高效液相色譜法第七章

目錄CONTENTS01基礎(chǔ)知識(shí)02高效液相色譜儀組成與部件03基本操作及日常維護(hù)04實(shí)用分析技術(shù)05實(shí)訓(xùn)十二阿司匹林腸溶片的含量測(cè)定06實(shí)訓(xùn)十三維生素K1注射液的含量測(cè)定案例導(dǎo)入

近些年，越來(lái)越多的藥物研究人員發(fā)現(xiàn)，在生產(chǎn)制作藥品時(shí)經(jīng)常會(huì)不小心添加一些雜質(zhì)，雖不會(huì)降低其藥效，但卻直接影響了消費(fèi)者的權(quán)益，對(duì)此，相關(guān)部門(mén)及人員應(yīng)當(dāng)注重藥物中雜質(zhì)的檢測(cè)工作。而高效液相色譜儀對(duì)藥物雜質(zhì)檢測(cè)有重大現(xiàn)實(shí)意義。高效液相色譜儀的快速發(fā)展為藥品質(zhì)量提供了有效的保證?；A(chǔ)知識(shí)第一節(jié)011.能說(shuō)出高效液相色譜法的原理和應(yīng)用。2.能說(shuō)出高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)。3.能說(shuō)出化學(xué)鍵合相色譜、反相離子對(duì)色譜分離原理以及高效液相色譜定性和定量方法。4.能說(shuō)出常用高效液相色譜的分類(lèi)。學(xué)習(xí)目標(biāo)高效液相色譜法是20世紀(jì)60年代末期，在經(jīng)典液相色譜法基礎(chǔ)上，引入氣相色譜的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以高壓輸送流動(dòng)相，采用高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器發(fā)展而成的現(xiàn)代液相色譜分析方法。HPLC采用顆粒極細(xì)（＜10μm）的高效填料以高壓勻漿裝柱，柱效大大高于經(jīng)典液相色譜法，且安裝好的柱可反復(fù)使用；HPLC采用高壓泵輸送流動(dòng)相，分析速度快，同時(shí)柱后連有高靈敏度的檢測(cè)器，可對(duì)流出物連續(xù)檢測(cè)，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且所需試樣少，微升數(shù)量級(jí)的試樣足以進(jìn)行全分析。概述011.高效液相色譜法的概念概述01(1)高效(2)高速(3)高靈敏度(4)適用范圍廣(5)流動(dòng)相選擇范圍寬1.高效液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)高效液相色譜法的分類(lèi)與經(jīng)典液相色譜法的分類(lèi)基本相同。按固定相的聚集狀態(tài)可分為液-固色譜法（LSC）和液-液色譜法（LLC）兩大類(lèi)；按分離機(jī)制的不同可分為吸附色譜法、分配色譜法、離子交換色譜法、分子排阻色譜法、親合色譜法、離子色譜法、膠束色譜法、手性色譜法、電色譜法等。本章依據(jù)藥品食品分析檢驗(yàn)的實(shí)際情況，著重介紹最常用的化學(xué)鍵合相色譜法和反相離子對(duì)色譜法。常用高效液相色譜分類(lèi)及原理02分類(lèi)1、化學(xué)鍵合色譜法化學(xué)鍵合相色譜法（簡(jiǎn)稱(chēng)鍵合相色譜法，BPC)由液-液分配色譜法發(fā)展而來(lái)。液-液分配色譜法的固定相是將固定液涂漬在載體表面構(gòu)成，其缺點(diǎn)是固定液容易被流動(dòng)相漸漸溶解而流失，所以流動(dòng)相的流速不能高，也不能采用梯度洗脫，柱的重復(fù)性、穩(wěn)定性不好。為了解決這些問(wèn)題而發(fā)展了化學(xué)鍵合相，它是將固定液利用化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面上，使其形成均一、牢固的單分子薄層而構(gòu)成的固定相，簡(jiǎn)稱(chēng)鍵合相，是目前使用最廣泛的一種固定相。采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱(chēng)為化學(xué)鍵合相色譜。常用高效液相色譜分類(lèi)及原理02鍵合了可交換離子基團(tuán)的固定相，包括可交換陰離子的基團(tuán)（如氨基、季銨鹽等）和可交換陽(yáng)離子的基團(tuán)（如磺酸基等）。

鍵合后帶氨基、氰基、醚基、醇基等極性基團(tuán)的固定相。極性鍵合相非極性鍵合相用不同鏈長(zhǎng)的烷基，如辛烷基、十八烷基、甲基、苯基等鍵合得到的固定相。離子型鍵合相常用高效液相色譜分類(lèi)及原理02化學(xué)鍵合類(lèi)型反相鍵合相色譜法的固定相極性比流動(dòng)相極性弱，固定相常采用非極性鍵合相，反相鍵合相色譜法的分離機(jī)制十分復(fù)雜，目前說(shuō)法不一，現(xiàn)被人們接受較多的是其中的“疏溶劑作用理論”。

