褐飛虱遭遇草間小徑蛛釋放揮發(fā)性物質(zhì)的提取與鑒定

昆蟲信息素也被稱為昆蟲外激素，它是昆蟲自身通過發(fā)送和釋放內(nèi)或間個人信息來發(fā)射的一種微量行為和控制材料。其中昆蟲報警信息素是除性信息素外研究最多的一種(Bergmannetal.,2009)。昆蟲報警信息素(insectalarmpheromones)是昆蟲在遭遇危險時所產(chǎn)生的向同類昆蟲示警的化學(xué)信號。由于報警信息素無污染、專一性強等優(yōu)勢,其研究與應(yīng)用受到很大的重視。目前已經(jīng)有很多昆蟲的報警信息素得到了鑒定,其中包括蜜蜂、螞蟻、胡蜂、白蟻、蚜蟲、薊馬等,節(jié)肢動物門的螨類也被證明能夠產(chǎn)生報警信息素(Verheggenetal.,2010)。褐飛虱Nilaparvatalugens(Stue560l)是我國及東南亞國家水稻生產(chǎn)上最主要害蟲之一,對我國水稻生產(chǎn)構(gòu)成極大的威脅。生產(chǎn)上,化學(xué)防治仍是防治褐飛虱的主要手段,長期連續(xù)不合理使用化學(xué)農(nóng)藥已使褐飛虱產(chǎn)生抗藥性,導(dǎo)致化學(xué)防治失敗,造成褐飛虱再猖獗發(fā)生,也帶來稻谷的農(nóng)藥殘留(程家安和祝增榮,2006;婁永根和程家安,2011)。在這種情況下,迫使人們?nèi)ふ曳乐魏οx的新途徑和新技術(shù)。利用昆蟲信息素防治害蟲已成為無公害殺蟲劑的一個重要組成部分,它具有靈敏度高、防治效果好、使用方便,對環(huán)境友好,不殺傷天敵等特點。目前,褐飛虱化學(xué)生態(tài)學(xué)的研究主要集中在褐飛虱對寄主揮發(fā)物的行為反應(yīng)上(婁永根和程家安,1994;劉芳等,2002;LouandBaldwin,2003;Louetal.,2005;周強等,2003;汪鵬,2011)。劉芳等(2002)證明褐飛虱極顯著的趨向于健康水稻釋放的揮發(fā)物,而受害較重的水稻釋放的揮發(fā)物能驅(qū)避褐飛虱(徐濤等,2002;周強等,2003)。汪鵬(2011)以褐飛虱為害誘導(dǎo)的水稻揮發(fā)物為基礎(chǔ),篩選了能對褐飛虱產(chǎn)生行為影響的活性組分,并證明其中farnesene、MeSA和2-heptanone對褐飛虱有驅(qū)避作用,linalcool、E-3-ocimene和2-heptanol對褐飛虱表現(xiàn)為引誘作用。稻虱纓小峰被證明能夠利用褐飛虱的化學(xué)信息素作為尋找寄主的信號(婁永根和程家安,1994;Louetal.,2001;LouandBaldwin,2003)。我們的研究發(fā)現(xiàn),褐飛虱2~3齡若蟲在遭遇天敵(如草間小黑蛛ErigonidiumgraminicolumSundvall)捕食時會釋放揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì),給同類昆蟲傳遞報警信號(李凱等,2013)。這些現(xiàn)象說明褐飛虱具有通過化學(xué)信息素在同種個體之間傳遞信號的能力,但相關(guān)的研究報道很少。