健康人群內(nèi)谷胱甘肽的氧化還原電位測定

水體氧化還原（railol）影響著許多代謝和身體功能。許多生物材料的結(jié)構(gòu)和功能與氧化還原平衡態(tài)有關(guān)。但體液氧化-還原態(tài)的監(jiān)測指標(biāo)卻是一個至今未能取得共識的懸案,已被探索的指標(biāo)包括還原型、氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG),NADPH/NADP+,NADH/NAD+,還原型、氧化型輔酶Q(CoQH2/CoQ)等,及體液的氧化-還原電位。本文檢測了成都地區(qū)青年健康人群中GSH/GSSG的分布狀態(tài),以初步確認(rèn)GSH/GSSG是否有一相對穩(wěn)定的范圍?是否呈正態(tài)或近似正態(tài)分布?可否作為一項可用的體液氧化-還原態(tài)的監(jiān)測指標(biāo)?并為進一步建立GSH/GSSG在健康人群中的正常范圍積累基礎(chǔ)資料。同時,對建立的GSH、GSSG測定方法進行了質(zhì)控檢驗,以確認(rèn)方法的可信度。1測定方法正常人群從健康學(xué)生志愿者中募集。年齡22～25歲,平均年齡為23.5歲。男20人,女22人。熒光試劑鄰苯二醛(O-phthaldehyde,OPT,為瑞士Fluka公司產(chǎn)品),N-乙基馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide,NEM,為瑞士Fluka公司產(chǎn)品),GSH和GSSG標(biāo)準(zhǔn)品均為Sigma公司產(chǎn)品。其余均為國產(chǎn)分析純試劑。所用均為雙重蒸餾水。日本島津RF-510型熒光分光光度儀。德國賀利氏低溫離心機。血漿制備:清晨用肝素抗凝的真空采血管抽取血液5ml,立即放入離心機中離心10分鐘后迅速分離出血漿。取500μl血漿加入等體積0.04MNEM混勻后放置30分鐘,以測定GSSG。再取500μl血漿加入等體積10%偏磷酸(m/v)除蛋白后進行GSH測定。紅細(xì)胞制備:將剩余的紅細(xì)胞用等體積生理鹽水洗滌三次,將洗滌后的紅細(xì)胞吸取500μl,加入等體積蒸餾水充分溶血后加入1mlNEM以及10%偏磷酸除蛋白。放置30分鐘后進行GSSG的測定。將洗滌后的紅細(xì)胞吸取500μl,加入等體積蒸餾水充分溶血后加入10%偏磷酸除蛋白后進行GSH測定。將制備好的血漿或紅細(xì)胞樣品分別取100μl,測定GSH時加入0.1M磷酸氫二鈉-0.005MEDTA緩沖液900μl;測定GSSG時加入緩沖液0.1MNaOH900μl?；靹蚝蠓謩e各取100μl再加入相應(yīng)緩沖液1.9ml,加入100μlOPT,充分混勻放置30分鐘后,在激發(fā)波長334.4nm,發(fā)射波長422.4處測熒光強度。1.6u3000gsh和gssg標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和回收率Eh=Eo+RT/2Fln[(GSSG)/(GSH)2]其中,R為氣體常數(shù);F為法拉第常數(shù);E0為GSH-GSSH的標(biāo)準(zhǔn)電位值,以血液pH值7.4為標(biāo)準(zhǔn),E0為-264mV。根據(jù)此公式計算GSH-GSSG的氧化還原電位值。GSH配制用磷酸緩沖液(pH8.0);GSSG配制緩沖液為0.1M氫氧化鈉溶液。GSH和GSSG濃度依次為:0.5、1、2、4、6、8、10ug/ml。標(biāo)準(zhǔn)管加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液0.1ml,空白管加入0.1ml蒸餾水,各管分別加入相應(yīng)緩沖液1.9ml,混勻后加入0.1ml的OPT-甲醇溶液,混勻后室溫下靜置30分鐘。以空白管調(diào)零,在激發(fā)波長334.4nm,發(fā)射波長422.4處測熒光強度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在新鮮血漿和紅細(xì)胞樣品和中分別加入GSH和GSSG標(biāo)準(zhǔn)品,計算其回收率。在樣品加入OPT后5分鐘開始測定熒光強度,并以5分鐘為時間間隔,在加入OPT后60分鐘停止測定。觀察其熒光強度的變化。將新鮮血漿和紅細(xì)胞在-80℃下保存24小時后解凍血漿和紅細(xì)胞按照新鮮標(biāo)本步驟進行處理測量。計算出濃度后同新鮮血漿和紅細(xì)胞內(nèi)GSH/GSSG進行比較。采用spss11.5forwindows統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,統(tǒng)計分析采用t檢驗,p<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1重復(fù)性和穩(wěn)定性每天新鮮配制GSH和GSSG標(biāo)準(zhǔn)溶液,各重復(fù)測定5次結(jié)果。其不同含量的合并變異系數(shù)(CV)分別為3.25%和2.76%,顯示出良好的重復(fù)性,較穩(wěn)定。以均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1。