反相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法正相鍵合相色譜法的固定相極性比流動(dòng)相極性強(qiáng)，固定相采用極性鍵合相，其分離原理類(lèi)似于液液分配色譜，即把有機(jī)鍵合層看作一層液膜，組分在兩相間進(jìn)行分配，極性強(qiáng)的組分分配系數(shù)（k）大，保留時(shí)間（tR）長(zhǎng)，后出色譜柱。常用高效液相色譜分類(lèi)及原理02分離原理2、反相離子對(duì)色譜法反相離子對(duì)色譜法(RPIC)是離子對(duì)萃取技術(shù)與反相色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物，是分析有機(jī)酸、堿的極好方法。常用高效液相色譜分類(lèi)及原理02

反相離子對(duì)色譜法是在反相色譜法中，將一種或多種與被測(cè)離子電荷相反的離子（稱(chēng)為對(duì)離子或反離子）加到極性流動(dòng)相中，使其與被測(cè)離子結(jié)合，形成疏水性（中性或弱極性）的離子對(duì)締合物。例如，有一反相離子對(duì)色譜系統(tǒng)，其固定相是非極性鍵合相（如ODS），流動(dòng)相為水溶液，并在其中加入一種與待測(cè)組分離子A-相反離子B+，B+由于帶靜電引力與帶負(fù)電荷的A-生成離子對(duì)化合物A-B+。生成離子對(duì)反應(yīng)式如下：由于離子對(duì)化合物具有疏水性，因而被非極性固定相（有機(jī)相）萃取，進(jìn)入固定相被保留。根據(jù)待測(cè)組分離子的性質(zhì)不同、反離子形成離子對(duì)的能力不同和形成離子對(duì)疏水性的不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時(shí)間的不同，因而出色譜柱先后不同，實(shí)現(xiàn)分離。（1）分離機(jī)制常用高效液相色譜分類(lèi)及原理02分離陽(yáng)離子的反離子試劑有烷基磺酸鹽類(lèi)，如己烷磺酸鈉和十二烷基磺酸鈉等，適用于分析有機(jī)堿和有機(jī)陽(yáng)離子。分析陰離子的反離子試劑有季銨鹽類(lèi)，如四丁基季銨鹽、十六烷基三甲基季銨鹽、四丁基胺磷酸鹽等，常用于分析有機(jī)酸和有機(jī)陰離子。（2）常用離子對(duì)試劑常用高效液相色譜分類(lèi)及原理02

反相離子對(duì)色譜法的固定相常用ODS等非極性固定相；流動(dòng)相一般在甲醇－水或乙腈－水體系中加入適量離子對(duì)試劑，并用緩沖液調(diào)至合適的pH，也可采用梯度洗脫。分離有機(jī)堿的pH一般為3~3.5；分離有機(jī)酸的pH一般在7.5左右。反相離子對(duì)色譜法操作簡(jiǎn)單，通過(guò)改變流動(dòng)相的pH、離子濃度和種類(lèi)，能在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，但離子對(duì)試劑較貴。（3）固定相與流動(dòng)相常用高效液相色譜分類(lèi)及原理02高效液相色譜儀組成與部件第一節(jié)021.能說(shuō)出高效液相色譜儀的主要組成部分及流程。2.能完成梯度洗脫裝置、六通閥進(jìn)樣器、自動(dòng)進(jìn)樣器、色譜柱類(lèi)型及填充劑的選擇。3.能說(shuō)出通用型檢測(cè)器、選擇性檢測(cè)器的結(jié)構(gòu)。學(xué)習(xí)目標(biāo)高效液相色譜儀主要由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)系統(tǒng)、數(shù)據(jù)記錄和處理系統(tǒng)這五部分模塊化組合而成，此外還可配有梯度洗脫裝置、組分收集裝置、色譜柱恒溫裝置、在線(xiàn)脫氣裝置和色譜工作站。高效液相色譜儀高效液相色譜儀輸液系統(tǒng)01（1）儲(chǔ)液器（2）高壓輸液泵（3）梯度洗脫裝置