本文在測定褐飛虱對同類昆蟲遇險釋放揮發(fā)性物質(zhì)的行為反應(yīng)的基礎(chǔ)上,進一步確定褐飛虱遇險釋放揮發(fā)性物質(zhì)的提取條件以及揮發(fā)性物質(zhì)的分離鑒定,其目的明確褐飛虱釋放揮發(fā)性物質(zhì)的最佳提取條件和化學(xué)成分,為褐飛虱防治尋找新的方法和途徑,也為褐飛虱化學(xué)生態(tài)學(xué)研究豐富新內(nèi)容。1材料和方法1.1材料表面1.1.1試驗水稻品種水稻品種為TN1,種子催芽后分期分批播種,至秧齡30~40d時,移栽至塑料盆缽中,7~10d后用于飼養(yǎng)褐飛虱。1.1.2褐飛病保蟲褐飛虱:采集田間種群的褐飛虱雌雄成蟲,用TN1稻苗繁殖,取2~3齡的褐飛虱若蟲用于試驗。草間小黑蛛:直接從稻田中采集草間小黑蛛成蛛用于試驗。1.1.3氣相色譜-質(zhì)譜條件“Y”型嗅覺儀:由“Y”型玻璃管、味源瓶(A、B)、Teflon連接管、標準空氣瓶、空氣加濕瓶、活性炭過濾裝置、空氣流量計、光源(日光燈)組成(圖1)?！癥”型管有兩個臂管和一個基管組成“Y”型,臂管長10cm,基管長15cm,管的直徑均為1.5cm,兩臂夾角75°?！癥”型管的兩臂管用Teflon管分別與味源瓶A和B的進出口相連,進口通過空氣加濕器與空氣過濾裝置連接到標準空氣瓶,“Y”型管的前上方放置日光燈作為光源,以保證兩臂管能獲得均勻的光照強度。提取裝置:包括2個500mL緩沖瓶和1個150mL緩沖瓶,中間用Teflon管聯(lián)接(圖2)。濃縮裝置:RV10數(shù)顯型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。固相微萃取柱(SPME):柱材料Polydimethylsiloxane(PDMS)與CarboxenTM/Polydimethylsiloxane(CAR/PDMS),購于sigmaAldrich。萃取裝置如圖3。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS):型號GCMS-QP2010,購于日本島津公司,毛細管柱型號RTX-5ms(30m×0.25mm,0.25μm)。有機溶劑:正己烷、甲醇、乙酸乙酯(購于華東醫(yī)藥股份有限公司)。1.2方法1.2.1成蛛中檢出物的提取如圖2所示,在中間的味源瓶內(nèi)放入500頭褐飛虱2~3齡若蟲與3頭草間小黑蛛成蛛,用70mL的正己烷、甲醇、乙酸乙酯分別提取“褐飛虱2~3齡若蟲+草間小黑蛛成蛛”所釋放的揮發(fā)物,在日光燈下連續(xù)提取5h,提取溫度設(shè)為25℃,用溶劑提取“褐飛虱2~3齡若蟲”和空白瓶作為對照。提取的溶劑用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮,將100mL溶劑濃縮至5mL左右,并貯藏到超低溫冰箱(-20℃)備用。1.2.2“y”型覺悟檢驗法在一團脫脂棉上滴2mL空白對照的溶劑萃取物,在另一團相同的脫脂棉上滴2mL“褐飛虱2~3齡若蟲+草間小黑蛛成蛛”揮發(fā)物的溶劑提取物,待溶劑揮發(fā)后分別放入圖1中的味源瓶A與味源瓶B內(nèi)作為氣味源,用“Y”型嗅覺儀檢測褐飛虱2~3齡若蟲對氣味源的行為反應(yīng),每次檢測30只,重復(fù)4次。