無標(biāo)記檢測技術(shù)

在現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用世界現(xiàn)代化與第六次科技革命在過去500年里，世界上先后大約發(fā)生了五次科技革命，包括兩次科學(xué)革命和三次技術(shù)革命中國與前四次科技革命無緣；失去四次科技革命的機(jī)會，中國的國際地位一路下滑以社會生產(chǎn)力（按購買力平價計算的人均國內(nèi)生產(chǎn)總值）為例，1700年中國社會生產(chǎn)力水平排名世界第18位，1820年排第48位，1900年排第71位，1950年排第99位。目前，世界正處于第六次科技革命的前夜，第六次科技革命將是中國復(fù)興的一次歷史性機(jī)遇，值得科技界和全社會重視和思考2科技革命大致時間主要內(nèi)容第一次16~17世紀(jì)近代科學(xué)的誕生第二次18世紀(jì)中后期蒸汽機(jī)和機(jī)械革命第三次19世紀(jì)中后期電力和運輸革命第四次相對論和量子論等第五次20世紀(jì)中期電子技術(shù)和自動化20世紀(jì)中后期信息技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)化第六次21世紀(jì)中期新生物學(xué)革命，新生命生物與技術(shù)融合第六次科技革命的方向和挑戰(zhàn)從人類文明和世界現(xiàn)代化的角度看，第六次科技革命將以生命科學(xué)為基礎(chǔ)，融合信息科技和納米科技，提供解決和滿足人類精神生活需要的最新科技從科學(xué)革命角度看，第六次科技革命有可能是新生物學(xué)革命檢驗醫(yī)學(xué)的發(fā)展與技術(shù)革命息息相關(guān)3第六次技術(shù)革命

給檢驗醫(yī)學(xué)帶來的機(jī)遇與挑戰(zhàn)無標(biāo)記檢測技術(shù)高通量測序技術(shù)與個體化治療3D打印技術(shù)單細(xì)胞檢測組學(xué)納米醫(yī)學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)互聯(lián)網(wǎng)加大數(shù)據(jù)分析可穿戴式檢驗設(shè)備45有標(biāo)記檢測檢測靈敏度高、特異性好，但是，任何標(biāo)記均對生物分子和細(xì)胞存在一定的損害性(如細(xì)胞毒性)，不能還原分子和細(xì)胞的真實信息無標(biāo)記檢測能達(dá)到甚至超過有標(biāo)記檢測的靈敏度和特異性，是一種無損檢測，能夠?qū)崟r動態(tài)地還原分子和細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能變化等真實信息無標(biāo)記檢測技術(shù)無標(biāo)記檢測是檢驗醫(yī)學(xué)追求的終極目標(biāo)之一太赫茲波譜檢測技術(shù)6細(xì)菌快速偵檢是臨床微生物檢驗亟待解決的實際需求細(xì)菌快速偵檢是臨床及時、準(zhǔn)確判斷是否感染及合理使用抗生素的重要依據(jù)巴斯德和科赫在19世紀(jì)建立的細(xì)菌培養(yǎng)方法仍然是臨床微生物檢驗的主流技術(shù)與檢驗醫(yī)學(xué)其它技術(shù)的飛速發(fā)展相比較，臨床微生物檢驗的發(fā)展相對滯后7路易斯·巴斯德法國微生物學(xué)家羅伯特·科赫德國微生物學(xué)家結(jié)核分枝桿菌流感嗜血桿菌血平板細(xì)菌培養(yǎng)瓊脂糖平板培養(yǎng)AnnLabMed.2013Jan;33(1):14-27現(xiàn)有技術(shù)尚不能有效解決8不能繞過細(xì)菌培養(yǎng)AnnLabMed.2013Jan;33(1):14-27PCR基因芯片第二代測序蛋白組質(zhì)譜細(xì)菌培養(yǎng)這一制約細(xì)菌快速偵檢的關(guān)鍵問題蛋白組質(zhì)譜：基因診斷技術(shù)：第二代測序：不同種屬的細(xì)菌需要特定引物或探針，無法替代傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)種屬鑒定發(fā)展前景良好，但因技術(shù)和成本原因，臨床應(yīng)用尚需時日

