原理1.電泳在電解質(zhì)溶液中,帶電粒子在電場(chǎng)的作用下,以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現(xiàn)象叫電泳，遷移速度與哪些因素有關(guān)？當(dāng)帶電離子以速度ν

在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場(chǎng)推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用。電場(chǎng)力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場(chǎng)強(qiáng)度；ν—離子在電場(chǎng)中的遷移速度；f—平動(dòng)摩擦系數(shù)(對(duì)于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態(tài)動(dòng)力學(xué)半徑；η—介質(zhì)的粘度；)2023/10/18所以，遷移速度：（球形離子）

物質(zhì)離子在電場(chǎng)中差速遷移是電泳分離的基礎(chǔ)。溶質(zhì)在單位時(shí)間間隔內(nèi)和單位電場(chǎng)下移動(dòng)的距離為電泳淌度，也稱電泳遷移率（electrophoresismobility）。淌度μ

：2023/10/18三.基本原理

2.電滲流現(xiàn)象

當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。

電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡(jiǎn)稱EOF）。

2023/10/18HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流

CE所用的石英毛細(xì)管柱，在pH>3的情況下其硅膠表面帶負(fù)電,和溶液接觸時(shí)形成了一個(gè)雙電層.

在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度ν電滲流。2023/10/18HPCE中電滲流的大小與方向

電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場(chǎng)強(qiáng)度E。即

ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢(shì)，即

μ=ε0εξε0—真空介電常數(shù)；ε—介電常數(shù)；ξ—毛細(xì)管壁的Zeta電勢(shì)。

ν電滲流=ε0εξ

E實(shí)際電泳分析，可在實(shí)驗(yàn)測(cè)定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算

ν電滲流=Lef/teoLef—毛細(xì)管有效長(zhǎng)度；teo—電滲流標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時(shí)間。2023/10/18HPCE中電滲流的方向

電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)：內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)表面帶正電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽(yáng)極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：

（1）毛細(xì)管改性表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)；

（2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽(yáng)極。2023/10/18HPCE中電滲流的流形

電滲是CE中推動(dòng)流體前進(jìn)的驅(qū)動(dòng)力，它使整個(gè)流體像一個(gè)塞子一樣以均勻的速度向前運(yùn)動(dòng)，使整個(gè)流體呈近似扁平型的“塞式流”，它使溶質(zhì)區(qū)帶在毛細(xì)管內(nèi)原則上不會(huì)擴(kuò)張。液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍,導(dǎo)致溶質(zhì)區(qū)帶本身擴(kuò)張，引起柱效下降，使其分離效率不如CE。

2023/10/18HPCE中電滲流的作用

電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；

各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流+ν+ef陽(yáng)離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；

ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反；

ν0=ν電滲流中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；正離子最先流出。中性粒子電泳速度為零,故其遷移速度相當(dāng)于電滲流速度。負(fù)離子在中性粒子之后流出,這樣因各種粒子遷移速度不同而實(shí)現(xiàn)分離。2023/10/18HPCE中電滲流的作用（1）可一次完成陽(yáng)離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。2023/10/18三.基本原理

3.影響電滲流的因素(1).電場(chǎng)強(qiáng)度的影響

電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。(2).毛細(xì)管材料的影響

不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；2023/10/18(3).電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響溶液pH的影響

對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢(shì)增大，電滲流增大，pH=7，達(dá)到最大；pH<3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定。陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時(shí)，毛細(xì)管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強(qiáng)度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。2023/10/182023/10/18(5).添加劑的影響（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。（2）加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入不同陽(yáng)離子表面活性劑來控制電滲流。加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負(fù)電荷增加，zeta電勢(shì)增大，電滲流增大；（3）加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。2023/10/18(4).溫度的影響

毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；

焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過時(shí)，產(chǎn)生的熱量；溫度梯度影響溶質(zhì)遷移速度，使管軸中心的溶質(zhì)分子要比近管壁的分子遷移得更快，造成譜帶展寬，柱效下降。加快散熱是減小自熱引起的溫差的重要途徑。采用溫度控制裝置，盡快除去熱量，是系統(tǒng)盡可能地保持恒溫。目前常用冷溫控制的方法有兩種，一種是氣冷，一種是液冷。

