中藥抗柚皮苷抗體免疫親和色譜柱的制備及初步應(yīng)用

這四種復(fù)合物是東漢張仲景提出的《傷寒論》，由柴胡、白芍、桔梗、甘草等成分組成。此方在臨床上被廣泛應(yīng)用于炎癥性疾病的治療,其作用機(jī)理及其主要活性成分已部分闡明,但各成分在此方中的作用尚不明了。我們的前期研究結(jié)果顯示,四逆散及其藥對(duì)柴胡-芍藥、芍藥-甘草于誘導(dǎo)相給藥時(shí),可顯著減輕小鼠的耳腫脹,其中以柴胡-芍藥藥對(duì)的作用為最強(qiáng)。作為四逆散的主要成分,柴胡皂苷a、芍藥苷、柚皮苷(naringin)和甘草酸受到了關(guān)注,其含量(以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì))分別為四逆散提取物的1.2%,1.4%,7.9%和2.1%。這些成分作為復(fù)方的主要有效成分,其作用通常通過直接探討它的藥理活性來實(shí)現(xiàn),但其在復(fù)方整體中的作用還往往無法認(rèn)定。為了探討這些成分在四逆散中的作用,我們?cè)⒘顺煞痔禺愋蕴蕹姆椒?成功地將甘草酸從復(fù)方中剔除,并通過實(shí)驗(yàn)證明了四逆散對(duì)淋巴細(xì)胞黏附能力和基質(zhì)金屬蛋白酶活性的抑制作用因剔除甘草酸而減弱,提示這種特異性剔除特定成分的新方法可用于研究該成分在復(fù)方中的作用。本研究為了進(jìn)一步探究四逆散中柚皮苷的作用,合成了柚皮苷與牛血清白蛋白的結(jié)合物,并以其作為完全抗原制備了抗柚皮苷的多克隆抗體,通過抗柚皮苷的免疫親和色譜,以獲得特異性地剔除柚皮苷而不影響其他成分的四逆散樣品。1實(shí)驗(yàn)部分1.1藥物、藥品和培養(yǎng)基Waters600高效液相色譜儀:Waters600泵,Waters2487監(jiān)測器,Empower工作站;分析柱:Symmetry5μm-C18,3.9mmi.d.×150mm(Waters,USA);YMC-PackDiol-120(YMC,USA)。柚皮苷對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所);牛血清白蛋白(BSA,Sigma);卵清蛋白(OVA,Sigma);1-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC,Sigma);經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B凝膠(AmershamBiosciences,瑞士);鄰苯二胺(中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司);甲醇(色譜純,江蘇漢邦科技有限公司);柴胡、白芍、枳實(shí)、甘草均購自南京市藥材公司。1.2抗鈉抗鈉抗鈉抗鈉抗鈉抗鈉抗劑的合成和鑒定1.2.1柚子皮苷的回復(fù)突變?cè)囼?yàn)pbs參照文獻(xiàn)的方法制備柚皮苷琥珀酰半酯。將25mgBSA和10mgEDC溶于10mL0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)中,置于磁力攪拌器上緩慢攪拌,并逐滴加入50g/L柚皮苷琥珀酰半酯的二甲基甲酰胺溶液,30min后再加入5mgEDC,室溫下攪拌過夜(24h)。反應(yīng)液經(jīng)透析后冷凍干燥,得到粉紅色粉末(即naringin-BSA)29mg。1.2.2灰灰水的制備將55mgOVA溶于14mL0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中,置于磁力攪拌器上緩慢攪拌,并逐滴加入12.5g/L的柚皮苷甲醇溶液4mL,隨后用1mol/L的碳酸鈉水溶液調(diào)整pH到10.0,室溫下繼續(xù)攪拌6h。該反應(yīng)液經(jīng)透析后冷凍干燥,得到白色粉末(即naringin-OVA)68mg。1.2.3完全產(chǎn)物的檢測采用凝膠-高效液相色譜法(GEL-HPLC)對(duì)“1.2.1”和“1.2.2”節(jié)中獲得的完全抗原進(jìn)行檢測。HPLC條件:YMC-PackDiol-120凝膠柱;流動(dòng)相為0.01mol/L的PBS,流速1mL/min;檢測波長280nm;柱溫25℃。1.3抗葡萄糖苷的制備1.3.1常規(guī)免疫試驗(yàn)選8月齡體重在2～3kg的健康雄性新西蘭大白兔2只,于免疫前一周在兔耳緣靜脈采血留作陰性對(duì)照。參照文獻(xiàn)的方法用naringin-BSA進(jìn)行常規(guī)免疫。