判斷標準為:當褐飛虱若蟲始終停留在距離“Y”型管中心1cm內(nèi),沒有作出選擇的記為無反應(yīng),當褐飛虱若蟲進入超過臂管的5cm,并且停留1min以上者,記為褐飛虱若蟲對該臂氣味源做出了選擇,當褐飛虱若蟲由基管爬出的記為爬出基管。每測定5頭若蟲時更換同樣的“Y”型管,并用丙酮和雙蒸水清洗使用過的“Y”型管,高溫烘干,再用。1.2.3褐飛銻的成蟲對綠蛛成蛛的合成采用上述試驗中提取效果較好的有機溶劑來提取“褐飛虱2~3齡若蟲+3頭草間小黑蛛成蛛”的揮發(fā)物,其中褐飛虱2~3齡若蟲的蟲量設(shè)為100、300和600頭3個處理,提取物濃縮后用“Y”型嗅覺儀來檢測褐飛虱若蟲對其行為反應(yīng),重復(fù)4次。其它條件與實驗方法同1.2.2試驗。1.2.4褐飛保物的提取采用上述試驗中提取效果較好的有機溶劑、適宜蟲量來提取“褐飛虱若蟲+草間小黑蛛成蛛”的揮發(fā)物,提取時間設(shè)置為1、3、6h3個處理,提取物濃縮后用“Y”型嗅覺儀來檢測褐飛虱對其行為反應(yīng),重復(fù)4次。其它條件與實驗方法同1.2.2試驗。1.2.5草間小蛛成蛛的提取與測定采用上述實驗中提取效果較好的溶劑、適宜蟲量與適宜提取時間來提取“褐飛虱若蟲+草間小黑蛛成蛛”的揮發(fā)物,提取溫度設(shè)為15、25與35℃(即將裝有溶劑的緩沖瓶分別放在15、25與35℃條件下進行提取),提取物濃縮后用“Y”型嗅覺儀來檢測褐飛虱對其行為反應(yīng),重復(fù)4次。其它條件與實驗方法同1.2.2試驗。1.2.6柱身固相微萃取如圖3所示,在干凈的玻璃瓶內(nèi)分別放入乙酸乙酯提取的“褐飛虱2~3齡若蟲”揮發(fā)物和“褐飛虱2~3齡若蟲+草間小黑蛛成蛛”揮發(fā)物,對照為空白瓶味源,用錫箔紙封口,把以CAR/PDMS為柱材料的固相微萃取柱針端從瓶口插入,固相微萃取柱柱身用鐵夾固定,連續(xù)萃取3h,然后取出并在GC-MS中進行分析測定。進樣量為1mL。GC-MS條件如下:(1)氣相色譜:進口溫度:250℃;傳輸線溫度:載氣He;流量3mL/min,柱起始溫度40℃,保持1min,以5℃/min程序升溫到240℃,保持10min,不分流進樣,柱前壓:49.7kpa。(2)質(zhì)譜:接口溫度250℃,離子源溫度230℃,掃描范圍35~320amu,溶劑延遲2min。1.3不同味源的褐飛關(guān)于藥物數(shù)量的卡方檢驗利用MicrosoftOfficeExcel2007處理實驗數(shù)據(jù),并對選擇味源A的褐飛虱若蟲數(shù)量與選擇味源B的褐飛虱若蟲數(shù)量進行卡方檢驗,對基本不動和從基管爬出的褐飛虱若蟲不作分析。2結(jié)果與分析2.1褐飛銻的檢測用正己烷、甲醇、乙酸乙酯在室溫下分別提取“500頭褐飛虱2~3齡若蟲+3頭草間小黑蛛成蛛”復(fù)合體釋放的揮發(fā)性物質(zhì),連續(xù)提取5h,濃縮提取物并檢測褐飛虱若蟲對其行為反應(yīng),如圖4所示,正己烷與甲醇的提取物沒有引起褐飛虱的逃避行為,而乙酸乙酯的提取物引起了褐飛虱極顯著的逃避行為,因此乙酸乙酯對“褐飛虱+草間小黑蛛”產(chǎn)生的示警化合物有較好的提取能力,并且其揮發(fā)性比后者高。