sdf-1xcr4軸在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的趨化作用

bmscs向損傷區(qū)的遷移糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類生活和健康的疾病。近年來許多研究發(fā)現(xiàn)通過靜脈移植從骨髓提取培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs)可以遷移歸巢到受損胰腺的部位參與組織修復(fù)以及促進再生,干細(xì)胞治療已成為一種很有前景的治療選擇。然而BMSCs向損傷區(qū)遷移的具體機制目前尚不清楚。在生物、化學(xué)等因素的刺激下病變組織產(chǎn)生一系列理化改變并表達了一些能促使移植的BMSCs遷移到受損區(qū)域發(fā)揮作用的分子。如果我們能通過實驗了解是哪些蛋白分子發(fā)揮了促進移植的BMSC向疾病組織區(qū)域趨化運動,對在今后的疾病治療中使用BMSC有著非同尋常的指導(dǎo)作用。大量文獻報道證明基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(Stromalcellderivedfactor-1,SDF-1)及其受體CXCR4在體內(nèi)參與了多項生命過程,它不僅在內(nèi)皮祖細(xì)胞、造血干細(xì)胞等的趨化遷移過程中起著重要的作用而且還與惡性腫瘤細(xì)胞的擴散轉(zhuǎn)移有關(guān)。CXCR4在多種干細(xì)胞表面表達包括BMSC、造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等。由此我們設(shè)計了以下實驗旨在通過體外遷移體系觀察BMSC在SDF-1/CXCR4軸作用下向受損胰腺組織遷移的相應(yīng)改變,從而驗證SDF-1/CXCR4軸在BMSC向受損胰腺組織遷移中的促進作用,并探索其分子機制。1材料和方法1.1實驗動物健康SD大鼠購于第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心,2-3月齡、體重220-250g,雌雄不限,清潔級,均在無特定病原體條件下飼養(yǎng)。1.2e生物技術(shù)DMEM-LG培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國Gibco公司),重組SDF-1因子(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),FITCanti-ratCD29、FITCanti-ratCD34、PEanti-ratCD45、PEanti-ratCD90(美國eBioscience公司),鏈脲佐菌素(STZ)、AMD3100(美國Sigma公司)。1.3percol細(xì)胞分離和培養(yǎng)取2-3周SD大鼠頸椎脫臼處死,75%酒精浸泡消毒5min,無菌條件下取出股骨和脛骨,仔細(xì)分離并暴露骨髓腔,用注射器吸取無菌DMEM培養(yǎng)液反復(fù)多次沖骨髓腔,使骨髓內(nèi)的細(xì)胞流出,200μm尼龍網(wǎng)過濾除去較大的組織團塊。將收集的細(xì)胞懸液貼壁緩慢加入57%的Percoll細(xì)胞分離液上方,2000r/min離心10min,取培養(yǎng)液和Percoll細(xì)胞分離液的界面層細(xì)胞,接種到含有10%FBS的DMEM-LG培養(yǎng)基中,放置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),72h后首次換液,以后每兩天換液一次,當(dāng)觀察到細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時,按1:3傳代培養(yǎng),定期觀察記錄細(xì)胞形態(tài)。用0.25%胰酶消化后收集培養(yǎng)的第3代細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面CD29、CD34、CD90、CD45的表達。1.4stz的制作SD大鼠5只(6-8周齡,體重220-300g),禁食不禁水12h,將STZ溶解于0.01mol/l檸檬酸三鈉-檸檬酸緩液中(PH4.5)制成濃度1%的STZ液(65mg/kg)腹腔注射。自由飲食、飲水72h后出現(xiàn)多飲、多尿、多食癥狀持續(xù)一周,尾靜脈取血測空腹血糖>16.7mmol/l為建模成功。1.5l-dmem法大鼠乙醚麻醉后,正中切口分離、切取胰腺組織,用PBS沖洗干凈后立即放入液氮罐中保存。實驗時將胰腺組織從液氮中取出稱得一定的組織質(zhì)量,用眼科剪充分剪碎后再放入到玻璃勻漿器中,按1ml/100mg的比例加入L-DMEM培養(yǎng)液,冰浴條件下研磨。收集勻漿后的組織,3500r/min離心10min,取上清液再用12000r/min離心20min,取上清液,濾器抽濾,-70℃下保存留備用。運用以上方法制備實驗所需的正常大鼠胰腺組織提取液。1.6細(xì)胞活力檢測取生長狀態(tài)良好的第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進行實驗。