經(jīng)5次免疫后,從兔耳緣靜脈取血測抗體效價(jià),當(dāng)效價(jià)符合要求時(shí)經(jīng)頸動(dòng)脈采全血。將全血于37℃下放置1h,于4℃下靜置過夜,以3000r/min離心5min,取血清分裝,于-20℃下保存。1.3.2包被抗原酶標(biāo)板用溶于50mmol/L碳酸鈉緩沖液的包被抗原naringin-OVA(500mg/L)包被酶標(biāo)板,每孔100μL。洗滌,其他步驟參照文獻(xiàn)。1.3.3igg的制備用硫酸銨沉淀法從抗血清中分離得到粗IgG蛋白,用SephadexG-25柱脫鹽,除去硫酸銨,再用CelluloseDE-32離子交換柱提純。以核酸蛋白檢測儀監(jiān)測蛋白出峰情況,將吸光值(OD)高的各管洗脫液合并,置于重蒸水中透析3次,冷凍干燥,得IgG純品,于-70℃下保存。用HPLC檢測其純度。1.3.4黨組織對(duì)于柚子皮苷的初步酶基參照文獻(xiàn),用naringin-OVA包被酶標(biāo)板,每孔50μg。洗滌,封閉,競爭性反應(yīng):50μL各濃度的柚皮苷和其他樣品的10%甲醇溶液分別與50μLIgG溶液混合均勻,然后在酶標(biāo)板上每孔加入100μL,孵育1h制得二抗。加入鄰苯二胺-H2O2底物溶液,每孔100μL,避光反應(yīng)20min。再于每孔中加入50μL的2mol/LH2SO4溶液終止反應(yīng),進(jìn)行吸光值測定。按文獻(xiàn)的方法計(jì)算交叉反應(yīng)率。1.4抗體原激活劑的制備稱取抗體IgG蛋白14mg溶解于pH8.3的0.1mol/LNaHCO3(含0.5mol/LNaCl)溶液,定容至5mL。另稱取0.5g經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B凝膠到一干凈的燒杯中,用40mL的1mmol/LHCl溶液懸浮并轉(zhuǎn)移至玻璃濾器中,再用1mmol/LHCl溶液約200mL分4次沖洗,去除保護(hù)基團(tuán)。將抗體溶液加入到凝膠中并轉(zhuǎn)移至一玻璃管中,封口,在20℃中振蕩孵育3h。再將該抗體溶液轉(zhuǎn)移至0.5mmi.d.×20mm的色譜柱內(nèi),用核酸蛋白檢測儀檢測、收集流出液,并以pH8.3的0.1mol/LNaHCO3(含0.5mol/LNaCl)溶液沖洗到OD值為0。合并流出液。用HPLC法檢測流出液中IgG蛋白的峰面積,以IgG蛋白的對(duì)照溶液為對(duì)照,計(jì)算未偶聯(lián)IgG蛋白的質(zhì)量,從而計(jì)算得出IgG蛋白的偶聯(lián)率。剩余的活性基團(tuán)以2倍體積的終止液(0.1mol/LTris-Cl溶液,pH8.0)封閉。再以不少于5倍柱體積的0.1mol/LNaAc-HAc緩沖液(pH4.0)沖洗該柱,接著以同體積的0.1mol/LTris-Cl(pH8.0,含0.05mol/LNaCl)溶液沖洗。循環(huán)沖洗3次。將該柱以0.01mol/LPBS(含0.02%NaN3)平衡,在4℃條件下保存。1.5逆散物質(zhì)的提取稱取上述單味藥材各25g以等比配成四逆散全方,用8倍量的70%乙醇回流提取,回收乙醇,干燥得提取物粉末,收率為23.3%。在四逆散提取物中加入適量0.01mol/LPBS溶液,溶解。將質(zhì)量濃度為180mg/L四逆散提取物的PBS溶液1mL加至免疫親和色譜柱上,以5倍量的0.01mol/LPBS溶液洗脫,流速4mL/h。合并流出液(作為流出液1),得到剔除柚皮苷后的四逆散樣品。再以同樣流速的0.1mol/LPBS溶液洗脫,收集流出液(作為流出液2),得到剔除下來的柚皮苷成分。1.6柚子皮苷的檢測用HPLC的方法對(duì)剔除前后的四逆散樣品進(jìn)行檢測。HPLC條件:Symmetry5μm-C18分析柱;檢測波長283nm(柚皮苷的特征吸收波長);流動(dòng)相梯度洗脫,0～25min由20%甲醇水溶液變化到80%甲醇水溶液。采用競爭性ELISA法測定剔除柚皮苷的四逆散樣品中殘留的柚皮苷含量(線性檢測范圍為10～2000μg/L)。2結(jié)果與分析2.1完全產(chǎn)物的保留時(shí)間完全抗原naringin-BSA合成前后的HPLC圖譜見圖1。從圖1中可見,完全抗原合成后,其保留時(shí)間明顯前移。同樣,naringin-OVA的出峰時(shí)間為6.3min,而OVA的出峰時(shí)間為7.8min(圖略)。