線性關(guān)系良好,r值皆大于0.99。其直線回歸方程為:Y=49.41195x-3.5377(GSH)(r=0.997)Y=19.59371x+12.74259(GSSG)(r=0.998)2.2回收率加入標(biāo)準(zhǔn)品后樣品GSH和GSSG的回收率分別為98.1%和97.5%,回收較完全。表明本方法具有良好的準(zhǔn)確度。見表1、表2。2.3穩(wěn)定性試驗在加入OPT后前25分鐘熒光強度不穩(wěn)定,在30分鐘時達到穩(wěn)定,其后30分鐘內(nèi)都較為穩(wěn)定,變化不大(CV<10%)。2.4凍融后的gsh/gssg分析經(jīng)過凍存后的血漿和紅細(xì)胞中的GSH和GSSG都比新鮮血漿和紅細(xì)胞的含量升高(p<0.05),但凍融后的紅細(xì)胞內(nèi)的GSH/GSSG比值卻比新鮮紅細(xì)胞內(nèi)的比值降低。見表3和表4。去蛋白與否對凍存的血漿和紅細(xì)胞內(nèi)的GSH、GSSG和GSH/GSSG的測定值有輕微影響,但無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。2.5血漿gsh/gssg的測定共測得42名青年健康志愿者(男20名,女22名,平均年齡23.5歲),其血漿中GSH含量范圍是8.64±1.40μmol·L-1;GSSG的范圍為1.08±0.24μmol·L-1;GSH/GSSG的范圍為10.27±1.54,經(jīng)正態(tài)性檢驗,呈正態(tài)或近似正態(tài)分布,如圖2。紅細(xì)胞中GSH含量的范圍為6.81±1.38μmol·L-1RBC;GSSG的范圍為:0.77±0.39μmol·L-1RBC;GSH/GSSG的范圍為:9.02±3.61。經(jīng)檢驗符合正態(tài)分布。見圖3。經(jīng)公式計算出電位,血漿GSH/GSSG的氧化-還原電位Eh=-213.9mV±4.94mV;RBC液GSH/GSSG的氧化-還原電位Eh=-221.4mV±3.16mV。其頻數(shù)分布亦符合正態(tài)分布,如圖4。男女性別間無統(tǒng)計學(xué)意義的差別(p>0.05)。3gsh/gssg的氧化-還原電位檢測GSH/GSSG是體液中含量最高的蛋白質(zhì)氧化-還原對,參與對許多代謝、生理功能的調(diào)控和防御功能。如黃嘌呤脫氫酶/黃嘌呤氧化酶,由同一基因編碼,主要參與嘌呤核苷酸的代謝。兩者皆催化次黃嘌呤→黃嘌呤→尿酸的氧化降解反應(yīng),黃嘌呤脫氫酶以NAD+為電子受體,生成NADH;而黃嘌呤氧化酶則以O(shè)2為電子受體,生成超氧陰離子O2和H2O2。兩者活性的轉(zhuǎn)化主要受控于體液氧化-還原態(tài)的高低,給予GSH使該酶主要表現(xiàn)為黃嘌呤脫氫酶活性,而給予GSSG又可使該酶主要表現(xiàn)為黃嘌呤氧化酶活性,顯示出GSH/GSSG對酶活性的強大調(diào)控能力。JonesDP等發(fā)現(xiàn),血漿GSH/GSSG的比值在中年以前一直很穩(wěn)定,但45歲以后該比值進行性地呈線性增高的氧化態(tài)轉(zhuǎn)化,顯示其與衰老的可能關(guān)系。本研究檢測了健康青年人的GSH/GSSG比值,其血漿內(nèi)的比值為10.27±1.54,RBC液的比值為9.02±3.61。經(jīng)計算轉(zhuǎn)換成為氧化-還原電位,分別為血漿:-213.9mV±4.94mV,RBC液:-221.4mV±3.16mV,與JonesDP的結(jié)果相近,略偏向還原方向(Eh更負(fù))。本結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差小,呈正態(tài)分布,表明本結(jié)果可作為正常國人血漿和紅細(xì)胞的GSH、GSSG、GSH/GSSG比值,及其氧化-還原電位的參考值。對GSH和GSSG的測定有酶循環(huán)法,但此法只能測定谷胱甘肽總量,而不能將GSH和GSSG區(qū)分開來;高效液相色譜法(HPLC)雖然可以區(qū)分GSH和GSSG,但樣本的處理過程復(fù)雜,價格昂貴。本實驗將組織中谷胱甘肽的熒光測定法改進為對血漿和紅細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽還原型和氧化型的測量。用熒光測定法可以同時測定還原型(GSH)和氧化型(GSSG),其方法具有準(zhǔn)確、穩(wěn)定以及操作簡便的特點。其標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好;重現(xiàn)性高,變異系數(shù)(CV)分別為3.25%和2.76%;回收率在98.1%和97.5%之間,亦顯示出良好的準(zhǔn)確度。在熒光物質(zhì)(OPT)與樣本結(jié)合半小時后,熒光讀數(shù)顯示出良好的穩(wěn)定性。在對樣品的處理方面,本文摸索了去蛋白對結(jié)果的影響,改進了用10%的偏磷酸代替原方法中25%的偏磷酸,以防止對血漿和紅細(xì)胞過度去蛋白而影響GSH和GSSG的測定結(jié)果。同時本次實驗對樣品保存方式進行了探討,在-80℃條件下凍存的樣品在室溫條件下自然解凍后血漿內(nèi)和紅細(xì)胞的GSH和GSSG都有所升高(p<0.01)