2023/10/18HPCE中的參數(shù)與關(guān)系式

parametersandrelationinHPCE1.遷移時(shí)間（保留時(shí)間）

HPCE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細(xì)管總長(zhǎng)度；2.分離效率（塔板數(shù)）

在HPCE中，僅存在縱向擴(kuò)散，σ2=2Dt

擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，分離生物大分子的依據(jù)。2023/10/183.分離度

影響分離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長(zhǎng)度與總長(zhǎng)度比；有效淌度差。分離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：2023/10/18四.主要分離模式毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC或MEKC或CEMC）毛細(xì)管等速電泳（CITP）毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）毛細(xì)管電色譜（CEC）微乳毛細(xì)管電泳非水毛細(xì)管電泳（NACE）等。其中以CZE、MECC應(yīng)用最為廣泛。

2023/10/18四.主要分離模式CZE，CGE，CITP及CIEF的分析對(duì)象為可解離的物質(zhì)或帶電荷的物質(zhì)，適用于分離生物堿類﹑有機(jī)酸類﹑氨基酸類﹑核酸類﹑多肽及蛋白質(zhì)類﹑黃酮及其苷類、香豆素類等化合物。在蛋白質(zhì)和多肽的鑒別分析中CZE常用來測(cè)定肽譜（蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的指紋圖譜），CGE常用于測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和蛋白質(zhì)的富集。MECC除上述物質(zhì)外，還能分析中性分子，因此，它適用于各類物質(zhì)的分析。2023/10/18四.主要分離模式最近，又出現(xiàn)了毛細(xì)管陣列電泳(CAE)和毛細(xì)管電泳免疫分析(CEIA)、芯片毛細(xì)管電泳(CC)、親和毛細(xì)管電泳(ACE)、毛細(xì)管電泳儀與其他儀器的聯(lián)用CE-MS,CE-NMR等新技術(shù),所有這些發(fā)展都將使CE技術(shù)日臻完善。2023/10/18一.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）CZE又稱毛細(xì)管自由電泳，是CE中最基本﹑應(yīng)用最普遍的一種模式。前述CE的基本原理即是CZE的基本原理。CZE是根據(jù)在電場(chǎng)E中有不同的遷移速度來分離的。2023/10/18二.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC）在膠束動(dòng)電毛細(xì)管色譜法的體系中,存在著以膠束形式存在的準(zhǔn)固定相和作為載體的液體流動(dòng)相,溶質(zhì)在兩相之間分配,并且由于其在準(zhǔn)固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同差異而在不同的時(shí)間流出,從而使得不同性質(zhì)的物質(zhì)產(chǎn)生分離。因此，這相當(dāng)于構(gòu)成一種不需要的固體支持物來固定液體固定相的液-液分配色譜。它的作用力是在電場(chǎng)作用下的電滲流和電泳。2023/10/18MECC常用的表面活性劑陰離子型：癸基硫酸鈉﹑十二烷基硫酸鈉（SDS）﹑十四烷基硫酸鈉（STS）﹑十二烷基磺酸鈉；陽(yáng)離子型：十二烷基三甲基氯化銨（DTCA）﹑十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）﹑十六烷基三甲基氯化銨（CTAC）﹑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）；2023/10/18MECC常用的表面活性劑非離子型表面活性劑：辛基葡萄糖苷﹑3-[3-（氯化酰胺基苯基）二甲基胺基]-1-丙基磺酸酯（CHAPS）；手性表面活性劑：膽酸﹑毛地黃皂苷﹑十二烷基-N-L-纈氨酸鈉﹑環(huán)糊精。其中SDS最為常用，還可以將幾種膠束劑混合起來以提高M(jìn)ECC的選擇性和分離度2023/10/18三.毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）CGE是在毛細(xì)管中裝入凝膠作為支持物進(jìn)行電泳，應(yīng)用最多的介質(zhì)是交聯(lián)和非交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠（PAG）。凝膠起類似分子塞的作用，使生物大分子如蛋白質(zhì)，DNA片段按分子量大小逐一進(jìn)行分離。2023/10/18三.毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）凝膠粘度大，抗對(duì)流，能減少溶質(zhì)的擴(kuò)散，因此能限制譜帶的展寬，使峰形尖銳，達(dá)到CE的最高柱效。由于溶質(zhì)和凝膠（或加在凝膠基質(zhì)中的添加劑）生成絡(luò)合物，又能使分離度增加，同時(shí)