海洋放線菌srepomycessplxf-80的分離與鑒定

放線菌是自然界活動的重要來源。在發(fā)現(xiàn)的22500多種微生物活性物質(zhì)的二級代謝產(chǎn)物中，有1065種來自放線菌，其中76%來自鏈菌。經(jīng)過50多年的探索從陸生放線菌中發(fā)現(xiàn)新菌種、新活性物質(zhì)的幾率大大降低,于是人們把眼光投向具有高壓、高鹽、缺氧、低溫、寡營養(yǎng)等獨特環(huán)境特點的巨大的資源寶庫———海洋。在這種特殊的生存環(huán)境中,海洋放線菌必定進化出不同于陸生放線菌的獨特的代謝機制,這就為新穎的活性產(chǎn)物的產(chǎn)生提供了重要的條件［２－３］。已有研究表明,海洋放線菌次級代謝產(chǎn)物豐富,包括內(nèi)酯類,萜類,生物堿類等,部分化合物的結(jié)構(gòu)及生物活性表現(xiàn)出與陸生放線菌顯著的差異［４］。海洋沉積物是營養(yǎng)較為豐富的生物棲息地［５］。近年研究發(fā)現(xiàn),海洋沉積物中的放線菌多樣性非常豐富［６－７］,這為微生物次級代謝產(chǎn)物研究提供了重要的資源。本研究針對采集自黃海、渤海的沉積物樣品,進行海洋放線菌的分離,并采取以化學(xué)篩選為主,活性篩選為輔的模式進行菌株的篩選,以期獲得具有研究價值的放線菌,并對其代謝產(chǎn)物進行研究。從黃海和渤海2個來源的海泥樣品中分離到142株放線菌,經(jīng)化學(xué)篩選后獲得27株次級代謝產(chǎn)物豐富的潛力菌株,經(jīng)SRB法活性測試發(fā)現(xiàn)其中15株具有良好的抗腫瘤活性。本研究首先選擇了菌株Streptomycessp.LXF-80作為目標(biāo)研究菌株,其發(fā)酵液粗提物的HPLC指紋圖譜分析,顯示出有1個含量較高且紫外吸收較特殊的化合物以及一些呈系列吸收的化合物的特征峰,并對該部分的代謝產(chǎn)物進行了系統(tǒng)的研究。跟蹤研究結(jié)果,從中分離得到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的聚酮類化合物Enterocin(1)和4個環(huán)二肽類化合物(2~5)。化合物1是1個罕見的包含α-吡喃酮的三環(huán)駢和聚酮結(jié)構(gòu),在已報道的文獻中,該類結(jié)構(gòu)僅有3個,其特殊的三環(huán)駢和結(jié)構(gòu)是在生源合成途徑中經(jīng)歷1個罕見的Favorskii-likerearrange-ment氧化重排反應(yīng)［１５－１７］而得到的。該聚酮化合物的發(fā)現(xiàn)為海洋放線菌聚酮生物合成途徑的研究提供了重要的資源。1實驗部分1.1材料、儀器和活性核磁共振儀(日本JeolJNM-ECP600型);質(zhì)譜儀(MarinerAPI-TOP型);制備高效液相色譜儀(Waters600泵,Waters996二極管陣列檢測器,Millennium32工作站,YMCC18柱:5μm,4.6mm);高壓滅菌鍋(MLS3750日本三洋株式會社);潔凈工作臺(AirTech蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);高速離心機(德國BECKMAN公司);恒溫培養(yǎng)箱(MIR-253SANYO公司);旋轉(zhuǎn)式振動培養(yǎng)箱(TC-C-100R高崎科學(xué)器械株式會社);超聲儀(VC750美國SONICS公司);真空濃縮儀(SC250DDASavant公司);相差倒置顯微鏡(CK40OLYMPUS公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO175SANYO公司);EYELAN-N型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀(TokyoRikakikaiCO.LTD);SephadexLH-20(Pharmacia公司);硅膠H(200~400目)(青島海洋化工廠產(chǎn)品)。