輸液系統(tǒng)由儲(chǔ)存流動(dòng)相的儲(chǔ)液器（通常是帶蓋的玻璃瓶）、高壓輸液泵和梯度洗脫裝置三個(gè)部分組成，以下具體講述高壓輸液泵和梯度洗脫裝置。輸液系統(tǒng)1、高壓輸液泵高壓輸液泵是高效液相色譜儀中用來(lái)實(shí)施流動(dòng)相輸送功能的儀器，應(yīng)耐壓、耐腐蝕、密封性好、無(wú)脈動(dòng)或脈動(dòng)極小，以保證輸出的流動(dòng)相具有恒定的流速。泵的種類(lèi)按輸液特性可分為恒壓泵和恒流泵。輸液系統(tǒng)012、梯度洗脫裝置梯度洗脫裝置的作用是把兩種或兩種以上的不同極性的溶劑，按一定程序連續(xù)改變比例配制成所需的淋洗液，注入色譜柱中，以達(dá)到高速分離的目的。作用：將試樣引入色譜柱（1）手動(dòng)進(jìn)樣（2）自動(dòng)進(jìn)樣進(jìn)樣系統(tǒng)02進(jìn)樣系統(tǒng)六通閥進(jìn)樣器程序控制器或計(jì)算機(jī)的控制1、六通閥進(jìn)樣器六通閥載樣時(shí)，將閥手柄處于載樣“LOAD”位置（流動(dòng)相不經(jīng)定量管管路流入色譜柱），用微量注射器將試樣注入定量管。進(jìn)樣時(shí)，轉(zhuǎn)動(dòng)六通閥手柄至進(jìn)樣“INJECT”位置，定量環(huán)內(nèi)的試樣被流動(dòng)相帶入色譜柱，進(jìn)樣體積由定量管的體積嚴(yán)格控制，因此進(jìn)樣量的準(zhǔn)確性和重復(fù)性好。為了確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度，微量注射器取的試樣必須大于定量環(huán)的容積（定量環(huán)體積可按需更換），多出體積由廢液管排出。進(jìn)樣系統(tǒng)012、自動(dòng)進(jìn)樣器在預(yù)先編制好的進(jìn)樣程序控制下，抬起采樣針，機(jī)械手從樣品架上抓取樣品瓶放上針座，采樣針插入樣品瓶，吸樣計(jì)量泵開(kāi)啟，吸取一定體積的樣品后，抬起采樣針，機(jī)械手移走樣品瓶并將其放回原處，采樣針插入進(jìn)樣座，轉(zhuǎn)動(dòng)六通閥，由流動(dòng)相將樣品管中樣品帶入色譜柱。自動(dòng)進(jìn)樣器同時(shí)還能用溶劑自動(dòng)清洗進(jìn)樣器。有的自動(dòng)進(jìn)樣裝置還帶有溫度控制系統(tǒng)，適用于需低溫保存的試樣。進(jìn)樣系統(tǒng)01自動(dòng)進(jìn)樣器工作原理高效液相色譜儀的分離系統(tǒng)主要部件是色譜柱和柱溫箱。色譜柱是色譜儀的分離中心，其由柱管、固定相、過(guò)濾片、填充劑等組成。柱管由不銹鋼制成，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度，能承受高壓，對(duì)流動(dòng)相呈化學(xué)惰性。按主要用途可分為分析型柱與制備型柱兩類(lèi)。柱溫箱可調(diào)控色譜柱溫度，保證色譜分離時(shí)溫度恒定。分離系統(tǒng)03分離系統(tǒng)色譜柱柱溫箱臨床應(yīng)用高效液相色譜儀的檢測(cè)器是反映色譜過(guò)程中被測(cè)組分濃度或質(zhì)量隨時(shí)間變化的部件。04檢測(cè)系統(tǒng)通用性檢測(cè)器①蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的運(yùn)作原理基于光線(xiàn)通過(guò)微小粒子時(shí)會(huì)產(chǎn)生光散射的現(xiàn)象。由色譜柱分離的組分隨著流動(dòng)相進(jìn)入噴霧器中，被高速的載氣流噴成一種薄霧，進(jìn)入霧化室霧化后，再進(jìn)入蒸發(fā)室，經(jīng)過(guò)加熱的漂移管蒸發(fā)除去流動(dòng)相，試樣組分形成氣溶膠，進(jìn)入檢測(cè)室。檢測(cè)室由一個(gè)激光光源和一個(gè)光二極管檢測(cè)器構(gòu)成，用激光照射檢測(cè)室中的氣溶膠產(chǎn)生散射，用光二極管檢測(cè)器測(cè)定散射光強(qiáng)而獲得組分的濃度信號(hào)。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器臨床應(yīng)用04檢測(cè)系統(tǒng)通用性檢測(cè)器②示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器是利用連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中溶液的折射率之差來(lái)測(cè)定樣品濃度的檢測(cè)器。樣品濃度低時(shí)，溶有試樣的流動(dòng)相和純流動(dòng)相的折射率差值可指示樣品在流動(dòng)相中的濃度。示差折光檢測(cè)器臨床應(yīng)用04檢測(cè)系統(tǒng)選擇性檢測(cè)器①紫外檢測(cè)器紫外檢測(cè)器的測(cè)定原理基于被分析組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光的選擇性吸收，其吸收度與組分濃度的關(guān)系服從朗伯－比爾定律。優(yōu)