0.25%胰蛋白酶消化后用含2%胎牛血清(2%FCS)的L-DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/ml,讓細(xì)胞在培養(yǎng)液中懸浮1h以恢復(fù)其功能及形態(tài)。將收集到的細(xì)胞分為6組(A~F組):A組為陰性對照組下室內(nèi)加入含2%FCS的L-DMEM培養(yǎng)液0.5ml,B、C、D、E組的下室內(nèi)分別加入含10、50、100、200ng/mlSDF-1的2%FCSL-DMEM培養(yǎng)液0.5ml,F組下室內(nèi)加入含2%FCS+100ng/mlSDF-1L-DMEM培養(yǎng)液0.5ml。A~E組上室內(nèi)均加入200μl細(xì)胞懸液,F組上室內(nèi)加入與100μg/mlAMD3100共孵育30min后的細(xì)胞懸液200μl,將Transwell小室(濾膜孔徑8μm)置37℃、5%CO2條件下孵育24h,取出小室,PBS淋洗,用棉簽擦去硝酸纖維素膜內(nèi)層上的細(xì)胞及雜質(zhì),在室溫下浸泡在4%多聚甲醛中固定細(xì)胞15min,清洗后使用蘇木精染色,每張濾膜在倒置顯微鏡觀察并隨機計數(shù)5個高倍鏡(×400)視野下細(xì)胞數(shù),取平均值。實驗重復(fù)3次綜合分析。1.7模型胰腺組織的培養(yǎng)按照以上的方法行胰腺組織提取液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移趨化影響的實驗。將消化收集的細(xì)胞分為5組((1)~(5)組),陰性對照組((1)組)在下室加入含2%FCS的L-DMEM培養(yǎng)液0.5ml;正常胰腺組織提取液組((2)組)在下室內(nèi)加入正常胰腺組織提取液0.5ml;模型胰腺組織提取液組((3)組)在下室內(nèi)加入受損胰腺組織提取液0.5ml;AMD3100+模型胰腺組織提取液組((4)組)在下室內(nèi)加入受損胰腺組織提取液0.5ml;AM-D3100+正常胰腺組織提取液組((5)組)在下室內(nèi)加入正常胰腺組織提取液0.5ml。(1)-(3)組上室內(nèi)分別加入200μl細(xì)胞懸液;(4)-(5)上室內(nèi)分別加入與100μg/mlAMD3100共孵育30min的細(xì)胞懸液200μl。1.8數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)均以表示,采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件進行分析,采用單因素方差分析,當(dāng)P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)光鏡下觀察到骨髓中分離出大量的有核細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中,培養(yǎng)72h后換液倒掉沒有貼壁的細(xì)胞,培養(yǎng)可見呈集落生長的橢圓形、梭形貼壁細(xì)胞,部分呈三角形,胞核大清晰(圖1A)。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時,按1:3傳代,傳至第3代時細(xì)胞形態(tài)均一,大部分呈長梭形,似成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞界限清楚漩渦或平行排列,細(xì)胞生長迅速(圖1B)。2.2造血干細(xì)胞標(biāo)記物cd29、cd29流式細(xì)胞儀檢測BMSCs表面標(biāo)記高表達CD29、CD90,低表達造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34、CD45,表達率分別為98.6%、99.7%、1.8%和5.0%(圖2)。2.3sdf-1對be組遷移細(xì)胞數(shù)的影響用Transwell小室檢測不同濃度SDF-1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的影響效果。實驗數(shù)據(jù)顯示在10、50、100、200ng/ml不同濃度的SDF-1條件下(B~E組)遷移細(xì)胞數(shù)分別為(13.33±1.15)、(19.67±3.06)、(25.33±2.89)、(25.67±4.04),較陰性對照組(A組9.00±3.00)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);隨著SDF-1濃度的增加對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的影響呈現(xiàn)濃度依賴性,SDF-1100ng/ml+AMD3100組的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移數(shù)為(10.67±4.04),與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。2.4細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞遷移數(shù)遷移實驗結(jié)果顯示(1)~(5)組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)分別為(9.33±2.08)、(9.67±3.21)、(26.33±3.79)、(19.67±3.79)、(10.33±3.06)。