2.2草間小蛛成蛛數(shù)量對褐飛銻行為的影響用提取效果較好的乙酸乙酯在25℃提取“褐飛虱+草間小黑蛛”產(chǎn)生的揮發(fā)物,連續(xù)提取5h,2、3齡褐飛虱若蟲的數(shù)量分別設(shè)置100、300、600頭3組,草間小黑蛛成蛛的數(shù)量均為3頭,濃縮提取物并檢測褐飛虱對其行為反應(yīng),結(jié)果如圖5所示,褐飛虱的數(shù)量為100頭時,褐飛虱對提取物的行為反應(yīng)比300頭與600頭時差,而300頭與600頭褐飛虱數(shù)量差異不明顯。因此2、3齡褐飛虱若蟲數(shù)量在300頭以上提取效果較好。2.3褐飛銻提取時間對褐飛關(guān)于惡意程序的影響乙酸乙酯提取“300頭褐飛虱若蟲+草間小黑蛛成蛛”產(chǎn)生的揮發(fā)物,溫度設(shè)置在25℃,褐飛虱的數(shù)目為300頭,提取時間分別設(shè)置在1、3、6h,濃縮提取物并檢測褐飛虱對濃縮物的行為反應(yīng),如圖6所示,提取時間為1h時,提取物對褐飛虱的行為影響較弱,當提取時間增加到3h或6h時,效果較好。推測可能是由于褐飛虱被草間小黑蛛捕食時產(chǎn)生的示警化合物含量較低,在1h內(nèi)提取的量過小,再加上在濃縮、溶劑揮發(fā)過程中的損失,導(dǎo)致其濃縮物引起的褐飛虱反應(yīng)較弱。隨著提取時間的增加,褐飛虱被捕食的幾率也大大增加,溶劑提取物中的溶解的揮發(fā)物濃度也隨之增加。2.4乙酸乙酯溫度對褐飛保水性的影響用乙酸乙酯提取“300頭褐飛虱若蟲+3頭草間小黑蛛成蛛”的揮發(fā)物,提取時間為3h,將裝有乙酸乙酯的緩沖瓶分別放置在15、25與35℃下,濃縮提取物并用濃縮物來檢驗褐飛虱對其行為反應(yīng),結(jié)果如圖7所示,當溶劑溫度為15℃與25℃時提取物對褐飛虱的行為影響較大,當溫度升到35℃時效果變差,推測可能是由于乙酸乙酯溫度的提高導(dǎo)致目標揮發(fā)物的溶解能力減弱。2.5-己烯醛的質(zhì)譜性質(zhì)如圖8所示,與空白對照相比,在保留時間為16min、21.5min時“褐飛虱2~3齡若蟲”與“褐飛虱2~3齡若蟲+草間小黑蛛成蛛”的揮發(fā)物提取物出現(xiàn)新的峰,與空白對照和“褐飛虱2~3齡若蟲”相比,而保留時間為10.94min時,“褐飛虱2~3齡若蟲+草間小黑蛛成蛛”出現(xiàn)新的峰。推測在保留時間為10.94min出現(xiàn)的峰為褐飛虱2~3齡若蟲被草間小黑蛛成蛛捕食時產(chǎn)生的示警揮發(fā)物。這種成分的質(zhì)譜圖如圖9所示。將圖9所示的質(zhì)譜圖與圖10所示的2-己烯醛的質(zhì)譜圖相比較,它們相同的峰包括m/z41、m/z57、m/z69、m/z83、m/z98,圖9中m/z98之后的峰都非常弱,推測這種化合物具有與2-己烯醛相類似的化學(xué)結(jié)構(gòu),而且能夠在分子之間發(fā)生反應(yīng),生成分子量較高但不穩(wěn)定的化合物。已知(E)-2-己烯醛化合物在蝽象、蟑螂等昆蟲的報警信息素都有發(fā)現(xiàn)過,因此這種化合物或者其類似物很可能對褐飛虱也有報警作用,目前我們所分離到的這種化合物的實際結(jié)構(gòu),也需要進一步的實驗來確認。