細(xì)胞培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞工程的一項(xiàng)基本技術(shù)，它是細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、細(xì)胞凋亡、染色體導(dǎo)入和基因轉(zhuǎn)移等項(xiàng)研究的技術(shù)基礎(chǔ)，同時(shí)體外培養(yǎng)細(xì)胞也是醫(yī)學(xué)研究尤其是腫瘤學(xué)研究的極其重要的材料。原代培養(yǎng)：由體內(nèi)直接取出組織或細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點(diǎn)是：組織細(xì)胞剛脫離機(jī)體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。最常用的原代培養(yǎng)方法有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。

繼代培養(yǎng)（傳代培養(yǎng)）：將原代細(xì)胞分散后繼續(xù)在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。傳代代數(shù)細(xì)胞的世代（增殖代數(shù)）

區(qū)分:一、動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動(dòng)三、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的同步化方法二、動(dòng)物細(xì)胞系的建立技術(shù)講授提綱四、動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)一、動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動(dòng)建立一個(gè)體外研究體系和實(shí)驗(yàn)平臺(tái)——用于理論及應(yīng)用研究（如育種等）;建立細(xì)胞系——用于功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)（如藥物、材料等）。目的：對(duì)動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的關(guān)鍵主要集中在培養(yǎng)組織的選擇、培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、添加物（包括營(yíng)養(yǎng)成分與生長(zhǎng)因子等）的篩選，以及細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)等幾個(gè)方面。（一）最適培養(yǎng)組織的篩選要想成功地進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，作為組織來(lái)源的動(dòng)物個(gè)體，一定要健康無(wú)毒。一般說(shuō)來(lái)，作為組織來(lái)源的動(dòng)物越年輕，其細(xì)胞相對(duì)就越幼稚，仍然保持有較強(qiáng)的分裂能力，細(xì)胞培養(yǎng)成功的可能性就越大。因此，動(dòng)物的胚胎或幼體應(yīng)是起始細(xì)胞培養(yǎng)的最佳材料，故選擇細(xì)胞培養(yǎng)用組織的一般原則是盡可能選用胚胎組織或幼小個(gè)體的器官進(jìn)行培養(yǎng)。（二）最佳培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化要想成功地進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，除確定最佳組織來(lái)源外，首先必須確定細(xì)胞培養(yǎng)的最適營(yíng)養(yǎng)液，主要包括培養(yǎng)基的成分、類(lèi)型及所需補(bǔ)充的營(yíng)養(yǎng)成分。1.基本培養(yǎng)基的選擇RPMI1640 MEM DMEM M199F-12 ACM L-15 GIMDM TC-100 ……常用的培養(yǎng)基：2.培養(yǎng)用血清的選擇胎牛血清(FBS)馬血清(HS)新生牛血清(NBS)小牛血清(BCS)無(wú)血清培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，為了模仿體內(nèi)環(huán)境條件，利于細(xì)胞代謝生長(zhǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液中通常要加入5-15％的動(dòng)物或人的血清，由于血清來(lái)源有限、價(jià)格高、且血清成分復(fù)雜難測(cè)，每一批血清的成分都有可能不同，這使大量細(xì)胞培養(yǎng)受到了限制，培養(yǎng)條件也難以保持完全一致。因此近年來(lái)又出現(xiàn)了一種新的細(xì)胞培養(yǎng)方法——無(wú)血清培養(yǎng)，即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加各種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子、激素等，取代血清，以使培養(yǎng)基成分更加明確。3.其它補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)成分的選擇除補(bǔ)充血清外，還要考慮添加一些其它的營(yíng)養(yǎng)成分。這些營(yíng)養(yǎng)成分包括碳水化合物、氨基酸、維生素和生長(zhǎng)因子等。許多學(xué)者的研究表明，適量的葡萄糖、氨基酸、維生素C對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)也是必需的。在正常培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分裂與代謝需要添加適量的生長(zhǎng)因子。根據(jù)目前的研究結(jié)果，能促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂的有EGF、bFGF、TGF-

、IGF

、PDGF、NGF……

添加葡萄糖的培養(yǎng)液有助于細(xì)胞的貼壁和生長(zhǎng)。1.培養(yǎng)液的pH值2.培養(yǎng)液的滲透壓3.培養(yǎng)溫度滲透壓 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 生長(zhǎng)分裂pH值 代謝 細(xì)胞生長(zhǎng) 分裂溫度 代謝 細(xì)胞生長(zhǎng) 分裂（三）最佳培養(yǎng)條件的確立貼壁細(xì)胞所覆蓋的培養(yǎng)容器表面積的百分比與細(xì)胞外形是評(píng)價(jià)細(xì)胞培養(yǎng)成功與否的重要指標(biāo)。