摒除細(xì)菌培養(yǎng)環(huán)節(jié)，直接定性和定量檢測是細(xì)菌快速偵檢期待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題有必要尋求能夠有效解決上述問題的跨學(xué)科檢測理論與技術(shù)9Nature.2002May9;417(6885):132-3AnnLabMed.2013Jan;33(1):14-27近年來出現(xiàn)的太赫茲(terahertz,THz)技術(shù)為細(xì)菌的快速偵檢提供了一個良好契機(jī)THz波是指頻率在0.1~10THz范圍內(nèi)的電磁波生物大分子的弱相互作用、骨架振動和偶極子旋轉(zhuǎn)等正好處于THz頻譜范圍由于缺乏有效的THz波產(chǎn)生與檢測方法，曾一度被稱為“THz間隙”10THz波是最后一個尚未充分開發(fā)利用的電磁波段2005年以來，

“THz間隙”逐漸得到填補(bǔ)，為THz波生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究提供了技術(shù)支撐和發(fā)展契機(jī)改變未來世界的十大技術(shù)之一；國防重點學(xué)科設(shè)置了系列國際合作項目(如：THz-BRIDGE、THz-BEAM)國家科技發(fā)展規(guī)劃明確指出THz波技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究領(lǐng)域的重大戰(zhàn)略地位THz波生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究是當(dāng)今學(xué)科交叉前沿2005年第270次：太赫茲科學(xué)技術(shù)的新發(fā)展2014年第488次：THz波生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的科學(xué)問題與前沿技術(shù)(本項目團(tuán)隊作為核心成員發(fā)起并承辦)兩次香山科學(xué)會議美國：歐洲：中國：THz波快速偵檢細(xì)菌的理論基礎(chǔ)12AdvBiosciBiotech.2013Mar;4:493-503AmJBiomedEng.2012;2(4):143-15412每種生物大分子均有特定THz波譜指紋THz波可穿透整個細(xì)菌，以純物理過程獲取細(xì)菌的生物大分子信息通過解析THz波譜，可區(qū)別不同細(xì)菌的分子結(jié)構(gòu)、組成和豐度差異，實現(xiàn)細(xì)菌的無標(biāo)記直接檢測13AdvBiosciBiotech.2013Mar;4:493-503AmJBiomedEng.2012;2(4):143-15413種屬特異性差異分子鑒別細(xì)菌種屬：區(qū)分死菌與活菌：檢測細(xì)菌耐藥性：G+菌的胞壁磷壁酸G-菌的胞壁質(zhì)脂蛋白G-菌的脂多糖鏈球菌的M蛋白金葡菌的A蛋白大腸桿菌的硫氧化還原蛋白脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和線粒體等的構(gòu)象與組成耐藥質(zhì)粒、藥物代謝酶大腸桿菌的硫氧化還原蛋白大腸桿菌與枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌死菌與活菌我們的前期研究構(gòu)建了基于THz時域光譜的生物傳感器平臺建立了THz波譜解析方法，并成功應(yīng)用于多種生物大分子的解析dsDNA和ssDNA 血紅蛋白鏈球菌的M蛋白

金葡菌的A蛋白初步證實了THz波檢測細(xì)菌的可行性金黃色葡萄球菌和大楊桿菌存在顯著的THz波譜特征差異透射式THz時域光譜系統(tǒng)球菌和桿菌的亞THz振動光譜差異dsDNA的THz波譜差異JBiomedOptics,2014(Accepted)AnalBioanalChem.2012;402(4):1625-1634JInfraredMilliTerahzWaves.2014;35:318-324THz波在細(xì)菌快速偵檢測領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景證實：THz波檢偵細(xì)菌具有其它技術(shù)無法比擬的優(yōu)勢THz波飛行質(zhì)譜分子診斷傳統(tǒng)方法檢測原理分子和菌體的THz波譜指紋菌體蛋白質(zhì)組特征峰引物擴(kuò)增、探針檢測細(xì)菌生長與生化鑒定細(xì)菌培養(yǎng)不需要需要不需要需要完成時間<10min>24小時培養(yǎng)+檢測1~2小時>48小時培養(yǎng)鑒定操作過程簡便簡便相對復(fù)雜相對復(fù)雜配套試劑無無需要需要活菌/死菌鑒別能否否否成像能力圖譜合一否否能在體檢測能否否否15無需標(biāo)記、無需試劑、實時檢測、簡便快速我們的研究結(jié)果提示：THz波技術(shù)