活性測試采用小鼠P388腫瘤細胞;胎牛血清(FBS)(Hy-clone公司);RP-MI-1640培養(yǎng)基(Gibcobrl公司);磺酰羅丹明B(SRB)(Sigma公司)。提取分離用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚、氯仿等均為工業(yè)用化學(xué)純產(chǎn)品,重蒸后使用,液相色譜甲醇為色譜純。1.2菌株的分離和篩選1.2.1樣本來源所分離的樣品來源于黃海及渤海的海泥。1.2.2培養(yǎng)基的添加(1)分離條件選取5種培養(yǎng)基作為放線菌分離的培養(yǎng)基:高氏一號培養(yǎng)基,YEM培養(yǎng)基,M2培養(yǎng)基,幾丁質(zhì)瓊脂培養(yǎng)基,酪蛋白-丙酸鈉培養(yǎng)基。所有的培養(yǎng)基中均添加3.3%的海水素,并分別添加抑制劑:制霉菌素(100mg·mL－１)和萘啶酮酸(20mg·mL－１);制霉菌素(100mg·mL－１)和硫酸新霉素(20mg·mL－１)。(2)分離方法樣品采用稀釋涂布法涂布于分離培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng),挑取形態(tài)差異較大的單菌落,純化后4℃冰箱中保存。1.2.3菌種活性、薄層色譜和展開梯度(1)發(fā)酵培養(yǎng)基放線菌2號:可溶性淀粉10g,葡萄糖20g,酵母膏10g,牛肉膏1g,玉米漿3g,KH２PO４0.5g,MgSO４·7H２O0.5g,CaCO３2g,海水素33g,水1000mL,pH=7.0。(2)化學(xué)排重用500mL三角瓶裝150mL發(fā)酵培養(yǎng)基,將分離所得菌種取適量接種,置于搖床28℃,180r/min振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)7d。發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯層真空濃縮至干,得到提取物。用TLC薄層色譜排除薄層行為相似的菌株(顯色劑:香草醛濃硫酸;展開梯度:CH２Cl２∶MeOH=13∶1),保留薄層行為差異較大,產(chǎn)物豐富的菌株。(3)活性篩選將化學(xué)排重后保留的粗提物加甲醇配成濃度10mg·mL－１,超聲振蕩溶解,按照文獻［８］采用SRB法并結(jié)合顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,進行活性評價。1.350.等級1植物lxf-80的后代1.3.1l放線菌培養(yǎng)培養(yǎng)基在無菌條件下,接種菌體于內(nèi)裝150mL放線菌2號培養(yǎng)基的500mL的三角瓶內(nèi),置于搖床28℃,180r/min振蕩培養(yǎng),培養(yǎng)7d。共發(fā)酵65L。1.3.2丙酮浸膏的制備將發(fā)酵培養(yǎng)物離心分離菌絲體和發(fā)酵液,菌絲體部分丙酮浸泡過夜,抽濾,減壓濃縮后用乙酸乙酯萃取,濃縮得到浸膏7g,發(fā)酵液乙酸乙酯萃取,濃縮得到浸膏33g,將兩部分浸膏合并,共得到浸膏40g。1.3.3相同的組分，相同的分組總浸膏減壓硅膠柱層析,石油醚-二氯甲烷-甲醇梯度洗脫,收集不同組分,濃縮后經(jīng)TLC檢測合并相同的組分后得到7個組分;其中組分Fr.3經(jīng)ODS減壓反相硅膠柱色譜,凝膠柱色譜(Seph-adexLH-20,甲醇),中壓色譜和高效液相色譜等方法分離得到化合物1(150mg),化合物2(4.4mg),化合物3(6mg),化合物4(1.7mg),化合物5(3.8mg)。