3在昆蟲報警信息素方面的應(yīng)用昆蟲信息素一般是分子量較小,容易揮發(fā)的化合物,它們由昆蟲外分泌腺產(chǎn)生并釋放到體外,這些化合物的鑒定工作需要濃聚大量的信息素成分,對于個體較大的昆蟲如蛾類等,可以直接切割它們產(chǎn)生信息素的腺體并浸入化學(xué)溶劑內(nèi)進行萃取(張慧艷,2007),但是對于個體較小的昆蟲如蚜蟲與薊馬,這種方法并不實用,對這類昆蟲通常所用的方法是用吸附劑直接吸收其產(chǎn)生的揮發(fā)物,方法可以借鑒push/pull揮發(fā)物收集系統(tǒng)(Verheggenetal.,2008),該系統(tǒng)由一個有空氣進出口的玻璃瓶來聚集昆蟲釋放的揮發(fā)物,將空氣從進口吹進玻璃瓶,從出口吹出,然后經(jīng)過吸附劑,經(jīng)過持續(xù)的吸附之后,吸附劑內(nèi)濃聚了玻璃瓶空氣中的揮發(fā)物。這種方法的關(guān)鍵是選擇合適的吸附劑(固體吸附劑或化學(xué)溶劑)和提取條件包括溫度、提取時間等(鄭浩等,2002;Verheggenetal.,2008)。本文結(jié)果表明,褐飛虱遇險釋放揮發(fā)性物質(zhì)的最佳提取條件:用乙酸乙酯提取“褐飛虱2~3齡若蟲+草間小黑蛛成蛛”揮發(fā)物,其中褐飛虱2~3齡若蟲密度為600頭,提取6h,溶劑溫度25℃。固相微萃取技術(shù)在昆蟲報警信息素的研究中已廣泛應(yīng)用,昆蟲釋放到體外的信息素利用固相微萃取柱直接萃取,再用氣相色譜與質(zhì)譜技術(shù)等進行分離鑒定。許多昆蟲如蜜蜂、螞蟻、椿象、蚜蟲、薊馬等的報警信息素得到鑒定,其成分多數(shù)是易揮發(fā)、不穩(wěn)定的小分子化合物,包括醇類、醛類、萜類、酮類、烴類、醛類化合物等(Bowersetal.,1972;H9lldoblerandWilson,1990;Huntetal.,2003;Wardleetal.,2003;Francisetal.,2005;Sˇobotniketal.,2008;Prudicetal.,2008;Sˇobotníketal.,2008;Robertetal,2010;Showalteretal.,2010;Kuwaharaetal.,2011;Vandermotenetal.,2012)。一些昆蟲在被天敵捕食時能夠產(chǎn)生一些揮發(fā)性的化合物向同類示警,這種現(xiàn)象在蚜蟲、薊馬等昆蟲中都有發(fā)現(xiàn),蚜蟲與薊馬都是從腹部末端產(chǎn)生黏性分泌物,這種分泌物除了有一定的防御作用外,還含有報警信息素成分,它們產(chǎn)生的報警信息素能夠引起其它群體成員的分散逃避、墜落等行為(Pickettetal.,1992;Kunertetal.,2010)。研究證明,褐飛虱能夠利用水稻釋放的揮發(fā)性物質(zhì)來選擇寄主(劉芳等,2002;徐濤等,2002;周強等,2003),說明褐飛虱具有利用化學(xué)信息素的功能結(jié)構(gòu)。因此,褐飛虱在被天敵捕食時可能產(chǎn)生向同類昆蟲示警的揮發(fā)性物質(zhì)。本文研究結(jié)果證實,褐飛虱在遭受草間小黑蛛捕食時,產(chǎn)生了新的揮發(fā)物,通過分析這種揮發(fā)物的質(zhì)譜圖,發(fā)現(xiàn)與2-己烯醛的質(zhì)譜圖相近,推測這類物質(zhì)具有一個烯基不飽和鍵與羰基不