正常胰腺組織提取液組((2)組)與陰性對照組((1)組)相比較無統(tǒng)計學(xué)意義。糖尿病模型胰腺組織提取液組((3)組)與陰性對照組和正常胰腺組織提取液組相比較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移數(shù)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。然而當(dāng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與100ng/mlAMD3100共孵育30min后((4)組),糖尿病模型胰腺組織提取液對細(xì)胞的趨化作用明顯減弱,細(xì)胞遷移數(shù)顯著下降。用100ng/mlAMD3100處理骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞((5)組)后結(jié)果顯示并沒有明顯降低正常胰腺組織提取液對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移影響(圖4)。3細(xì)胞間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移歸巢骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)取材方便,免疫原性弱,增殖能力強,具有多向分化潛能,且利用BMSCs可進行自體移植,從而避免免疫排斥反應(yīng)及倫理紛爭,因此BMSCs成為干細(xì)胞組織工程的理想種子細(xì)胞。而且越來越多的實驗證據(jù)表明BMSCs擁有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗凋亡和營養(yǎng)的作用。本研究采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲較得純化的BMSCs,表面抗原CD29、CD90、CD106呈陽性,CD34、CD45為陰性。研究發(fā)現(xiàn),組織受損或炎癥時可分泌多種信號分子促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移,這些分子包括細(xì)胞因子(G-CSF,granulocytemacrophagecolonystimulatingfactors(GM-CSF),stemcellfactor(SCF)),白介素(IL-7,IL-12,andIL-3),趨化因子(SDF-1,IL-8,Mip-1α,andGroβ)和生長因子(VEGF,hepatocyteandinsulin-likegrowthfactor(HGF),IGF)。SDF-1在其中起到重要的作用,SDF-1(CXCL12)是CXC趨化因子亞家族的成員之一,它對多種干細(xì)胞的趨化作用受到趨化因子受體CXCR4的調(diào)節(jié)、是己知的CXCR4的唯一配體。隨著研究的深入SDF-1/CXCR4軸已成為探索干細(xì)胞遷移及歸巢行為的重要環(huán)節(jié)。SDF-1/CXCR4軸在生命體內(nèi)擁有有廣泛的生理功能:不僅在循環(huán)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用,還參與了HIV的感染、炎癥反應(yīng)、造血干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的遷移等過程。本實驗利用Transwell小室體外遷移法對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移歸巢的相關(guān)機制做了初步探討。實驗結(jié)果顯示,AMD3100可阻斷SDF-1對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)趨化作用,說明SDF-1在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移中起重要作用且在一定范圍有劑量依賴性。在使用糖尿病模型胰腺組織提取液進行實驗時骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞遷移數(shù)較正常胰腺組織提取液組和陰性對照組都顯著提高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,說明糖尿病胰腺組織中表達了某些特殊的蛋白分子或信號分子誘導(dǎo)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移過程,而這種效果作用能被SDF-1/CXC-R4軸特異性拮抗劑AMD3100明顯抑制,提示SDF-1/CXCR4軸可能是糖尿病胰腺組織提取液中趨化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的主要因子。AMD3100雖然能明顯抑制糖尿病胰腺組織提取液組對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化作用,但是抑制后的