第十三章生化藥物和基因工程藥物

分析概論

基本要求概述質(zhì)量檢驗的基本程序與方法常用定量分析方法及其應(yīng)用

練習(xí)與思考

Return10/25/20231生化藥物和基因工程藥物分析概論基本要求

1．掌握本類藥物質(zhì)量檢驗的基本程序與方法類型。2．掌握HPLC法和酶活力測定法在本類藥物測定中的應(yīng)用。3．熟悉本類藥物的范圍、種類、質(zhì)量控制的要點。4．了解本類藥物含量測定的其他方法。10/25/20232生化藥物和基因工程藥物分析概論一、防病、治病的三大藥源

第一節(jié)概述10/25/20233生化藥物和基因工程藥物分析概論

1．生化藥物：

例：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶等。

10/25/20234生化藥物和基因工程藥物分析概論2.基因工程藥物：以DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)、多肽、酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細胞生長因子類藥物。10/25/20235生化藥物和基因工程藥物分析概論DNA重組技術(shù)（基因工程）：生產(chǎn)過程為天然基因合成的核苷酸序列內(nèi)切酶連接酶載體重組的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細胞增殖、表達分離純化目的產(chǎn)物10/25/20236生化藥物和基因工程藥物分析概論二、種類氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類酶類與輔酶類多糖類脂質(zhì)類核酸及其降解物和衍生物類藥物1．生化藥物10/25/20237生化藥物和基因工程藥物分析概論2．基因工程藥物的種類

1）激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：

人生長激素釋放抑制因子、人胰島素、人生長激素

2）細胞因子類藥物：

人干擾素、人白細胞介素、集落刺激因子、促紅細胞生成素

3）酶類及凝血因子類藥物

10/25/20238生化藥物和基因工程藥物分析概論

三、特點

1.生物體的基本生化成分

2.分子量大:分子量測定

3.結(jié)構(gòu)難確證

4.全過程的質(zhì)量控制：原料、生產(chǎn)過程、

最終產(chǎn)品

5.生物活性檢查

10/25/20239生化藥物和基因工程藥物分析概論6.安全性檢查

7.效價（含量）測定：

理化法：有效成分的含量

效價測定和酶活力測定：有效成分的生物活性Return10/25/202310生化藥物和基因工程藥物分析概論

生化藥物和基因工程藥物質(zhì)量控制的項目：

來源與種類純度

性狀干燥失重或水分

鑒別熾灼殘渣

氨酸組分分析熱源試驗

肽圖生物活性

糖含量含量分析

第二節(jié)質(zhì)量檢驗的基本程序與方法

10/25/202311生化藥物和基因工程藥物分析概論肽圖檢查法：系通過蛋白酶或化學(xué)物質(zhì)裂解蛋白質(zhì)后，采用適宜的分析方法鑒定蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。第一法：胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法；第二法：溴化氰裂解-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法。10/25/202312生化藥物和基因工程藥物分析概論大腸桿菌菌體蛋白殘留量測定法：本法系采用酶聯(lián)免疫法測定大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中殘留菌體蛋白含量。酵母工程菌菌體蛋白殘留量測定法：本法系采用酶聯(lián)免疫法測定酵母表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中殘留菌體蛋白含量。假單胞菌菌體蛋白殘留量測定法：本法系采用酶聯(lián)免疫法測定假單胞菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)的重組制品中殘留菌體蛋白含量。10/25/202313生化藥物和基因工程藥物分析概論一、鑒別