用于細(xì)菌快速偵檢尚需要解決兩個關(guān)鍵問題16特異性：不同分子和細(xì)菌的THz波譜存在相互干擾靈敏度：達(dá)不到細(xì)菌快速偵檢的預(yù)期檢測需求水敏感性：THz波的水吸收干擾使其難以適用于臨床生物樣本檢測需要引入新的技術(shù)手段獲得有效的THz波譜檢測信號1、THz波譜信號的放大與保真：獲取細(xì)菌的THz波譜信號17本項目擬研發(fā)的亞THz納米生物傳感器及其波譜解析技術(shù)可有效解決上述問題2、THz波譜解析：物理信息與醫(yī)學(xué)信息的相互轉(zhuǎn)化國內(nèi)外尚無細(xì)菌的THz波譜數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有解析方法不適用于臨床樣本的液相檢測條件缺乏有效的識別算法與相關(guān)軟件研究內(nèi)容與實施方案在已有的工作基礎(chǔ)上，研究能夠使THz具備細(xì)菌快速偵檢能力的三大關(guān)鍵技術(shù)181.亞THz納米生物傳感器關(guān)鍵技術(shù)的研究微流體技術(shù)狹槽納米天線技術(shù)亞THz傳感技術(shù)擬解決的關(guān)鍵技術(shù)一：特異性所處復(fù)雜檢測環(huán)境存在分子和細(xì)菌的THz波譜相互干擾，達(dá)不到識別單細(xì)胞的信噪比需求例如：不同種屬細(xì)菌、不同種類分子的THz波振動波譜相互干擾19已有的研究均主要集中于單一分子或細(xì)胞檢測解決途徑：微流體技術(shù)20微流體的微腔道可實現(xiàn)單細(xì)菌的分離與制備NatProtoc.2014Mar;9(3):694-710具備識別單細(xì)胞的信噪比，為無需細(xì)菌培養(yǎng)、單細(xì)菌水平直接檢測提供技術(shù)途徑20構(gòu)建微流體樣本池：微細(xì)加工技術(shù)分析樣本池基質(zhì)特性：聚四氟乙烯、聚苯乙烯、picarin等基質(zhì)的THz波參數(shù)研究微腔道工藝參數(shù)：單元壁厚度、直徑、表面修飾方式21技術(shù)目標(biāo)：單個細(xì)菌依次通過THz光源探測處集成了狹槽納米天線的微流體樣本池結(jié)構(gòu)示意圖擬解決的關(guān)鍵技術(shù)二：靈敏度THz波檢測靈敏度與檢驗醫(yī)學(xué)臨床需求失配，仍然無法摒除細(xì)菌培養(yǎng)而實現(xiàn)細(xì)菌的直接檢測22NanoLett.2013Apr10;13(4):1782-6AmJBiomedEng.2012;2(4):143-154THz波現(xiàn)有技術(shù)預(yù)期的檢測需求質(zhì)量靈敏度分子mg級pg~μg級細(xì)菌102~103個1個尺度靈敏度分子30μm~3mmnm細(xì)菌30μm~3mm<15μm解決途徑：納米光學(xué)天線的信號極端放大23狹槽納米天線：非對稱電磁場環(huán)境能夠極大地增強(qiáng)納米狹槽的局域表面等離子體共振，使檢測靈敏度提高103~1012倍；同時，可突破THz波物理衍射極限，匹配分子和細(xì)菌的檢測尺度納米光學(xué)天線：自由傳播光場與局域能量間相互轉(zhuǎn)換的一種裝置一般是金屬(金、銀等)納米顆粒(球形、三角形、棒狀等形狀)及其相同結(jié)構(gòu)的不同組合NanoLett.2013Apr10;13(4):1782-6構(gòu)建狹槽納米天線檢測單元：自組裝技術(shù)分析檢測單元金屬粒子特性：粒子種類和大小、金屬膜厚度等物理特性研究狹槽納米天線參數(shù)：直徑、寬度、長度、三維比值等24技術(shù)目標(biāo)：THz波探測靈敏度達(dá)到單細(xì)胞水平集成了狹槽納米天線