家兔kap31基因cds序列的序列分析

毛動物具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。尋找影響動物毛質(zhì)性狀的候選基因一直是眾多研究的目標(biāo),而目前研究主要集中于人和羊,在家兔中的研究很少,這大大制約了毛兔育種的進(jìn)展。角蛋白相關(guān)蛋白(keratinassociatedprotein,KAPs)作為動物毛發(fā)的基本成分之一,對于毛發(fā)的性質(zhì)起著重要的作用。KAP蛋白分為3類:一類為高甘氨酸酪氨酸蛋白(high-glycine-tyrosineKAPs),由KAP6.n多基因家族和2個單基因KAP7、KAP8編碼;一類為高硫蛋白(high-sulferKAPs),由KAP1.n、KAP2.n和KAP3.n多基因家族編碼;還有一類為超高硫蛋白KAP(Ultra-high-sulferKAPs),由KAP4.n和KAP5.n多基因家族編碼?；虼蠖酁樾∑?大小一般在0.6~1.5kb,并且都不含內(nèi)含子。目前,在哺乳動物中已對KAP1.n,KAP6.n,KAP3.2等基因進(jìn)行了研究,但未見KAP3.1基因的相關(guān)報導(dǎo)。因此本研究以6個家兔群體為試驗材料,獲得家兔KAP3.1基因CDS序列并進(jìn)行遺傳變異檢測,為進(jìn)一步探討該基因是否能作為家兔毛質(zhì)性狀的候選基因提供一定的理論參考。1材料和方法1.1提升性能兔和長毛兔本研究選取6個群體共718只家兔為試驗材料。其中,福建黑兔(60只)來自于福建省農(nóng)科院,有色獺兔(143只)和白色獺兔(101只)均來自于浙江余姚兔場,九疑山兔(72只)來自于湖南九疑山,皖系長毛兔(209只)來自于江蘇宜興拉必得種兔場和蘇系長毛兔(133只)來自于江蘇省農(nóng)科院。所有個體均為隨機(jī)抽樣,耳緣靜脈采血5mL,根據(jù)《分子克隆》中酚/氯仿法提取總DNA。1.2家兔kap3.1基因的擴(kuò)增和測序根據(jù)GeneBank中人、小鼠等物種KAP3.1基因序列設(shè)計并合成了2對特異性引物,對家兔KAP3.1基因的全CDS序列進(jìn)行擴(kuò)增,并用于PCR-SSCP檢測。引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物信息見表1。1.3pcr擴(kuò)增及測序PCR擴(kuò)增總體積為20μL:1μLDNA模板(100ng/μL),2μL10×PCRBuffer,1.5μLdNTP(10mmol/L),上下游引物各1μL(10pmol/μL),Taq酶為0.2μL(5U/μL),ddH2O13.3μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃預(yù)變性5min,94℃變性40s,適宜退火溫度40s,72℃延伸40s,35個循環(huán),最后72℃延伸10min。經(jīng)φ=2%瓊脂糖電泳檢測后,產(chǎn)物用于SSCP檢測。2.5μLPCR產(chǎn)物和7μL變性液,98℃變性10min,冰浴8min。10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Acr:Bis=39:1),120V電泳14~16h,銀染顯色,根據(jù)其多態(tài)性進(jìn)行分型。選取不同基因型的純合子進(jìn)行切膠回收,由上海生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。試驗所用的DNA聚合酶和dNTP均購自寶生物工程(大連)有限公司。1.4基因型分布差異的分析統(tǒng)計基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量(PIC)、期望雜合度(He),并對各群體基因型分布差異進(jìn)行卡方檢驗,Align軟件進(jìn)行序列比對和SNP位點篩查。