2結(jié)果2.1渤海海泥樣品來源從黃海和渤海的海泥樣品中共分離到放線菌142株,其中來源于黃海海泥樣品的有90株,來源于渤海海泥樣品的有52株。菌株經(jīng)形態(tài)排重后剩余91株,發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)TLC薄層色譜化學(xué)排重后剩余27株,對化學(xué)排重后的27株菌進行P388細胞活性測試,抑制率高于陽性藥5-氟尿嘧啶(43%)的活性菌株有15株,具體活性數(shù)據(jù)如表1。2.2菌株的篩選與分離對化學(xué)排重后的27株菌進行HPLC指紋圖譜的分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株LXF-80的代謝產(chǎn)物豐富,有1個含量較高且紫外吸收較特殊的化合物(tＲ=24.6min,λｍａｘ=237.6nm)以及一些呈系列吸收的特征峰(指紋圖譜如圖1所示),因此選取該菌株作為目標(biāo)菌株,以期獲得這個量大的主產(chǎn)物及其他呈系列吸收的化合物。菌株LXF-80來源于渤海海泥樣品,從加有制霉菌素(100mg·L－１)和萘啶酮酸(20mg·L－１)抑制劑的酪蛋白-丙酸鈉培養(yǎng)基中分離純化得到。經(jīng)過16SrDNA序列比對,初步鑒定為鏈霉菌Streptomycessp.(GenBank登錄號為:JX912298)。2.3被氧甲基取代的吡喃酮結(jié)構(gòu)化合物1:白色無定型粉末。陽離子ESI-MS在m/z445給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]＋提示化合物分子量為444,結(jié)合１HNMR(600MHz,DM-SO-d６)和１３CNMR(150MHz,DMSO-d６)推出分子式為C２２H２０O１０,不飽和度13?；衔餁渥V給出20個氫信號,碳譜給出22個碳信號,包括:9個C,11個CH,1個CH２,1個CH３信號。根據(jù)一維譜圖的5個芳香氫信號H-18、H-18’[δ:7.79(2H,d,J=7.14Hz)],H-19、H-19’[δ:7.51(2H,t,J=7.68Hz)],H-20[δ:7.61(1H,t,J=7.14Hz)]結(jié)合碳譜6個芳香碳信號C-17[δ:140.2],C-20[δ:133.2],C-18、C-18’[δ:128.9],C-19、C-19’[δ:128.5]及二維HMBC譜中H-18與羰基碳C-16[δ:195.5]相關(guān)確定了苯甲酰的結(jié)構(gòu)片段。2個烯氫信號H-11[δ:6.30(1H,d,J=2.22Hz)],H-13[δ:5.62(1H,d,J=2.22Hz)]結(jié)合4個sp２雜化碳信號C-12[δ:171.3],C-10[δ:163.9],C-11[δ:105.3],C-13[δ:88.4]及1個締合的羰基碳信號C-14[δ:162.1]并結(jié)合HMBC譜中氧甲基信號H-15[δ:3.83(3H,s)]與C-12相關(guān)確定為12位被氧甲基取代的吡喃酮結(jié)構(gòu)。在二維１H-１HCOSY譜中,給出了兩組相關(guān)信號:H-6[δ:4.65(1H,m)]/H-7[δ:2.29(1H,dd,J=3.3Hz,14.28Hz),1.67(1H,dd,J=2.76Hz,14.28Hz)];H-5[δ:4.48(1H,m)]/5-OH[δ:5.67(1H,d,J=5.52Hz)],結(jié)合HMBC譜中的以下信號:H-6與C-5[δ:69.8]相關(guān);H-7與C-8[δ:76.0]相關(guān);8-OH[δ:5.92(1H,s)]與C-7[δ:35.5]相關(guān);H-9[δ:4.67(1H,d,J=2.76Hz)]與C-8,C-4[δ:78.7]相關(guān);4-OH[δ:5.51(1H,s)]與C-4,C-5相關(guān)可以得到1個多羥基取代的六元環(huán)結(jié)構(gòu)。