中藥治療黃褐斑實驗小鼠模型的建立方法

黃褐斑是一種可見的色素沉著性疾病?，F(xiàn)實表現(xiàn)為面部皮膚或陽光下皮膚上有不規(guī)則的棕褐色斑點。本病通常發(fā)生在中年女性身上。一些男性也容易出現(xiàn)這種疾病，病史持續(xù)時間短，嚴重影響了患者的外在美好觀念和身心健康，并影響其心理和生活。黃褐斑的病因復雜,真正發(fā)病原因現(xiàn)在尚不清楚,主要致病因素有:激素失調(diào)、紫外線照射、情緒變化、遺傳因素和藥物影響等。由于黃褐斑發(fā)病機制的不明確,目前尚沒有療效確切的針對性藥物。因此建立更為系統(tǒng)、科學的動物模型,對中藥新藥的開發(fā)尤為重要。目前關于黃褐斑小鼠模型建立的研究國內(nèi)外均有報道,但仍處于探索階段,尚無公認的造模方法。本文將近幾年報道的關于黃褐斑小鼠模型造模方法的研究進行歸納總結,在此基礎上結合黃褐斑在臨床上最常見的證候分型之——肝郁型,為嘗試尋求建立更為系統(tǒng)、科學的體現(xiàn)中醫(yī)肝郁證的黃褐斑小鼠模型做一綜述。一、實驗結果及分析一般認為,目前影響黃褐斑形成的主要因素,可以歸納為以下兩部分:一是內(nèi)在因素(激素或內(nèi)分泌);二是外在因素(陽光照射、化妝品等)。根據(jù)以上理論,目前小鼠黃褐斑實驗動物模型的主要建立方法有:1.黃體酮全身攻擊法:國內(nèi)學者過偉峰等根據(jù)黃褐斑的發(fā)生與內(nèi)分泌紊亂有關以及目前通行的“雌激素和黃體酮增多進而刺激黑素細胞而致色素沉著”的發(fā)病學假說,用黃體酮攻擊雌性小鼠,使其內(nèi)分泌紊亂來建立黃褐斑小鼠模型。分別以人臨床劑量2倍、8倍黃體酮注射液注射于小鼠大腿根部1個月,以皮膚、肝臟組織中酪氨酸、丙二醛(MDA)含量變化及皮膚黑色素細胞病理形態(tài)學指標作為考察模型是否成功的依據(jù)。結果顯示,黃體酮高劑量組皮膚、肝臟酪氨酸含量與正常組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),其中肝臟酪氨酸含量與黃體酮低劑量比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);兩劑量組的肝臟MDA含量及高劑量組的皮膚MDA含量明顯升高,與正常組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),從而得出本方法建立的動物模型符合臨床黃褐斑患者生化指標的改變特征;鼠抗人單克隆抗體HMB45(melanoma黑素瘤)標記黑色素細胞的病理圖像學分析結果顯示,模型組表皮黑色素陽性目標的各項指標和正常組相比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。以上結果初步顯示,本方法建立的黃褐斑小鼠模型獲得成功。此后許多學者用本方法成功復制出了黃褐斑小鼠模型。2.紫外線照射法:有文獻報道,中波段的紫外線(UVB)能顯著引起黑色素的產(chǎn)生和沉積,Imokawa等應用中波紫外線照射對黑色素增多性皮膚病動物模型做了較詳細的研究,并運用中波紫外線造模的方法觀察了酪氨酸酶抑制劑對黑色素細胞數(shù)量和含量的影響,證實了采用紫外線照射用于黑素增多性皮膚病動物模型研究的可行性。國內(nèi)學者潘揚等通過對相關文獻的分析,發(fā)現(xiàn)過度日光照射是發(fā)生黃褐斑的重要因素,長期中波紫外線(波長320～275nm)照射可使黑色素細胞增殖,并提高黑色素細胞的活性。其根據(jù)這一誘發(fā)假說,通過中波紫外線(波長320nm)照射雌性純白豚鼠1個月,擬通過紫外線照射使黑色素細胞增殖及增加黑色素細胞酪氨酸的量來建立黃褐斑實驗動物模型。以皮膚黑色素細胞病理形態(tài)學指標及皮膚和肝臟組織酪氨酸、超氧化物歧化酶(SOD)、MDA含量變化作為考察模型是否成功的依據(jù)。結果顯示,模型組與正常組相比較,皮膚和肝臟組織酪氨酸、MDA含量顯著升高(P<0.01),SOD活性顯著降低(P<0.01);用HMB45為第一抗體,以ElivisionTMplus免疫組化方法顯示表皮中的黑色素顆粒陽性目標,經(jīng)計算機進行圖像的定量分析,陽性目標的各項指標(目標面積除外)和正常組相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),因此認為用紫外線照射攻擊雌性豚鼠可用于復制黃褐斑動物實驗模型。李英姿等將此方法運用到小鼠動物模型的建立上,以波長為320nm的中波紫外線(UVB)每日照射小鼠1次,照射時間60min,連續(xù)照射并觀察小鼠脫毛部位的變化情況。