：靈敏度、精密度及線(xiàn)性范圍都較好，也不易受溫度和流速的影響，可用于梯度洗脫。缺

：只能檢測(cè)有紫外吸收的組分，對(duì)于流動(dòng)相的選擇有一定的限制，檢測(cè)波長(zhǎng)必須大于流動(dòng)相截止波長(zhǎng)。紫外檢測(cè)器臨床應(yīng)用04檢測(cè)系統(tǒng)選擇性檢測(cè)器②熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)器的原理是當(dāng)某些溶液受紫外光照射后，能吸收紫外光而處于不穩(wěn)定的激發(fā)狀態(tài)，緊接著輻射出比紫外光波更長(zhǎng)的光線(xiàn)，即熒光。在被測(cè)溶質(zhì)濃度較低時(shí)，溶質(zhì)受激發(fā)而發(fā)生的熒光強(qiáng)度與被測(cè)溶質(zhì)的濃度成正比關(guān)系。優(yōu)

：高靈敏度、高選擇性。臨床應(yīng)用04檢測(cè)系統(tǒng)選擇性檢測(cè)器③電化學(xué)檢測(cè)器廣義上來(lái)看，電化學(xué)檢測(cè)器包括四種類(lèi)型：介電型、電導(dǎo)型、電位型、安培型。電化學(xué)檢測(cè)器有對(duì)流動(dòng)相限制較嚴(yán)格、電極污染常造成重現(xiàn)性差等缺點(diǎn)，所以，常用于檢測(cè)那些沒(méi)有紫外吸收，也不產(chǎn)生熒光，但有電極活性的物質(zhì)。數(shù)據(jù)處理和記錄系統(tǒng)02數(shù)據(jù)處理和記錄系統(tǒng)高效液相色譜儀的數(shù)據(jù)處理和記錄由計(jì)算機(jī)完成，利用色譜工作站采集、分析色譜數(shù)據(jù)和處理色譜圖，給出峰寬、峰高、峰面積、對(duì)稱(chēng)因子、容量因子、分離度等色譜參數(shù)；也可反控色譜儀各個(gè)模塊組件。基本操作及日常維護(hù)第一節(jié)031.能掌握高效液相色譜儀使用操作技術(shù)。2.能說(shuō)出高效液相色譜儀日常維護(hù)要求。3.能完成高效液相色譜儀故障排查。學(xué)習(xí)目標(biāo)1.流動(dòng)相(1)溶劑的純化分析純和色譜純?nèi)芤涸诤芏嗲闆r下可以滿(mǎn)足色譜分析的要求，但不同的色譜柱和檢測(cè)方法對(duì)溶劑的要求不同，如用紫外檢測(cè)器檢測(cè)時(shí)，溶劑中就不能含有在檢測(cè)波長(zhǎng)下有吸收的雜質(zhì)。而分析純和色譜純（HPLC級(jí)）在紫外檢測(cè)器中吸光度有明顯差異。目前專(zhuān)供色譜分析用的“色譜純”溶劑除最常用的甲醇外，其余多為分析純，因此，有時(shí)要進(jìn)行除去紫外雜質(zhì)、脫水、重蒸等純化操作。基本操作及日常維護(hù)1.流動(dòng)相基本操作及日常維護(hù)分析純級(jí)(實(shí)線(xiàn)）和HPLC級(jí)溶劑（虛線(xiàn)）的吸光度比較1.流動(dòng)相(2)流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相中的各種殘留氣泡都會(huì)給分離帶來(lái)以下負(fù)面的影響：①氣泡進(jìn)入檢測(cè)器后會(huì)引起檢測(cè)信號(hào)的突然變化，在色譜圖上出現(xiàn)尖銳的噪聲峰；②小氣泡慢慢聚集后會(huì)變成大氣泡，大氣泡進(jìn)入流路或色譜柱中會(huì)使流動(dòng)相的流速變慢或不穩(wěn)定，致使基線(xiàn)起伏；③溶解在流動(dòng)相中的氧氣常和一些溶劑結(jié)合生成有紫外吸收的化合物，在熒光檢測(cè)中，溶解氧還會(huì)使熒光淬滅；④溶解氣體也有可能引起某些樣品的氧化降解或使其溶解從而導(dǎo)致pH發(fā)生變化。因此，流動(dòng)相在使用前必須進(jìn)行脫氣處理，以除去其中溶解的氣體（如氧氣）來(lái)消除其所產(chǎn)生的影響?；静僮骷叭粘＞S護(hù)1.流動(dòng)相(2)流動(dòng)相的脫氣目前，液相色譜流動(dòng)相脫氣使用較多的方法有超聲波振蕩脫氣、惰性氣體鼓泡吹掃脫氣以及在線(xiàn)（真空）脫氣裝置三種?；静僮骷叭粘＞S護(hù)該法操作簡(jiǎn)便，又基本能滿(mǎn)足日常分析的要求適用于所有的溶劑，脫氣效果較好可同時(shí)對(duì)多個(gè)流動(dòng)相溶劑進(jìn)行脫氣超聲波振蕩脫氣惰性氣體鼓泡吹掃脫氣在線(xiàn)（真空）脫氣1.流動(dòng)相(3)流動(dòng)相的過(guò)濾過(guò)濾是為了防止不溶物堵塞流路或色譜柱入口處的微孔墊片。嚴(yán)格地講，流動(dòng)相都應(yīng)該采用特殊的流動(dòng)相過(guò)濾器，用0.45μm以下微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾后才可使用?；静僮骷叭粘＞S護(hù)流動(dòng)相過(guò)濾器微孔濾膜1.