凝血因子的分離純化及抗血管性假血友病的抗血藥制劑的制備

凝血因子是由促進(jìn)反應(yīng)成分和相關(guān)vw組成的合成大學(xué)。甲型血友病患者FⅧ:C異?；蛉狈?血管性假血友病(vWD)患者vWF異?；蛉狈?。FⅧ:C是FⅨa活化FX的輔因子。vWF為高分子量糖蛋白,是血小板粘附于內(nèi)皮和內(nèi)皮下的中介物,參與最初的血管止血過(guò)程。FⅧ:C極不穩(wěn)定,它對(duì)vWF有一種依存關(guān)系,但兩者又都有各自獨(dú)立的生物學(xué)功能。當(dāng)前已采用各種不同的方法制備FⅧ濃縮物以滿足臨床和研究工作的需要。我們通過(guò)3次預(yù)試驗(yàn),確定了一種可行的純化方法,得到了具有FⅧ各種活性的高純度產(chǎn)品。1材料和方法1.1材料表面1.1.1血漿自采血經(jīng)分漿到凍結(jié)在-25℃冰箱6小時(shí)內(nèi)完成的新鮮冰凍血漿。1.1.2SephacrylS-1000,Pharmacia公司產(chǎn)品。1.1.3alcl3溶液的純化0.3mol/LNaOH溶液逐滴加入0.1mol/LAlCl3溶液至pH7.0,靜置片刻后離心,沉淀懸浮于適量的TrisHCl緩沖液中,凝膠的Al(OH)3濃度為3%。1.1.4緩沖區(qū)緩沖區(qū)1.1.4.1tris-hcl緩沖液1.1.4.2甘氨酸緩沖液2.8mol/L甘氨酸溶液含有0.3mol/LNaCl和0.025mol/LTris,用HCl調(diào)pH至6.8。1.1.4.cacl2、0.4mol2和1%蔗糖hcl0.02mol/L枸櫞酸鈉溶液,含有0.005mol/LCaCl2、0.04mol/LNaCl和1%蔗糖,用HCl調(diào)pH至7.1。1.1.4.4層析緩沖區(qū)55mmol/L枸櫞酸鈉溶液用55mmol/L枸櫞酸調(diào)pH至7.4,加入NaN3至0.02%。1.2方法1.2.1f.f：c測(cè)試1.2.2觀察方法血小板懸液對(duì)Olson方法作一些改進(jìn)。新鮮洗滌濃縮血小板,計(jì)數(shù)為250×109/L。用Chrono-Log400型血小板聚集儀進(jìn)行測(cè)定。血小板懸液0.35ml,自制60人份混合標(biāo)準(zhǔn)血漿或被檢樣品0.10ml于聚集儀(37℃)中孵育3min后加入0.05mlRistocetin(H.LundeckA/S-Copenhagen,丹麥)溶液,最終濃度為1mg/ml,觀察描記5min。以5min時(shí)聚集峰高與標(biāo)準(zhǔn)血漿稀釋度在雙對(duì)數(shù)座標(biāo)紙上作出標(biāo)準(zhǔn)線,并制定標(biāo)準(zhǔn)血漿的FⅧR:RCof為1U/ml,被檢樣品結(jié)果由此算出。1.2.3測(cè)定蛋白質(zhì)含量的測(cè)定1.2.4f.r：ag，F(xiàn)g、Fn、IgG含量均采用火箭電泳進(jìn)行測(cè)定。將自制標(biāo)準(zhǔn)血漿中以上成分的含量定為1U/ml。抗血清均購(gòu)自上海生物制品研究所。1.2.5準(zhǔn)備過(guò)程1.2.5.枸杞酸鈉溶液的提取4000ml血漿,置流動(dòng)自來(lái)水浴中融化至含少許冰屑,4℃離心,收集冷沉淀。將冷沉淀懸浮于240mlTris-HCl緩沖液中,在室溫下攪拌抽提。然后加入16mlAl(OH)3凝膠,繼續(xù)攪拌5min,15℃離心,上清液澄清過(guò)濾后加入0.5mol/L枸櫞酸鈉溶液至終濃度為0.02mol/L。用HCl調(diào)pH至6.95,得中純FⅧ260ml。1.2.5.離心液-nacl-ms/gc中純FⅧ加入甘氨酸緩沖液至甘氨酸終濃度為2mol/L,攪拌15min,靜置10min,室溫400g10min離心。上清液中加入固體NaCl至終濃度為10%。攪拌15min,靜置10min,離心后的沉淀溶解于20ml溶解緩沖液中。再離心去掉不溶物,上清則為高純FⅧ。1.2.5.高純f上樣和含fnSephacrylS-1000裝柱(2.6×40cm),用層析緩沖液平衡過(guò)夜。高純FⅧ上樣速度為100ml/h,以60ml/h的速度洗脫。收集富含F(xiàn)Ⅷ:C及FⅧR:RCof部分。層析圖譜見(jiàn)圖1,純化流程見(jiàn)圖2。2結(jié)果2.1表1顯示了在血漿和純度過(guò)程中各階段產(chǎn)品的蛋白質(zhì)組成分析2.2表2顯示了每個(gè)步驟中有機(jī)原料血漿的提取多樣性和回收率3治療分型血友病和vwd的f產(chǎn)品層析前的純化過(guò)程可得到3種產(chǎn)品:冷沉淀、中純FⅧ和高純FⅧ。整個(gè)工藝具有較好的銜接性,并且能很好地與巴斯德消毒法或有機(jī)溶劑-去污劑滅活病毒的方法結(jié)合起來(lái),放大規(guī)模用于常規(guī)生產(chǎn),向臨床提供無(wú)病毒的安全制品。無(wú)論是甲型血友病患者或vWD患者均需長(zhǎng)期使用FⅧ制品進(jìn)行替代治療,因此提高FⅧ制品的純度,盡量減少同種異源雜蛋白(Fg、Fn、IgG)的輸入是制備FⅧ的努力方向。我們通過(guò)SephacrylS-1000分子篩層析在這方面作了有益的嘗試。層析后的產(chǎn)品富含F(xiàn)Ⅷ:C/vWF,雜蛋白含量甚微(火箭電泳未測(cè)出),可用于治療甲型血友病和vWD;它還可作為純抗原用于免疫動(dòng)物,獲取FⅧC:A