2結(jié)果分析2.1家兔kap3.1基因的擴(kuò)增、序列和同源性分析用設(shè)計的2對引物擴(kuò)增家兔KAP3.1基因,φ=2%瓊脂糖電泳檢測,擴(kuò)增片段長度與預(yù)期片段大小一致,且特異性較好,經(jīng)雙向測序和序列拼接首次獲得家兔KAP3.1基因全長CDS序列449bp,包括全部的CDS區(qū)297bp,該序列與小鼠、黑猩猩、人的KAP3.1基因的同源性分別為88%、84%和83%?，F(xiàn)已將該序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(HM147283)。2.2營養(yǎng)突變株的篩選通過SSCP檢測后發(fā)現(xiàn)KAP3.1-1位點中呈現(xiàn)3種帶型,分別命名為AA、AB和BB(圖1),等位基因A和B,經(jīng)測序和序列比對發(fā)現(xiàn)C91T突變,處于編碼區(qū)內(nèi),但未引起氨基酸發(fā)生改變(均為絲氨酸),為沉默突變(圖2);而KAP3.1-2位點均未能檢測到多態(tài)。2.36福建黑兔、九疑山兔、黑兔與影響家兔群體間的分布在6個家兔群體的KAP3.1-1位點上,A等位基因均為優(yōu)勢等位基因,除蘇系長毛兔中并未檢測到多態(tài),其余5個群體均為低度多態(tài)(PIC<0.25),且6個群體均處于Hardy-Weinberg平衡(表2)。不同家兔群體KAP3.1-1位點的不同基因型分布差異檢驗結(jié)果(表3)顯示:福建黑兔與九疑山兔,福建黑兔與皖系長毛兔,有色獺兔與白色獺兔,九疑山兔與白色獺兔,九疑山兔與皖系長毛兔之間不存在分布差異(P>0.05),而其他家兔群體彼此之間的分布差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。表中FB為福建黑兔,YT為有色獺兔,BT為白色獺兔,JY為九疑山兔,WX為皖系長毛兔,SX為蘇系長毛兔,當(dāng)df=1,χ2(0.01)(0.01)2=6.63,χ2(0.05)(0.05)2=3.84;當(dāng)df=2,χ2(0.01)(0.01)2=9.21,χ2(0.05)(0.05)2=5.99。表中FB為福建黑兔,YT為有色獺兔,BT為白色獺兔,JY為九疑山兔,WX為皖系長毛兔,SX為蘇系長毛兔,當(dāng)df=1,χ2(0.01)(0.01)2=6.63,χ2(0.05)(0.05)2=3.84;當(dāng)df=2,χ2(0.01)(0.01)2=9.21,χ2(0.05)(0.05)2=5.99。3sscp檢測后發(fā)現(xiàn)的問題目前,已有學(xué)者對人、羊等動物的KAPs家族基因進(jìn)行了研究,但是關(guān)于KAP3.1基因研究卻未見報道。本研究根據(jù)多個物種KAP3.1基因的保守區(qū)設(shè)計了2對特異性引物,首次獲得了家兔KAP3.1基因的全長CDS序列,結(jié)果揭示,該基因序列與小鼠、黑猩猩和人的同源性均達(dá)83%以上,說明該基因在不同物種中的同源性較高,在進(jìn)化過程中相對比較保守。通過SSCP檢測后發(fā)現(xiàn)在家兔KAP3.1中的KAP3.1-1位點的多態(tài)信息含量都較低,各群體的整齊度較高。原因可能是長毛兔、獺兔均是起源于肉兔,長期的選育過程可能對該基因的影響不大?；虮磉_(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的整個過程,是個體正常生長、發(fā)育和適應(yīng)環(huán)境的基礎(chǔ)。堿基變異特別是編碼區(qū)的變異可能影響蛋白質(zhì)表達(dá)調(diào)控,進(jìn)而影響細(xì)胞表型和表型性狀的變化。本研究中僅在KAP3.1-1位點上的發(fā)現(xiàn)突變,為C91T突變,但所編碼的氨基酸并未發(fā)生改變,均為絲氨酸(AGC-AGT)。但目前有文獻(xiàn)報導(dǎo),同義突變雖不改變編碼的氨基酸,但因為改變了核苷酸序列,有可能影響涉及轉(zhuǎn)錄后加工,影響切接信號順序,影響啟動子區(qū)重要堿基等,改變mRNA的構(gòu)象、降低mRNA的穩(wěn)定性等,最后都可能影響基因的表達(dá)。目前,對家族基因的研究