流動(dòng)相(4)流動(dòng)相的更換在分析過(guò)程中，有時(shí)需要更換流動(dòng)相進(jìn)行分析。一定要注意前一種使用的流動(dòng)相和所更換的流動(dòng)相是不是能夠相溶。如果前一種使用的流動(dòng)相和所更換的流動(dòng)相不能夠相溶，則需要采用一種與這兩種需更換的流動(dòng)相都能夠相溶的流動(dòng)相進(jìn)行過(guò)渡、清洗。較為常用的過(guò)渡流動(dòng)相為異丙醇，但實(shí)際操作中要視具體情況而定，原則就是采用與這兩種需更換的流動(dòng)相都能夠相溶的過(guò)渡流動(dòng)相。一般清洗的時(shí)間為30~40分鐘，直至系統(tǒng)完全穩(wěn)定?；静僮骷叭粘＞S護(hù)2.儲(chǔ)液器完全由HPLC級(jí)溶劑組成的流動(dòng)相不必過(guò)濾，其他溶劑在使用前都應(yīng)用0.45μm的濾膜過(guò)濾后才可使用，以保持儲(chǔ)液器的清潔。過(guò)濾器使用3~6個(gè)月后或出現(xiàn)阻塞現(xiàn)象時(shí)要及時(shí)進(jìn)行清洗，如果清洗無(wú)法解決故障，需要更換新的線(xiàn)路過(guò)濾器，以保證儀器正常運(yùn)行和溶劑的質(zhì)量。用普通溶劑瓶作流動(dòng)相儲(chǔ)液器時(shí)應(yīng)不定期廢棄瓶子（如每月一次），買(mǎi)來(lái)的專(zhuān)用儲(chǔ)液器也應(yīng)定期用酸、水和溶劑清洗（最后一次清洗應(yīng)選用HPLC級(jí)的水或有機(jī)溶劑）?；静僮骷叭粘＞S護(hù)3.輸液泵用高質(zhì)量試劑和HPLC級(jí)溶劑，在進(jìn)入儀器前用0.45μm膜過(guò)濾，并進(jìn)行脫氣處理。每天開(kāi)始使用時(shí)放空排氣。如用緩沖溶液作流動(dòng)相，在使用前必須過(guò)濾，工作結(jié)束后從泵中用含量較高的超純水或去離子水以1mL/min的流量沖洗30~60分鐘，洗去系統(tǒng)中的鹽，然后用純甲醇沖洗30分鐘。注：緩沖鹽遇到有機(jī)溶劑會(huì)析出鹽結(jié)晶，造成嚴(yán)重阻塞，因此不能直接用有機(jī)溶劑沖洗緩沖鹽溶液。不讓水或腐蝕性溶劑滯留泵中。定期更換墊圈，平時(shí)應(yīng)常備泵密封墊、單向閥、泵頭裝置、各式接頭、保險(xiǎn)絲等部件和工具?；静僮骷叭粘＞S護(hù)4.進(jìn)樣器對(duì)六通閥進(jìn)樣器而言，保持清潔和裝置完好可延長(zhǎng)閥的使用壽命，用溶劑沖洗進(jìn)樣口時(shí)應(yīng)該在進(jìn)樣位置進(jìn)行。進(jìn)樣前應(yīng)使樣品混合均勻，以保證結(jié)果的精確度。進(jìn)樣應(yīng)使用液相色譜專(zhuān)用平頭進(jìn)樣針。進(jìn)樣時(shí)，進(jìn)樣針應(yīng)插入針導(dǎo)管到底。不使用手動(dòng)進(jìn)樣器時(shí)將針頭留在進(jìn)樣器內(nèi)。樣品瓶應(yīng)清洗干凈，無(wú)可溶解的污染物。自動(dòng)進(jìn)樣器的針頭應(yīng)有鈍化斜面，側(cè)面開(kāi)孔。針頭一旦彎曲應(yīng)該換上新針頭，不能弄直了繼續(xù)使用。吸液時(shí)針頭應(yīng)沒(méi)入樣品溶液中，但不能碰到樣品瓶底?；静僮骷叭粘＞S護(hù)4.進(jìn)樣器為了防止緩沖鹽和其他殘留物留在進(jìn)樣系統(tǒng)中，每次工作結(jié)束后應(yīng)用專(zhuān)用進(jìn)樣口清洗器沖洗整個(gè)系統(tǒng)。具體清洗流程如下：（1）將進(jìn)樣口清洗器裝在注射器上。（2）用注射器吸入清洗液（試樣溶液或者不含鹽的流動(dòng)相等）。（3）在進(jìn)樣（INJECT）狀態(tài)下，將進(jìn)樣口清洗器壓接在針導(dǎo)管上，注入清洗液約1mL。（4）使用緩沖溶液后，用純化水清洗流路和針導(dǎo)管。（5）不能使用微型注射器清洗手動(dòng)進(jìn)樣器。（6）緩慢推壓注射器，以免引起清洗液反噴?；静僮骷叭粘＞S護(hù)5.色譜柱死體積可能會(huì)引起分離度變差和重現(xiàn)性變差等問(wèn)題，因此要注意色譜柱的規(guī)范安裝，確保無(wú)死體積的產(chǎn)生。基本操作及日常維護(hù)色譜柱的安裝5.色譜柱在進(jìn)樣閥后加流路過(guò)濾器(0.5μm燒結(jié)不銹鋼片），擋住來(lái)源于樣品和進(jìn)樣閥墊圈的微粒。在流路過(guò)濾器和分析柱之間加上保護(hù)柱，收集阻塞柱進(jìn)口的、來(lái)自樣品的、會(huì)降低柱效能的化學(xué)“垃圾”；保護(hù)柱是易耗品，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有備用保護(hù)柱?；静僮骷叭粘＞S護(hù)保護(hù)柱5.色譜柱色譜柱應(yīng)避免突然變化分離條件，注意流速、柱溫、梯度的變化幅度。色譜柱應(yīng)在要求的pH范圍和柱溫范圍下使用，應(yīng)使用不損壞柱的流動(dòng)相。