的微流體樣本池結(jié)構(gòu)示意圖擬解決的關(guān)鍵技術(shù)三：水敏感性細(xì)菌檢測特點：液相條件人體來源樣本的共性——體液(液態(tài)水)檢測環(huán)境水干擾——大氣中的水蒸汽25THz對水非常敏感，會導(dǎo)致嚴(yán)重的水吸收干擾，已有的研究均主要集中于固相條件及干燥環(huán)境克服水吸收對靶標(biāo)檢測的干擾AmJBiomedEng.2012;2(4):143-154解決途徑：THz頻段優(yōu)化亞太赫茲(sub-THz)：<1.0THz的頻譜范圍26亞THz頻段的水敏感性遠(yuǎn)低于現(xiàn)有常用THz頻段(>1.0THz)>1.0THz波段水蒸氣吸收峰較密，吸收系數(shù)較高，導(dǎo)致信噪比低<1.0THz的波段，吸收峰較少，峰值較低大氣水蒸汽THz吸收譜液態(tài)水THz吸收譜IEEESensJ.2013Jan;13(1):72-29亞THz波特別適合于液相檢測2.亞THz納米生物傳感器快速偵檢細(xì)菌的新技術(shù)與新方法27通過數(shù)據(jù)庫波譜解析，獲得細(xì)菌的特征波譜，實現(xiàn)單細(xì)胞水平的細(xì)菌定性檢測逐一記錄流經(jīng)檢測單元的不同性狀細(xì)菌的數(shù)量，實現(xiàn)細(xì)菌的定量檢測(1)整合亞THz、微流體、狹槽納米天線等三大關(guān)鍵技術(shù)器件，構(gòu)建亞THz納米生物傳感器(2)不同細(xì)菌的THz波譜特征解析及數(shù)據(jù)庫的建立生物信息學(xué)手段獲得不同細(xì)菌的差異分子細(xì)菌差異分子波譜參數(shù)的分子動力學(xué)模擬與實驗確認(rèn)設(shè)計波譜指紋自動識別軟件構(gòu)建包含20~30種細(xì)菌的初級亞THz表征波譜指紋數(shù)據(jù)庫283.亞THz納米生物傳感器的臨床應(yīng)用研究以結(jié)核桿菌為模式生物，采用亞THz納米生物傳感器檢測50~100例臨床樣本以現(xiàn)有方法為對照，評價亞THz納米生物傳感器的方法學(xué)參數(shù)，使亞THz波譜成為細(xì)菌快速偵檢的新指標(biāo)29特色與創(chuàng)新亞THz納米生物傳感器具備三大技術(shù)突破與創(chuàng)新亞THz傳感技術(shù)降低了水敏感性的干擾，實現(xiàn)液相樣本的檢測微流體技術(shù)可制備與分離單細(xì)胞，提高檢測的特異性狹槽納米天線是信號極端放大系統(tǒng)，達(dá)到檢測單細(xì)胞的靈敏度亞THz納米生物傳感器是“以分鐘計的革命性微生物檢測新技術(shù)和新方法”無需細(xì)菌培養(yǎng)、無需標(biāo)記、無需試劑、實時檢測、簡便快速(2~3分鐘)、直接定性和定量檢測亞THz波譜是細(xì)菌檢測的新指標(biāo)，可廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診治與預(yù)防30乳腺癌在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌已成為女性最常見的惡性腫瘤，約占罹患惡性腫瘤女性總數(shù)的23%；死亡率逐年上升。乳腺癌的早期準(zhǔn)確診斷和病理分型對于患者個體化精準(zhǔn)治療有極為重要的意義。不同分子分型的乳腺癌的流行病學(xué)危險因素、疾病自然進(jìn)程及全身或局部治療反應(yīng)不盡相同。2011年國際乳腺癌大會上形成專家共識，可根據(jù)免疫組織化學(xué)檢測的ER、PR、HER-2及Ki-67結(jié)果確定乳腺癌的分子分型。分子亞型免疫組化表型臨床治療及預(yù)后luminalAER（＋）