理化鑒別法：化學(xué)鑒別法

紫外分光光度法

HPLC法

生化鑒別法：酶法

電泳法

等電聚焦法

生物鑒別法：家兔驚厥試驗10/25/202314生化藥物和基因工程藥物分析概論（一）理化鑒別法1.化學(xué)鑒別法：

例：溶菌酶-CONH-+Cu2+絡(luò)合顯色10/25/202315生化藥物和基因工程藥物分析概論

2.紫外分光光度法

溶劑：0.01mol/L鹽酸例：三磷酸腺苷二鈉濃度：20μg/ml判斷：λmax：257±1nmA250/A260：0.17～0.27。3.HPLC法：

利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。

10/25/202316生化藥物和基因工程藥物分析概論4.酶法：例：尿激酶的鑒別---氣泡上升法原理：10/25/202317生化藥物和基因工程藥物分析概論

方法：取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置37℃±0.5℃恒溫水浴保溫，記時。反應(yīng)系統(tǒng)在30～40秒內(nèi)凝結(jié)，凝結(jié)塊內(nèi)有氣泡生成，15分鐘內(nèi)凝結(jié)塊溶解，當(dāng)凝結(jié)塊溶解時，氣泡逐漸上升。以0.9%氯化鈉作空白，同法操作，凝結(jié)塊在2小時內(nèi)不溶。10/25/202318生化藥物和基因工程藥物分析概論5.電泳法：以肝素鑒別為例。與國家肝素標(biāo)準(zhǔn)品對照，其移動位置相應(yīng)。10/25/202319生化藥物和基因工程藥物分析概論

6.生物法：利用生物體進行試驗來鑒別藥物。例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素。利用胰島素的降糖作用。給家兔大劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注50%GS，驚厥停止。10/25/202320生化藥物和基因工程藥物分析概論二、雜質(zhì)檢查

一般雜質(zhì)檢查

特殊雜質(zhì)檢查：原料藥純度分析

生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查

1.原料藥純度分析：

多糖類-----低聚糖、核酸、蛋白質(zhì)

酶類藥物-----酶催化反應(yīng)基本產(chǎn)物的分析，具有一定活性的其他有關(guān)酶的檢查。

10/25/202321生化藥物和基因工程藥物分析概論例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查

選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物進行糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個胰蛋白酶單位中不得大于50單位，按每1mg胰蛋白酶為2500個單位和每1mg糜蛋白酶為1000單位，折算成重量，則糜蛋白酶的限度為5%（g/g）。

1:1000=x:50x=0.05（mg）L=0.05/1=5%

2.生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查10/25/202322生化藥物和基因工程藥物分析概論

三、安全性試驗

熱源試驗

異常毒性試驗:急性毒性物質(zhì)

過敏試驗：異性蛋白

降壓物質(zhì)試驗：導(dǎo)致血壓降低的雜質(zhì)、組

胺、類組胺

10/25/202323生化藥物和基因工程藥物分析概論

無菌試驗：活菌

基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查

來源于宿主細胞的殘留DNA，外源性雜質(zhì)

致突變試驗

生殖毒性試驗10/25/202324生化藥物和基因工程藥物分析概論熱源檢查法：系將一定量的供試品，靜脈注入家兔體內(nèi)，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況，以判定供試品中所含熱源的限度是否符合規(guī)定。細菌內(nèi)毒素檢查法：系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素，以判定供試品中細菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。10/25/202325生化藥物和基因工程藥物分析概論異常毒性檢查法：本法系生物制品的非特異性毒性的通用安全試驗，檢查制品中是否污染外源性毒性物質(zhì)以及是否存在意外的不安全因素。無菌檢查法：系用于確定要求無菌的生物制品、原料、輔料及要求無菌的其他品種是否無菌的一種方法。包括直接接種法和薄膜過濾法。10/25/202326生化藥物和基因工程藥物分析概論升壓物質(zhì)檢查法：本法系比較垂體后葉標(biāo)準(zhǔn)品（S）與供試品（T）升高大鼠血壓的程度，以判定供試品中所含升壓物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定。降壓物質(zhì)檢查法：本法系比較組胺對照品（S）與供試品（T）引起麻醉貓血壓下降的程度，以判定供試品中所含降壓物質(zhì)的限度是否符合規(guī)定。10/25/202327生化藥物和基因工程藥物分析概論外源性DNA殘留量測定法：供試品中的外源性DNA經(jīng)變性為單鏈后吸附于固相膜上，在一定溫度下可與相匹配的單鏈DNA復(fù)性而重新結(jié)合為雙鏈DNA，稱為雜交。將特異性單鏈DNA探針標(biāo)記后，與吸附在固相膜上的供試品單鏈DNA雜交，并使用與標(biāo)記物相應(yīng)的顯示系統(tǒng)顯示雜交結(jié)果，與已知含量的陽性DNA對照比對后，可測定供試品中的外源性DNA的含量。10/25/202328生化藥物和基因工程藥物分析概論四、含量測定