進(jìn)樣前應(yīng)將樣品進(jìn)行必要的凈化，以免進(jìn)樣后對(duì)色譜柱造成損傷。每次工作結(jié)束后，應(yīng)用強(qiáng)溶劑（如甲醇、乙腈等）沖洗色譜柱。使用緩沖鹽后，要先用10%甲醇的水溶液沖洗，再用有機(jī)溶劑沖洗。流動(dòng)相正相反相轉(zhuǎn)換時(shí)用異丙醇過(guò)渡。新色譜柱使用前最好用強(qiáng)溶劑在低流量下(0.2~0.3mL/min)沖洗30分鐘，長(zhǎng)時(shí)間未用的分析柱也要同樣處理，并封閉儲(chǔ)存在惰性溶劑（如甲醇）中?；静僮骷叭粘＞S護(hù)實(shí)用分析技術(shù)第一節(jié)041.能選擇合適的液相色譜固定相、流動(dòng)相。2.能說(shuō)出高效液相色譜的分析方法。01實(shí)訓(xùn)目的效液相色譜法的各種方法有其各自的特點(diǎn)與應(yīng)用范圍，應(yīng)根據(jù)分離分析的目的、樣品的性質(zhì)和含量、現(xiàn)有的設(shè)備條件等選擇合適的方法。分離類(lèi)型應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)（如相對(duì)分子質(zhì)量的大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶解性及極性等）來(lái)選擇，并據(jù)此選擇色譜柱和流動(dòng)相。2.分離方法的選擇1.樣品的性質(zhì)分析樣品中待測(cè)組分的相對(duì)分子質(zhì)量大小、化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶解性等化學(xué)、物理性質(zhì)決定著色譜分離類(lèi)型的選擇。實(shí)驗(yàn)條件的選擇01高效液相色譜法不同的分離目的對(duì)檢測(cè)器的要求不盡相同。針對(duì)分離分析，理想的檢測(cè)器應(yīng)僅對(duì)所測(cè)組分產(chǎn)生靈敏的響應(yīng)，而其他組分均不出峰；針對(duì)制備分離，則檢測(cè)器的靈敏度不必很高，最好使用通用型檢測(cè)器。4.檢測(cè)器的選擇3.流動(dòng)相的選擇在液相色譜分析中，流動(dòng)相的種類(lèi)、配比對(duì)色譜分離效果影響很大，而可供選擇的固定相填料種類(lèi)較少，因此流動(dòng)相的選擇非常重要。實(shí)驗(yàn)條件的選擇011.定性鑒定技術(shù)高效液相色譜法的定性分析方法大體可分為色譜鑒定法和兩譜聯(lián)用鑒定法。(1)色譜鑒定法色譜鑒定法是將純物質(zhì)和樣品的保留時(shí)間或相對(duì)保留時(shí)間相互對(duì)照，進(jìn)行定性分析，方法雖簡(jiǎn)單粗糙，但仍是已知物質(zhì)常用的鑒別方法。(2)兩譜聯(lián)用鑒定法兩譜聯(lián)用鑒定法是將高效液相色譜和光譜（或質(zhì)譜）聯(lián)接成一個(gè)完整的系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)檢測(cè)。兩譜聯(lián)用鑒定法能給出樣品的色譜圖，并能快速給出每個(gè)色譜組分的光譜（或質(zhì)譜）圖，能同時(shí)獲得定性、定量信息。兩譜聯(lián)用技術(shù)是當(dāng)今復(fù)雜樣品成分分離、鑒定的最重要手段。高效液相色譜分析方法022.定量測(cè)定技術(shù)高效液相色譜法的定量方法與氣相色譜法基本相同，因很難查到在相同實(shí)驗(yàn)條件下的各組分的定量校正因子，而較少使用歸一化法。外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法常用于藥物有效成分含量的測(cè)定，藥物中雜質(zhì)含量測(cè)定或限度檢查常用主成分自身對(duì)照法。氣相色譜中已學(xué)習(xí)過(guò)的定量方法不再敘述，此處著重介紹加校正因子的主成分自身對(duì)照法和不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。高效液相色譜分析方法022.定量測(cè)定技術(shù)（1）加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，可采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。在建立方法時(shí)，按被測(cè)藥品項(xiàng)下規(guī)定，精密稱(chēng)（量）取雜質(zhì)對(duì)照品和待測(cè)成分（主成分）的對(duì)照品適量，配制測(cè)定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)的校正因子。高效液相色譜分析方法022.定量測(cè)定技術(shù)計(jì)算關(guān)系式為：式中，f為校正因子；

