rp-hplc法測定蓮子片中酚性生物堿

蓮心是睡蓮科植物的一個(gè)成熟種子。根據(jù)本草綱目的記載，它的味道又苦又冷，具有“清熱清熱”的功效。其生物堿成分有蓮心堿、異蓮心堿、蓮心季銨堿、荷葉堿、前荷葉堿等。以前3者的含量居多,這3種同屬雙芐基異喹啉類生物堿,具有廣泛的抗心律失常作用和鈣拮抗活性,酚性生物堿是這些生物堿單體分離提取過程的中間品和具有抗心律失常作用的有效部位。本文建立了同時(shí)測定酚性生物堿中蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿3種主要成分的高效液相色譜法,并在此基礎(chǔ)上建立了酚性生物堿的特征圖譜。通過對(duì)10批樣品特征圖譜的分析,確定了該特征圖譜16個(gè)共有峰。現(xiàn)報(bào)道如下。1色譜免疫試劑:hw-2000型ShimadzuLC-9A型高效液相色譜儀(日本島津),包括:LC-9A泵,SCL-6B系統(tǒng)控制器,C-R4A色譜數(shù)據(jù)處理機(jī),SPD-6AV紫外檢測器,HW-2000型色譜工作站。蓮子心(湖北洪湖產(chǎn),湖北中藥材公司,批號(hào)20020709),蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿對(duì)照品和酚性生物堿(本院天然藥物化學(xué)教研室,理化常數(shù)及波譜測試(UV、IR、MS、NMR),均與文獻(xiàn)報(bào)道一致,通過面積歸一化法測得蓮心堿純度98.9%,異蓮心堿98.6%,甲基蓮心堿98.0%);乙腈(一級(jí)色譜純,浙江省科技開發(fā)總公司黃巖化工實(shí)驗(yàn)廠);三乙胺(分析純,天津市化學(xué)試劑廠一廠),其它試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1u3000酸相色譜色譜柱:ZORBAXSB-C18(4.6mm×150mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈-水-三乙胺(25∶75∶0.1,用磷酸調(diào)pH3.3),紫外檢測波長282nm,流速0.8mL·min-1,柱溫為室溫,靈敏度0.01AUFS。2.2試驗(yàn)中使用的溶液2.2.1容量瓶的制備精密稱取減壓干燥至恒重的酚性生物堿適量置10mL容量瓶中,用0.3%鹽酸溶解,加流動(dòng)相定容,搖勻,0.22μm濾膜濾過,即得。取20μL進(jìn)樣,色譜圖見圖1-B。2.2.2貯備液的制備分別精密稱取減壓干燥至恒重的蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿10.0,10.0,10.5mg,分別用0.3%的鹽酸溶解,用流動(dòng)相定容成蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿濃度分別為1,1,1.05g·L-1的貯備液。分別取4,5,0.5mL于10mL容量瓶中,用流動(dòng)相定容,搖勻,以0.22μm濾膜濾過。取20μL進(jìn)樣,蓮心堿,異蓮心堿,甲基蓮心堿的出峰時(shí)間分別為2.763,3.166,4.277min,色譜圖如圖1-A。2.3方法研究2.3.1線性范圍和檢出限取5個(gè)不同濃度的對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣20μL,按上述色譜條件測定峰面積(n=3),其結(jié)果見表1。以峰面積和進(jìn)樣量進(jìn)行線性回歸,蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿的回歸方程分別為:Y=821181X+19522,r=0.9996Y=804761X+45315,r=0.9997Y=690649X+15245,r=0.9994線性范圍分別為0.4～4.8μg,0.5～6μg,0.0525～0.63μg。2.3.2蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定性的測定取同一供試品溶液,分別于0,2,4,6,8,12,24h進(jìn)樣測定,其相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定,測定蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿的峰面積,其RSD分別為1.13%,1.01%,1.28%。