由于化合物的不飽和度為13,在已得到的片段中,共11個不飽和度,由此推測剩余的2個不飽和度可能為2個環(huán)狀結(jié)構(gòu),在HMBC譜中2-OH[δ:5.89(1H,s)]與締合的羰基碳C-1[δ:174.3]及C-2[δ:80.4],C-3[δ:55.2],C-8相關(guān);4-OH與C-3相關(guān),由這些相關(guān)信號結(jié)合化合物的分子式及不飽和度和C-6化學(xué)位移值可將其與得到的六元環(huán)相連成為三環(huán)駢合結(jié)構(gòu)。此外,H-3[δ:4.47(1H,s)]與C-16相關(guān)可將苯甲酰取代基與中間部分的三環(huán)結(jié)構(gòu)相連接;H-11與C-9[δ:77.0]相關(guān)可以將吡喃酮環(huán)與中間部分相連接。通過SciFinder查詢并與文獻[9-10]數(shù)據(jù)比對,確定該化合物的結(jié)構(gòu)為enterocin?；衔?:白色無定型粉末。陽離子ESI-MS在m/z300給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]＋提示分子量為299,結(jié)合１HNMR和１３CNMR推出分子式為C１７H２１N３O２,不飽和度9。１HNMR(600MHz,DMSO-d６)給出20個氫信號:2個活潑氫信號H-5[δ:8.07(1H,s)],H-2[δ:7.97(1H,s)]結(jié)合1個次甲基信號H-6[δ:4.09(1H,s)]提示為環(huán)二肽類化合物典型的特征信號。另外1個活潑氫信號H-15[δ:10.9(1H,s)]結(jié)合5個芳香氫信號H-10[δ:7.55(1H,d,J=7.68Hz)],H-13[δ:7.30(1H,d,J=7.68Hz)],H-12[δ:7.02(1H,t,J=7.14Hz)],H-16[δ:7.02(1H,s)],H-11[δ:6.92(1H,t,J=7.68Hz)]提示為吲哚的特征信號;次甲基氫信號H-18[δ:-0.06~-0.02(1H,m)]結(jié)合2個亞甲基氫信號H-7[δ:3.27(1H,dd,J=3.84Hz,14.28Hz),2.99(1H,dd,J=4.38Hz,14.28Hz)],H-17[δ:1.14~1.23(1H,m),0.61~0.64(1H,m)]及2個甲基氫信號H-19[δ:0.53(3H,d,J=6.6Hz)],H-19’[δ:0.42(3H,d,J=6.6Hz)]提示為異丁基。另外還有2個氫信號H-7[δ:3.27(1H,dd,J=3.84Hz,14.28Hz),2.99(1H,dd,J=4.38Hz,14.28Hz)]根據(jù)其耦合常數(shù)提示為1個亞甲基。通過與文獻數(shù)據(jù)比對,化合物的旋光[α]Ｄ２５-3.4(c1,MeOH)數(shù)值與文獻接近,旋光方向相同,由此確定該化合物為Cyclo-(L-Trp-L-Lue)?；衔?:白色無定型粉末。陽離子ESI-MS在m/z286給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]＋提示分子量為285,分子式為C１６H１９N３O２,不飽和度9。