這是因?yàn)楹铣煽乖^載體蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量有所增加,其出峰時(shí)間也有所提前。2.2血清學(xué)檢測結(jié)果新西蘭兔經(jīng)人工完全抗原naringin-BSA常規(guī)免疫5次后獲得兔抗血清。在以非競爭性ELISA方法測定該兔抗血清的效價(jià)時(shí),將其稀釋到30000倍,發(fā)現(xiàn)OD492曲線趨向水平,即稀釋更大的倍數(shù)時(shí)OD492趨向不變,此稀釋度(1∶30000)即為該兔抗血清的效價(jià)(見圖2)。用HPLC法對(duì)抗體IgG的純度進(jìn)行檢測。取質(zhì)量濃度為2g/L的抗體IgG溶液20μL進(jìn)樣,檢測波長為280nm。用峰面積歸一法測得抗體IgG的純度為94%。用競爭性ELISA法測定純化的抗體IgG與四逆散中其他主要成分的交叉反應(yīng)。結(jié)果表明,該抗體與白芍中的成分芍藥苷、柴胡中的成分柴胡皂苷a、甘草中的成分甘草酸的交叉反應(yīng)率均低于1%;同為枳實(shí)中的成分橙皮苷與柚皮苷化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,但它們的交叉反應(yīng)率僅為2%,故可認(rèn)為所純化的抗體IgG具備了較高的特異性。2.3偶聯(lián)反應(yīng)前后的親和凝膠的制備將純化的多克隆抗體與用CNBr活化的Sepharose4B凝膠進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng),得到親和凝膠約2.5mL。裝柱并平衡,用HPLC測定未偶聯(lián)的IgG量,計(jì)算出蛋白偶聯(lián)率為87%。2.4在吸收峰的測定中柚子皮苷含量的變化剔除柚皮苷前后樣品的HPLC圖譜見圖3。由圖3中可以看出,柚皮苷的吸收峰在剔除后的樣品中幾乎消失,而其他的吸收峰沒有明顯的變化。HPLC測定流出液2中的柚皮苷含量為原上樣四逆散溶液中柚皮苷含量的96%。以競爭性ELISA測定流出液1和流出液2中的柚皮苷含量,結(jié)果分別為原上樣四逆散溶液中柚皮苷含量的2%和96.5%。因此可認(rèn)為原上樣四逆散溶液中約98%的柚皮苷已經(jīng)被剔除。3逆散中抗體的選擇性本研究在人工抗原合成過程中,為避免引入相同的交聯(lián)副產(chǎn)物而干擾效價(jià)檢測,免疫抗原和包被抗原采用了不同的合成路線。為了考察完全抗原是否偶聯(lián)成功,我們選用GEL-HPLC方法,從吸收峰的保留時(shí)間和峰面積的變化就能直觀地從質(zhì)和量兩個(gè)角度證明偶聯(lián)的成功,并通過非競爭性ELISA方法測得抗體的效價(jià)達(dá)到1∶30000。該抗血清經(jīng)過硫酸銨沉淀除去雜蛋白,SephadexG-25柱脫去硫酸銨和小分子,以及CelluloseDE-32離子交換柱以等電點(diǎn)的差異除去IgM、IgA等蛋白后進(jìn)一步精制得到抗體IgG。經(jīng)檢測得知抗體效價(jià)沒有降低,純度達(dá)到94%。實(shí)驗(yàn)中還測得該抗體與四逆散中其他主要成分的交叉反應(yīng)率很低,基本避免了多克隆抗體較單克隆抗體的效價(jià)低、純度低、交叉反應(yīng)率高等缺陷,達(dá)到了制備免疫親和色譜柱的要求。在制備免疫親和色譜柱的過程中,我們?cè)?4mg抗體IgG與0.5g經(jīng)CNBr活化的Sepharose4B凝膠(干粉,溶脹后體積約為1mL)以98%的偶聯(lián)率合成了免疫親和色譜柱,發(fā)現(xiàn)其對(duì)柚皮苷的親和能力很弱,幾乎不能吸附柚皮苷成分。有文獻(xiàn)報(bào)道,抗體IgG和Sepharose4B凝膠的偶聯(lián)率過高會(huì)影響免疫親和色譜柱的親和效率?？贵wIgG與Sepharose4B凝膠顆粒過度交聯(lián)會(huì)使抗體的活性下降,或偶聯(lián)發(fā)生在抗體的抗原結(jié)合片段,從而使得抗體IgG的抗原結(jié)合位點(diǎn)被封閉,導(dǎo)致免疫親和色譜柱的親和能力大大降低。通常1mL溶脹的Sepharose4B偶聯(lián)10mg抗體IgG較為合適。經(jīng)過改進(jìn),制備的免疫親和色譜柱的偶聯(lián)率為87%,對(duì)于柚皮苷的剔除效果達(dá)到98%。從圖3可知,在成功地剔除柚皮苷后的四逆散樣品中未觀察到其他峰的明顯變化,因此可以認(rèn)為免疫親和柱對(duì)柚皮苷的剔除是特異性的,對(duì)柚皮苷以外的其他成分基本無影響?；?/p>