和（或）PR（＋），HER-2（－），Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)＜14%最常見的類型，預(yù)后最好，內(nèi)分泌治療luminalB①ER（＋）和（或）PR（＋），HER-2（－），Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)≥14%細(xì)胞增殖速度快，內(nèi)分泌治療加化療②ER（＋）

和（或）PR（＋），HER-2（＋），Ki-67陽性細(xì)胞數(shù)不限內(nèi)分泌治療聯(lián)合抗HER一2靶向治療HER-2過表達(dá)ER（－）和PR（－），HER-2（＋）惡性度高，預(yù)后較差，有轉(zhuǎn)移傾向，行化療及抗HER-2治療基底樣型ER（－），PR（－）和HER-2（-），表達(dá)基底細(xì)胞角蛋白和肌上皮標(biāo)記物預(yù)后最差，外科手術(shù)加化療正常乳腺樣ER（－），PR（－）和HER-2（-），表達(dá)正常脂肪組織基因惡性度低，預(yù)后較好，對化療不敏感基于太赫茲時域光譜技術(shù)檢測乳腺癌組織和正常乳腺組織標(biāo)本的結(jié)果顯示THz波技術(shù)在組織層面具有良好的區(qū)分度。但仍需從細(xì)胞層面揭示差異的根本來源，從而為早期診斷、分子分型及組織成像等精準(zhǔn)醫(yī)療中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。Fig.Theterahertzspectroscopicpropertiesforwaterandbreasttissues.PLoSONE(2014)9:1–9乳腺癌基于太赫茲時域光譜技術(shù)對Hela細(xì)胞的單細(xì)胞層研究表明，復(fù)介電常數(shù)虛部與胞內(nèi)生物大分子及水動力學(xué)相關(guān)的慢弛豫過程參數(shù)具有顯著差異性；揭示太赫茲時域光譜技術(shù)能夠在皮秒及亞皮秒時間尺度探測胞內(nèi)生物大分子水合動力學(xué)等關(guān)鍵信息；可實現(xiàn)活細(xì)胞無標(biāo)記整體檢測。JInfraredMilliTerahzWaves(2014)35:493–502乳腺癌乳腺癌本973課題組前期利用太赫茲時域光譜技術(shù)對乳腺癌MCF-7（LuminalA型）與MDA-MB-231（Basal型）細(xì)胞系細(xì)胞懸液進(jìn)行初步研究；顯示兩種懸液的吸收系數(shù)存在顯著差異。拉曼光譜檢測技術(shù)35拉曼光譜(Ramanspectra)拉曼光譜是生物大分子對光子的一種非彈性散射指紋光譜，能夠精確反應(yīng)人體細(xì)胞中生物大分子組分的變化信息，并且，是一種具有極強(qiáng)特異性的無標(biāo)記檢測技術(shù)36拉曼光譜無標(biāo)記檢測的基本原理在于，待檢測靶標(biāo)(細(xì)胞及分子)與正常細(xì)胞或分子相比較，存在質(zhì)與量的顯著差異，通常具有特征性的拉曼光譜指紋圖譜，因此，可通過細(xì)胞或分子的特征性拉曼圖譜實現(xiàn)已知和未知靶標(biāo)的檢測37正常肺細(xì)胞SAEC、肺癌細(xì)胞A549及分別經(jīng)過阿霉素DOX處理后細(xì)胞的平均拉曼光譜圖(A)和拉曼光譜經(jīng)過主成分分析的二維視圖(B)肺癌和乳腺癌細(xì)胞的拉曼光譜鑒定.A:肺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞435、和具有轉(zhuǎn)移抑制基因的乳腺癌細(xì)胞435/BRMS1的平均拉曼光譜圖；B-C:肺癌細(xì)胞A549、乳腺癌細(xì)胞435和具有轉(zhuǎn)移抑制基因的乳腺癌細(xì)胞435/BRMS1的拉曼光譜主成分分析三維視圖(B)和聚類圖(C)38拉曼光譜用于生物樣本檢測分析具有顯著優(yōu)勢：39樣品無需接觸樣品無需制備快速分析檢測適合含水樣品成像快速簡便適合差異分析