1HNMR(600MHz,DMSO-d６)共給出19個氫信號,與化合物2的氫譜相似,包括以下信號:3個活潑氫信號H-15[δ:10.9(1H,s)],H-5[δ:8.00(1H,s)],H-2[δ:7.88(1H,s)];5個芳香氫信號H-10[δ:7.59(1H,d,J=7.68Hz)],H-13[δ:7.29(1H,d,J=7.74Hz)],H-12[δ:7.01(1H,t,J=7.74Hz)],H-11[δ:6.93(1H,t,J=7.2Hz)],H-16[δ:7.06(1H,s)];3個次甲基信號H-6[δ:4.13(1H,s)],H-3[δ:3.48(1H,s)],H-17[δ:1.63(1H,m)];1個亞甲基信號H-7[δ:3.21(1H,dd,J=4.92Hz,14.82Hz),3.05(1H,dd,J=4.92Hz,14.82Hz)];2個甲基信號H-18[δ:0.59(3H,d,J=7.14Hz)],H-18’[δ:0.16(3H,d,J=6.6Hz)]。通過與化合物2氫譜比對,兩者有相同的骨架,不同之處在于化合物3用異丙基代替了化合物2的異丁基。通過與文獻比對,化合物的旋光[α]Ｄ２５-35.4(c1,MeOH)數(shù)值與文獻接近,旋光方向相同,確定了化合物3為Cyclo-(L-Trp-L-Ala)。化合物4:白色無定型粉末。陽離子ESI-MS在m/z334給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]＋提示分子量為333,分子式為C２０H１９N３O２,不飽和度13。1HNMR(600MHz,DMSO-d６)共給出19個氫信號:包括3個活潑氫信號H-15[δ:10.9(1H,s)],H-2[δ:7.73(1H,s)],H-5[δ:7.93(1H,s)];10個芳香氫信號,其中H-19、H-19’[δ:7.18(2H,m)],H-20、H-20’[δ:6.70(2H,m)],H-21[δ:7.16(1H,m)]提示為單取代苯環(huán);H-10[δ:7.47(1H,d,J=7.68Hz)],H-13[δ:7.31(1H,d,J=7.68Hz)],H-12[δ:7.06(1H,t)],H-11[δ:7.00(1H,t)],H-16[δ:6.96(1H,s)]為吲哚環(huán)的氫信號;2個次甲基信號H-6[δ:3.97(1H,s)],H-3[δ:3.85(1H,s)]為典型的環(huán)二肽特征α-H信號;2個亞甲基信號H-7[δ:2.80(1H,dd,J=4.38Hz,14.82Hz),2.44(1H,dd,J=4.38Hz,14.82Hz)],H-17[δ:2.52(1H,m),1.85(1H,m)]?；衔?與化合物2有相同的骨架,不同之處在于其用苯環(huán)代替了化合物2的異丁基。通過與文獻數(shù)據(jù)比對,化合物的旋光[α]Ｄ２５-99.8(c1,MeOH)數(shù)值與文獻接近,旋光方向相同,確定該結(jié)構(gòu)為Cyclo-(L-Trp-L-Phe)?；衔?:淡黃色無定型粉末。陽離子ESI-MS在m/z247給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]＋提示分子量為246,分子式為C１４H１８N２O２,不飽和度7。１HNMR(600MHz,DMSO-d６)給出18個氫信號:包括2個活潑氫信號H-5[δ:8.12(1H,s)],H-2[δ:7.91(1H,s)]為NH信號;5個芳香氫信號H-9、H-9’、H-10、H-10’、H-11[δ:7.23-7.17(5H,m)]提示為單取代的苯環(huán);2個次甲基信號H-6[δ:4.21(1H,s)],H-3[δ:3.53(1H,s)]為環(huán)二肽特征α-H信號;1個亞甲基氫信號H-7[δ:3.15(1H,dd,J=6.00Hz,12.00Hz),2.86(1H,dd,J=6.00Hz,12.00Hz)];此外1個次甲基信號H-12[δ:1.69(1H,m)]結(jié)合2個甲基信號H-13[δ:0.64(3H,d,J=6.6Hz)],H-13’[δ:0.24(3H,d,J=6.6Hz)]提示為異丙基。通過與文獻比對,化合物的旋光[α]Ｄ２５-48.6(c1,MeOH)數(shù)值與文獻接近,旋光方向相同,確定了化合物5為Cyc