c雜為雜質(zhì)對(duì)照品的質(zhì)量濃度，g/mL;

c主為主成分對(duì)照品的質(zhì)量濃度，g/mL;

A雜為雜質(zhì)對(duì)照品的峰面積（或峰高）；

A主為供試品中主成分的峰面積（或峰高）。此校正因子可直接載入各品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測(cè)峰面積。高效液相色譜分析方法02

2.定量測(cè)定技術(shù)測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，按供試品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷?duì)照液，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度或進(jìn)樣量，使對(duì)照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿(mǎn)量程的10%~25%,或其峰面積能準(zhǔn)確積分。然后，取供試品溶液和對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣。除有特殊規(guī)定外，供試品溶液的記錄時(shí)間應(yīng)記錄到主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜峰上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后，與對(duì)照溶液主成分的峰面積比較，計(jì)算各雜質(zhì)含量。高效液相色譜分析方法022.定量測(cè)定技術(shù)（2）不加校正因子的主成分自身對(duì)照法當(dāng)沒(méi)有雜質(zhì)對(duì)照品時(shí)，可采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。配制對(duì)照溶液并調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度后，取供試品溶液和對(duì)照溶液適量，分別進(jìn)樣。除供試品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下有特別規(guī)定外，供試品溶液色譜圖記錄的時(shí)間應(yīng)為主成分色譜峰保留時(shí)間的2倍，測(cè)量供試品溶液色譜圖中各雜質(zhì)的峰面積并與對(duì)照溶液的主成分的峰面積比較，計(jì)算雜質(zhì)的含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則先記錄供試品溶液的色譜圖，測(cè)量溶劑與雜質(zhì)的總峰面積，再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖，測(cè)量溶劑的峰面積，前者減去后者即得總雜質(zhì)的校正峰面積，再進(jìn)行相應(yīng)的計(jì)算。高效液相色譜分析方法02實(shí)訓(xùn)十二阿司匹林腸溶片的含量測(cè)定第一節(jié)051.能說(shuō)出高效液相色譜法測(cè)定阿司匹林腸溶片含量的原理、操作技術(shù)。2.能完成外標(biāo)法計(jì)算藥物含量并進(jìn)行結(jié)果判斷、分析測(cè)試條件的選擇方法和色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。3.能說(shuō)出高效液相色譜儀維護(hù)常識(shí)。01實(shí)訓(xùn)目的阿司匹林又名乙酰水楊酸，是一類(lèi)常用的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥?！吨袊?guó)藥典(2020年版）》規(guī)定阿司匹林腸溶片含阿司匹林應(yīng)為標(biāo)示量的93.0%~107.0%。阿司匹林化學(xué)結(jié)構(gòu)式為：高效液相色譜具有強(qiáng)大的分離功能，采用六通閥進(jìn)樣器重復(fù)性好，誤差相對(duì)較小，采用外標(biāo)法定量準(zhǔn)確度高，因此《中國(guó)藥典(2020年版）》上采用高效液相色譜法進(jìn)行阿司匹林腸溶片的含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)原理02１.