生化藥物和基因藥物的含量表示方法：

百分含量：適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥

物或經(jīng)水解后變成小分子的

藥物。

生物效價或酶活力單位：適用于酶類、

蛋白質(zhì)類藥物。

10/25/202329生化藥物和基因工程藥物分析概論含量測定方法：

理化分析法：

化學(xué)分析法：重量測定法、滴定分析法

電化學(xué)分析法

光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法

色譜分析法：HPLC法：RP-HPLC、HPIEC、HPGFC、

灌注色譜法、HPCE法

酶法：酶活力測定法、酶分析法

電泳法

生物檢定法Return10/25/202330生化藥物和基因工程藥物分析概論

1．電化學(xué)分析法藥物膜電極

生物組織膜電極

藥物電極微生物電極

離子選擇性電極法免疫電極

免疫場效應(yīng)管

酶電極

第三節(jié)常用定量分析方法及其應(yīng)用10/25/202331生化藥物和基因工程藥物分析概論

2.HPLC法

1）RP-HPLC：柱前衍生化自動測定氨基酸

柱：RP—18，柱溫：48℃

流動相：A--0.05%TFA；B--乙腈-異丙醇（4：1）

梯度洗脫

熒光檢測器：

ex=280nm～340nm,em=430nm10/25/202332生化藥物和基因工程藥物分析概論

測定：

樣品---肽

樣品水解：5.7mol/L鹽酸，0.1%苯酚、通N2，

110℃，20h～24h。

樣品干燥：真空

樣品的衍生化：丹酰氯

水解剩余的衍生化試劑：0.4mol/LNaOH

進樣測定10/25/202333生化藥物和基因工程藥物分析概論10/25/202334生化藥物和基因工程藥物分析概論10/25/202335生化藥物和基因工程藥物分析概論2）HPIEC測定對象：蛋白質(zhì)，多肽柱：離子交換鍵合相流動相：0.3mol/L～1.0mol/L的鹽的緩沖液。梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵素類鹽特點：可回收活性蛋白。10/25/202336生化藥物和基因工程藥物分析概論

3）HPGFC應(yīng)用：蛋白質(zhì)、多肽的分離及分子量測定。示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子量的測定柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000流動相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4

（1:1）0.05%疊氮化鈉10/25/202337生化藥物和基因工程藥物分析概論標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量曲線的制備：右旋糖苷藍醛縮酶血清白蛋白碳酸酐酶抑蛋白酶肽酪氨酸T0完全排阻完全進入填料空隙Tt標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量曲線：Kd--lgM.W.10/25/202338生化藥物和基因工程藥物分析概論10/25/202339生化藥物和基因工程藥物分析概論

樣品測定：

10/25/202340生化藥物和基因工程藥物分析概論應(yīng)用示例：ChP（2000）重組人胰島素的質(zhì)量控制1）鑒別：

法1：在效價測定項下，供試品主峰的保留時間應(yīng)與對照品的一致。

法2：供試品與對照品分別經(jīng)過酶解后，再分別進行梯度洗脫，供試品的肽圖譜與對照品的肽圖譜一致。10/25/202341生化藥物和基因工程藥物分析概論2）檢查：檢查項目：有關(guān)物質(zhì)、高分子蛋白、鋅、氮、干燥失重、無菌、細菌內(nèi)毒素。有關(guān)物質(zhì)：供試液經(jīng)梯度洗脫，按峰面積歸一化法計算有關(guān)物質(zhì)的量不得超過3.0%。高分子蛋白質(zhì)：

10/25/202342生化藥物和基因工程藥物分析概論

固定相：色譜用親水硅膠，它可以分離分子量

為5000～6000的球狀蛋白。

流動相：0.4mol/L碳酸氫銨-乙腈（69:31）

測定：分別測定供試液（1mg/ml）和對照液（將供試液稀釋成0.01mg/ml），供試液顯示的所有分子量大于重組人胰島素單體的各峰面積之和，應(yīng)不大于對照液主峰面積（限量1.0%)。

10/25/202343生化藥物和基因工程藥物分析概論

3）效價測定：

固定相：ODSC18

流動相：硫酸鹽緩沖液-乙腈（74︰26）

系統(tǒng)適用性試驗：測定胰島素主峰和A21脫氨胰島素峰之間的分離度與拖尾因子。

含量測定：分別進樣供試液和對照液，按峰面積外標(biāo)法計算含量。10/25/202344生化藥物和基因工程藥物分析概論3.灌注色譜法固定相