表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.3蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定性精密吸取對(duì)照品溶液20μL,連續(xù)進(jìn)樣5次,其相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定,測得峰面積,蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿3種成分RSD分別為0.92%,1.04%,2.5%。2.3.4測定含量測定取同一批樣品6份,按“3.1”項(xiàng)制備供試品溶液,按上述色譜條件測定含量。結(jié)果蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿的平均含量(n=6)分別為40.65%,44.62%,2.65%,RSD分別為0.78%,0.94%,1.71%,且各主要共有峰相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定。2.3.5次甲基蓮心堿法測定總糖含量為5.取已測知含量的樣品10.0mg,精密稱定。精密加入各種對(duì)照品溶液如下:蓮心堿(1.00g·L-1)4mL,異蓮心堿(1.00g·L-1)5mL,甲基蓮心堿(1.05g·L-1)0.5mL,按“3.1”項(xiàng)下操作,測定5次。結(jié)果蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿的平均回收率(n=5)分別為101.3%,98.8%,101.7%,RSD分別為2.0%,2.1%,1.9%。2.4樣品測定照本文方法,對(duì)10批酚性生物堿樣品進(jìn)行含量測定,每批平行測定2份,結(jié)果見表2。2.5共有峰的相對(duì)保留時(shí)間2.5.1照“3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,對(duì)10批樣品進(jìn)行特征圖譜分析,找出共有峰16個(gè),以蓮心堿的保留時(shí)間為基準(zhǔn)(相對(duì)保留時(shí)間為1),計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間,列于表3。除上述共有峰外的所有峰,均為非共有峰。2.5.2樣品特征圖譜中主要共有峰的相對(duì)峰面積列于表4。3提取的總堿與檢測蓮心堿含量的關(guān)系據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,用高效液相測定蓮子心中3種主要生物堿的含量,其中蓮心堿和甲基蓮心堿的含量要明顯高于異蓮心堿的含量,而我們測得的酚性生物堿中異蓮心堿的含量最高,究其原因是考慮到提取工藝的不同,所得中間產(chǎn)品酚性生物堿的含量有可能不同。本實(shí)驗(yàn)采用稀酸滲漉法提取蓮心總堿,將總堿用氯仿提取,提取液用3%氫氧化鈉溶液萃取2次,將堿液層調(diào)pH值得沉淀,過濾、干燥即得酚性生物堿。有資料顯示,用3%氫氧化鈉溶液一次萃取總堿氯仿液,能較完全提取蓮心堿,異蓮心堿,而甲基蓮心堿留在有機(jī)相中。提示本實(shí)驗(yàn)中還有大量甲基蓮心堿留在氯仿中,究其原因甲基蓮心堿只含有一個(gè)酚羥基。在本實(shí)驗(yàn)中,我們將蓮心總堿氯仿提取液回收氯仿后,用0.5%的鹽酸反復(fù)提取,再用濃氨水調(diào)pH值得沉淀,過濾、干燥得非水溶性總堿。將其以同“3.1”項(xiàng)下方法,同上述色譜條件下進(jìn)樣20μL,其色譜圖見圖2。如圖所示,非水溶性總堿中甲基蓮心堿的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蓮心堿和異蓮心堿,達(dá)72.06%,而蓮心堿為10.11%,異蓮心堿為9.72%。這一結(jié)果又提示了我們?cè)诜蛛x純化各生物堿單體時(shí)可通過酚性堿和非水溶性堿中這3種組分的質(zhì)量控制而達(dá)到優(yōu)化提取的目的。中藥的質(zhì)量控制是中藥現(xiàn)代化的一個(gè)重要組成部分。特征圖譜質(zhì)控技術(shù)是保證中藥制劑最終功效,實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵。中藥色譜特征圖譜是一種綜合的可量化的色譜鑒定手段,借以鑒別真?zhèn)?評(píng)價(jià)原料藥材、半成品和成品質(zhì)量均勻性和穩(wěn)定性。因此,該含量測定方法和特征圖譜的建立,將為蓮子心中生物堿類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)提取物