結果顯示,小鼠皮膚經(jīng)過紫外線的照射后,模型組小鼠皮膚中的SOD活性和MDA含量與空白組相比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),其中SOD活性顯著下降,MDA含量顯著升高;小鼠皮膚組織形態(tài)學觀察顯示,模型組小鼠表皮層中的角化層增厚,表皮基底細胞層黑色素細胞增多。其用此方法成功復制了黃褐斑小鼠模型,并探討了黑龍江省中醫(yī)藥管理局2006年立項課題——二花鮮汁膜治療黃褐斑的實驗研究。姜醒等用本方法復制黃褐斑小鼠模型,將小鼠放在SS-03P型光療儀燈具正下方的20cm處,紫外線劑量設定為120μW·cm-2,照射時間為20min·d-1,連續(xù)照射8周。結果顯示,與空白組相比較,模型組的皮膚和血清中的SOD活性顯著降低,MDA含量顯著升高(P<0.01)。以上結果初步顯示,該方法可成功的復制黃褐斑小鼠模型。二、建立多因素黃斑肝郁證模型具有中醫(yī)證候—肝郁證的黃褐斑小鼠模型的建立,目前所用主要方法為在上述黃褐斑小鼠模型建立的基礎上,外加束縛刺激的方法從而建立黃褐斑肝郁證小鼠模型。王霞靈和周大橋通過測定肝郁患者血清中雌激素活性最強的E2的含量,結果顯示凡有肝郁證者,其血清中E2的含量均有不同程度的升高,說明肝郁證可造成激素水平的改變,從而造成黃褐斑的發(fā)生,故刺激實驗動物模型造成肝郁證也是黃褐斑模型的重要方法之一。汪南玥等認為,內(nèi)分泌失調(diào)是黃褐斑發(fā)生的主要原因,紫外線照射是加重期發(fā)病的重要因素,并考慮到黃褐斑發(fā)病在中醫(yī)臨床辨證中以肝郁證為多見,因此建立多因素黃褐斑肝郁證模型更為科學。其建立模型的方法為小鼠內(nèi)用黃體酮全身攻擊、外用UVB紫外線局部照射30min的同時進行束縛造模小鼠肝郁證,造模時間為45d,并與現(xiàn)有的小鼠黃褐斑模型(黃體酮注射、紫外線照射+束縛、黃體酮注射+束縛組)進行比較。以皮膚中MDA含量、SOD活性變化以及黑色素細胞是否增加作為模型評價標準,同時觀察小鼠肝郁證的行為學表現(xiàn)。其結果顯示黃體酮注射+紫外線照射+束縛組中HMB45標記的黑色素陽性細胞明顯增多,成簇分布于毛囊基底細胞團中,呈強陽性反應,與空白組相比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);該組皮膚和肝臟中的SOD活性與空白組相比較顯著降低(P<0.05),肝臟中MDA的含量顯著升高(P<0.05)。此結果提示,與其他造模方法相比較,這種造模法對于小鼠皮膚、肝臟MDA含量、SOD的活性影響最大。在行為學觀察方面,曠場實驗結果顯示,黃體酮注射+紫外線照射+束縛組、紫外線照射+束縛組、黃體酮注射+束縛組各組的穿格次數(shù)、直立次數(shù)、理毛時間、理毛次數(shù)均較空白組有所減少,差異有統(tǒng)計學意義,提示慢性束縛45d后的小鼠出現(xiàn)了肝郁證的現(xiàn)象;甩尾實驗結果顯示,黃體酮注射+紫外線照射+束縛組及紫外線照射+束縛組甩尾時間均較空白組長,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);體質量增加結果顯示,束縛組較空白組的體質量增加量明顯減少,進一步提示慢性束縛法導致小鼠肝郁證后對體質量增加的影響。綜上結果說明,采用慢性束縛造肝郁證,同時內(nèi)用黃體酮全身攻擊、外用UVB紫外線局部照射建立的多因素致黃褐斑肝郁證小鼠模型是成功的,且更加接近人黃褐斑病變。三、復制出黃斑肝郁證小鼠模型現(xiàn)在中藥新藥的研發(fā),需要具有中醫(yī)特點的能夠進行中醫(yī)證候分型的動物模型,所以動物模型的標準化研究,是現(xiàn)在中醫(yī)藥及動物行為學界研究的一個熱點。黃褐斑肝郁證小鼠模型的建立,文獻為國內(nèi)首次報道,但是在動物模型分組及小鼠肝郁證評價方面還有待完善。肝氣郁證大鼠模型的建立方法為本課題組首創(chuàng),利用動物四肢束縛的方法妨礙其自由活動,以稍能活動、取食為度,成功復制出了肝氣郁證大鼠模型。筆者擬將此方法應用到黃褐斑小鼠模型當中并加以適當改進,將小鼠進行黃褐斑造模的同時放入小鼠束縛筒中,在其自由呼吸的前提下限制其自由活動,然后用動物行為學領域經(jīng)典的評價方法,如曠場、糖水偏好、懸尾、強迫游泳等進行系統(tǒng)的評價,來考察黃褐斑小鼠模型在肝郁證方面具體的行為學表現(xiàn)變化;應同時設置黃體酮+紫外線組,以便與黃體酮+紫外線+束縛組進行比較,這樣更加嚴謹?shù)恼f明了黃