…………有助于提升我國拉曼光譜研究與應(yīng)用的國際影響力有助于占領(lǐng)人與動物血液樣本直接無損檢測制高點有助于打贏西方對我國基因資源掠奪的基因保衛(wèi)戰(zhàn)以人與動物血液快速非接觸甄別的特殊需求為導(dǎo)向，基于RAMAN光譜技術(shù)，優(yōu)化適合于人和動物血液樣本拉曼光譜檢測分析參數(shù)，闡明人與動物血液成分的光譜特征，構(gòu)建人與動物血液拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，最終建立人和常見動物血液快速甄別數(shù)學(xué)模型，為“人與常見動物細(xì)胞非接觸式識別裝置研發(fā)”提供RAMAN光譜分析方法及數(shù)據(jù)庫支持。 41通過對血液樣本拉曼特征光譜的實驗研究和規(guī)律探索，初步獲取不同種屬及不同狀態(tài)血液樣品的拉曼光譜基本特征參數(shù)人、犬、兔血液拉曼光譜差異性人和狗，兔子血液拉曼特征峰差異性（1157cm-1）：全血（A）和干的血液（B）BA

人兔子狗全血0.480.200.15干的血液0.830.230.09人和動物特征峰峰面積比值（1157/1003cm-1

）人和動物1157cm-1特征峰強(qiáng)度存在一定的差異性人和猴子血液拉曼光譜差異HumanMonkey峰位置75510031223137613971549156415821603161916351653人全血0.921.000.900.240.392.611.852.370.992.511.046.05猴全血1.261.000.271.127.042.982.202.280.962.552.760.33人和猴子血液（全血）拉曼特征峰面積的比值（以1003cm-1為參考）人和猴子血液拉曼光譜差異HumanMonkey峰位置75510031223137613971549156415821603161916351653人全血0.921.000.900.240.392.611.852.370.992.511.046.05猴全血1.261.000.271.127.042.982.202.280.962.552.760.33人和猴子血液（全血）拉曼特征峰面積的比值（以1003cm-1為參考）SPR生物傳感器檢測技術(shù)4546表面等離子體共振（SPR）是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，利用金屬膜和液面界面，光的全反射引起的物理光學(xué)現(xiàn)象,可靈敏分析分子間的相互作用47納米金信號放大系統(tǒng)應(yīng)用特異性識別分子與生物素修飾靶標(biāo)復(fù)合體捕獲鏈霉親和素修飾的納米金磁微粒，增加傳感器表面附著量，成功建立了納米金信號放大系統(tǒng)選用了生物素-親和素這一具有高親和力的配對分子作為信號放大的連接元件，不僅具有較高的信號放大效率和特異性，而且具有高通用性

傳感器芯片生物素化靶標(biāo)納米金磁顆粒特異性識別分子48抗原-抗體相互作用動態(tài)監(jiān)測研究：在SPR免疫傳感器芯片上固定特異性抗體，用以監(jiān)測其與4種尿液中的微量蛋白的相互作用，抗原抗體反應(yīng)變化趨勢明顯、直觀，便于分析SPR傳感器自動分析系統(tǒng)應(yīng)用研究

免疫傳感器芯片檢測尿液中微量蛋白的實時動態(tài)分析49定量分析研究：微量蛋白濃度與SPR角呈線性關(guān)系，線性擬合后R2

均高于0.98靈敏度研究：4種尿微量蛋白的檢測靈敏度與放射免疫分析法相當(dāng)，優(yōu)于ELISA法、火箭免疫電泳自顯影法

A1M5pg/mlB2