器材高效液相色譜儀，超聲波清洗儀，電動(dòng)真空泵，電子分析天平，容量瓶，微量進(jìn)樣器，針式微膜過(guò)濾器，研缽，微孔濾膜(45μm)。２.試劑與試藥阿司匹林腸溶片（規(guī)格：25mg),阿司匹林對(duì)照品，乙腈（色譜純），甲醇（分析純），四氫呋喃（色譜純），冰醋酸（分析純），二次重蒸水。實(shí)訓(xùn)準(zhǔn)備031.對(duì)照品溶液配制取阿司匹林對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加1%冰醋酸的甲醇溶液溶解并定容稀釋至0.1mg/mL,搖勻，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。2.供試品溶液配制取阿司匹林腸溶片20片，精密稱(chēng)定，充分研細(xì)，精密稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于阿司匹林10mg),置于100mL容量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液強(qiáng)烈振搖使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。04實(shí)訓(xùn)內(nèi)容與步驟3.測(cè)定(1)色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)色譜條件：ODS柱；流動(dòng)相：乙腈－四氯呋喃－冰醋酸－蒸餾水(20∶5∶5∶70);檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm。系統(tǒng)適應(yīng)性要求：按阿司匹林峰計(jì)算，理論塔板數(shù)不低于3000,水楊酸和乙酰水楊酸分離度大于1.5。04實(shí)訓(xùn)內(nèi)容與步驟(2)精密吸取上述對(duì)照品溶液10μL,注入液相色譜儀，進(jìn)行分析，記錄色譜圖。平行操作三份。(3)精密吸取上述供試品溶液10μL,注入液相色譜儀，進(jìn)行分析，記錄色譜圖。平行操作三份。對(duì)照品和供試品溶液保留時(shí)間應(yīng)一致。04實(shí)訓(xùn)內(nèi)容與步驟４數(shù)據(jù)記錄和處理（１）將相關(guān)數(shù)據(jù)填入表7-2中。數(shù)據(jù)處理：cR為對(duì)照品濃度（mg/mL）；AR為對(duì)照品峰面積；AS為供試品峰面積；

為平均片重（mg）；m為供試品稱(chēng)樣重量（mg）；S為標(biāo)示量（mg）。04實(shí)訓(xùn)內(nèi)容與步驟(2)計(jì)算出供試品中主成分的含量(3)打印分析結(jié)果和色譜圖04實(shí)訓(xùn)內(nèi)容與步驟5.注意事項(xiàng)(1)阿司匹林易水解變質(zhì)，供試品粉碎、稱(chēng)取等前處理應(yīng)盡快，對(duì)照品臨用現(xiàn)配。(2)試驗(yàn)所用流動(dòng)相必須用微孔濾膜進(jìn)行濾過(guò)，樣品進(jìn)樣前同樣需要濾過(guò)。(3)儲(chǔ)液瓶要保持清潔，要防止交叉污染。定期清除殘留溶液，防止感染微生物。內(nèi)壁要定期清洗，附件要經(jīng)常更換。(4)分析測(cè)試完畢后，先關(guān)檢測(cè)器，再用經(jīng)濾過(guò)和脫氣的適當(dāng)溶劑清洗色譜系統(tǒng)。正相色譜柱一般用正己烷沖洗；反相色譜柱如使用含鹽流動(dòng)相，則先用高純水，然后用甲醇-水(90∶10)沖洗。各種沖洗劑一般沖洗時(shí)間為15~30分鐘，特殊情況應(yīng)延長(zhǎng)沖洗時(shí)間。04實(shí)訓(xùn)內(nèi)容與步驟實(shí)訓(xùn)測(cè)評(píng)05實(shí)訓(xùn)十三維生素K1注射液的含量測(cè)定第一節(jié)061.能說(shuō)出高效液相色譜法測(cè)定維生素K1含量的原理、操作技術(shù)。2.能完成外標(biāo)法計(jì)算藥物含量并進(jìn)行結(jié)果判斷、分析測(cè)試條件的選擇方法和色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。3.能說(shuō)出高效液相色譜儀維護(hù)常識(shí)。01實(shí)訓(xùn)目的維生素K1是一類(lèi)脂溶性維生素。維生素K1的分子結(jié)構(gòu)中具有共軛芳環(huán)結(jié)構(gòu)，具有紫外吸收特征，因此可用紫外檢