dynamin家族的功能和基因克隆

共同語言是細(xì)胞生理代謝的一個極為重要的過程。它不僅是細(xì)胞從環(huán)境中獲得物質(zhì)和恢復(fù)膜成分的過程。外界環(huán)境的激素、生長因子、裝載有營養(yǎng)或調(diào)節(jié)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運蛋白都要通過胞吞過程才能進(jìn)入細(xì)胞,而且如果沒有內(nèi)吞,細(xì)胞的胞吐(Exocytosis)也無法正常進(jìn)行。細(xì)胞胞吐以囊泡的形式把神經(jīng)突觸細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)以及內(nèi)分泌細(xì)胞的神經(jīng)肽類物質(zhì)釋放到細(xì)胞外的同時,也把囊泡的膜組分一并釋放到細(xì)胞膜上。為了維持細(xì)胞的正常形態(tài)和足夠的分泌囊泡,細(xì)胞中必然存在一種相應(yīng)回收機(jī)制,將胞吐的囊泡膜成分和相關(guān)蛋白從細(xì)胞膜上回收到細(xì)胞內(nèi);否則細(xì)胞膜就會因為囊泡的胞吐而不斷擴(kuò)大,并且也會抑制新囊泡的形成而無法進(jìn)行下一輪的胞吐活動。在囊泡發(fā)生胞吐后,在很短的時間(幾十毫秒)內(nèi)就會發(fā)生胞吞過程。目前,絕大部分胞吞的研究結(jié)果都來自于對神經(jīng)細(xì)胞的研究。以胞吞過程發(fā)生的快慢,我們把胞吞分為兩類:快速胞吞和慢速胞吞。快速胞吞一般認(rèn)為是由kissandstay和kissandrun的胞吐囊泡,經(jīng)過在膜附近的去錨釘重新酸化,而從質(zhì)膜上脫離回到細(xì)胞內(nèi)。這個過程不依賴于clathrin。但是目前我們實驗室在胰腺β細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),clathrin也可以通過提前聚集等過程來介導(dǎo)快速胞吞。慢速胞吞則是依賴clathrin的過程,一般認(rèn)為細(xì)胞膜上的受體蛋白通過AP2聚集,然后介導(dǎo)籠行蛋白結(jié)合在AP2的另一端,使細(xì)胞膜產(chǎn)生內(nèi)陷,最終從質(zhì)膜上脫離。不論是快速還是慢速胞吞,囊泡從質(zhì)膜上脫離的過程都需要dynamin的剪切作用。Dynamin是一個100kD左右的GTP結(jié)合蛋白質(zhì),具有鳥苷三磷酸酶(GTPase)的活性。Dynamin的重要作用最先在果蠅中觀察到,dynamin的溫度敏感性突變可以使果蠅癱瘓。體外實驗的和電鏡的證據(jù)表明,當(dāng)囊泡形成時,dynamin在囊泡與質(zhì)膜的頸區(qū)形成螺旋狀聚集,并在GTP水解時發(fā)生構(gòu)像變化,發(fā)生螺旋狀的縱向拉伸,最終將囊泡的從頸區(qū)拉斷。離體實驗發(fā)現(xiàn),純化的dynamin可引起脂質(zhì)小泡呈管狀排列,管的直徑與內(nèi)吞小泡的頸部直徑相似。但管狀脂質(zhì)小泡的形成并不依賴于它的鳥苷三磷酸酶活性,說明dynamin的這種作用并不是通過水解GTP實現(xiàn),而是其本身特性。1dynamin蛋白表達(dá)Dynamin具有5個結(jié)構(gòu)域(圖1),從N端到C端分別為:GTPase區(qū)(第1-299個氨基酸)、Middle區(qū)(第300-520個氨基酸)、PH區(qū)(第521-622個氨基酸)、GED區(qū)(第623-745個氨基酸)、PRD區(qū)(第746-864個氨基酸)。GTPase區(qū)能結(jié)合并水解GTP,提供剪切囊泡提供能量;Middle區(qū)中的coil-coiled區(qū)域介導(dǎo)dynamin與dynamin之間的聚合;PH區(qū)可與質(zhì)膜結(jié)合,使dynamin穩(wěn)定錨定在膜周圍;GED區(qū)域除了激活dynamin的GTP酶活性之外,其中的coil-coiled區(qū)域也能接到dynamin之間的聚合;C端的PRD區(qū)則介導(dǎo)dynamin與其他蛋白之間的相互作用。在神經(jīng)細(xì)胞中,神經(jīng)遞質(zhì)的釋放也依賴于從神經(jīng)末端質(zhì)膜上回收突觸囊泡。在胞吐發(fā)生后,突觸囊泡的回收存在兩種機(jī)制。在溫和的刺激下,占多數(shù)的是Clathrin介導(dǎo)的胞吞(CME),它使質(zhì)膜生成新的單個突觸囊泡。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞在強(qiáng)刺激下的時候,胞吞則被刺激依賴的大內(nèi)吞(ADBE)取代。ADBE是一種快速促發(fā),并且囊泡容量要比CME大很多。而這兩種內(nèi)吞形式,在分子水平上都依賴于dynamin1的鳥苷酸水解酶活性(GTPase);但是ADBE的促發(fā)則需要依賴于dynamin1PRD區(qū)域兩個磷酸化位點(Ser-774和Ser-778)的去磷酸化和磷酸化的循環(huán)。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞感受到強(qiáng)刺激時,dynamin1的Ser-774和Ser-778位點被鈣調(diào)磷酸酶去磷酸化,而觸發(fā)ADBE。而當(dāng)刺激結(jié)束時,Ser-778被CDK5激酶磷酸化,然后GSK3磷酸化起附近的Ser-774位點。通過dynamin1的磷酸化和去磷酸的循環(huán),從而調(diào)節(jié)dynamin1的PRD區(qū)域與其他蛋白結(jié)合或者解離。2dynamin研究進(jìn)展Dynamin蛋白家族都包含dynamin的主要功能區(qū)域-GT-Pase區(qū)域。Dynamin家族蛋白與其他鳥苷酸水解酶不一樣的是,dynamin蛋白中的GTPase活性是相互依賴的,而且GTP親和能力較低,并且都能與質(zhì)膜結(jié)合。目前在哺乳動物中主要發(fā)現(xiàn)了3種典型的dynamin:dynamin1特異性地分布在神經(jīng)細(xì)胞中;dynamin2廣泛存在于各種組織細(xì)胞;dynamin3主要分布在睪丸、胰島和內(nèi)臟器官,也見于神經(jīng)元的細(xì)胞中。這3種亞型主要在Middle區(qū)和PRD區(qū)有些差異,另外目前還陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些dynamin-like蛋白,而在果蠅和線蟲等較低等的生物中,也發(fā)現(xiàn)了dynamin同源蛋白。表1主要總結(jié)了真核生物的dynamin家族蛋白。3功能2:khain蛋白Dynamin蛋白的C末端的PRD區(qū)域能與許多其他蛋白相互作用。在dynamin1的PRD區(qū)域的110個氨基酸中就含有36個脯氨酸,就為Srchomology3(SH3)區(qū)域提供位點。SH3結(jié)構(gòu)域是有55-60個氨基酸構(gòu)成的球狀區(qū)域,每個SH3結(jié)構(gòu)域都含有一系列保守的氨基酸,形成一個口袋形式的結(jié)合域,而能與短的富含脯氨酸的肽段結(jié)合。根據(jù)這些蛋白有無BAR結(jié)構(gòu)域,我們把這些相互作用蛋白分為兩類:有BAR區(qū)域蛋白和無BAR區(qū)域蛋白。有BAR區(qū)域蛋白包括:amphiphysin,endophilin和syndapin/pacsin。在這三個蛋白的N末端都含有BAR結(jié)構(gòu)域,BAR結(jié)構(gòu)域能結(jié)合脂質(zhì)雙分子層,并感覺質(zhì)膜的彎曲比率,從而使質(zhì)膜變形,使脂質(zhì)形成一個狹窄的管狀結(jié)構(gòu)。Amphiphysin1和endophilin1在BAR結(jié)構(gòu)域的前面包含一個N末端的兩親性螺旋,這個BAR結(jié)構(gòu)域也稱之為N-BAR結(jié)構(gòu)域。而syndapin/pacsin由于在大的BAR結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含著一個FER/CIP4的同源結(jié)構(gòu)域,故syndapin/pacsin的BAR結(jié)構(gòu)域也稱之為F-BAR結(jié)構(gòu)域。在突觸囊泡中,Dynamin的去磷酸化能刺激它與syndapin/pacsin的結(jié)合,并觸發(fā)刺激依賴的大胞吞作用。無BAR區(qū)域蛋白包括:actin、Grb2、Dap160、Synaptophysin和ProSAP等。F-actin通過BAR結(jié)構(gòu)域與dynamin的PRD結(jié)合,通過調(diào)節(jié)actin的聚集,同時短的actin纖絲也可以促進(jìn)dynamin的聚合。Grb2通過它的兩個SH3區(qū)域和dynamin緊密結(jié)合并促使dynamin的聚集,暗示SH3區(qū)域和dynamin的PRD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可以促進(jìn)GTP的水解。Dap160蛋白含有4-5個SH3結(jié)構(gòu)域,它結(jié)合dynamin和其它富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)