原代培養(yǎng)成功啟動(dòng)后，細(xì)胞開(kāi)始分裂并逐漸長(zhǎng)成單層（Monolayer），此時(shí)便要準(zhǔn)備傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)時(shí)，要根據(jù)細(xì)胞的分裂速度和數(shù)量決定細(xì)胞的傳代瓶數(shù)（或1傳3，或1傳2，或2傳3

）和換液量（或全換液，或半換液）。一、動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動(dòng)三、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的同步化方法二、動(dòng)物細(xì)胞系的建立技術(shù)講授提綱四、動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)二、動(dòng)物細(xì)胞系的建立技術(shù)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，世界上已建立了大量細(xì)胞株或系，我國(guó)業(yè)已建立了上百個(gè)細(xì)胞系，為細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)做出了重大貢獻(xiàn)。正常組織的初級(jí)培養(yǎng)物，在傳代培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞的壽命有一定的限度，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無(wú)限生長(zhǎng)下去。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而成為具有癌性的細(xì)胞。建立細(xì)胞系的關(guān)鍵就是要千方百計(jì)地使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，即用某種因子刺激正常細(xì)胞發(fā)生突變而具有癌性。目前，使正常培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的刺激因子主要有三大類(lèi)：物理因子、化學(xué)因子和生物因子。（一）物理因子能使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的物理因子主要是指一些電離輻射：放射性同位素的射線(xiàn)：60Co、14C、131I、32P、3H……X-rayUVlight物理致癌劑（二）化學(xué)因子對(duì)細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化作用的化學(xué)因子達(dá)數(shù)千種之多，其中有無(wú)機(jī)物，也有有機(jī)物。無(wú)機(jī)物：砷、石棉、鉻化合物、鎳化合物、鎘化合物……有機(jī)物：苯、聯(lián)苯胺、雜環(huán)烴、煤焦油、黃曲霉素(aflatoxin)、亞硝胺、煙堿(nicotine)……化學(xué)致癌劑（三）生物因子對(duì)細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化作用的生物因子為腫瘤病毒(tumorvirus)，又稱(chēng)致癌病毒(oncogenicvirus)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有許多種病毒可引起動(dòng)物或植物發(fā)生腫瘤。腫瘤病毒中有DNA病毒，也有RNA病毒。Rous肉瘤病毒(Roussarcomavirus)：一種RNA病毒，其基因組中含有一個(gè)癌基因src，其編碼產(chǎn)物為具有蛋白質(zhì)激酶活性的pp60src蛋白，可使許多蛋白質(zhì)磷酸化，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞癌變。pp60src蛋白是一種膜蛋白，結(jié)合在質(zhì)膜的內(nèi)表面，它可催化磷酸根轉(zhuǎn)移到一些蛋白質(zhì)的Tyr殘基上，使磷酸化Tyr在細(xì)胞中的含量提高了10倍。Rous肉瘤病毒(Roussarcomavirus)srcpp60src蛋白(Src蛋白,Tyr激酶)PTyr蛋白質(zhì)磷酸化細(xì)胞癌變無(wú)活性pp60srcRSV病毒中v-src基因的致癌機(jī)制圖解質(zhì)膜跨膜受體蛋白細(xì)胞外配體活性pp60src質(zhì)膜跨膜受體蛋白磷酸化Tyr有兩種作用：一是使細(xì)胞的正常調(diào)節(jié)機(jī)制失調(diào)，細(xì)胞增殖失去控制；二是使細(xì)胞的粘著性喪失，易于發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。SV40（simianvacuolatingvirus40）細(xì)胞增殖被阻斷無(wú)活性細(xì)胞增殖因子(E2F)(基因調(diào)節(jié)蛋白)Rb蛋白(封閉細(xì)胞增殖因子)p53蛋白(關(guān)閉細(xì)胞增殖開(kāi)關(guān))同抑癌基因產(chǎn)物-Rb蛋白和p53蛋白結(jié)合，使它們失活，從而使細(xì)胞發(fā)生癌變p53蛋白R(shí)b蛋白活性細(xì)胞增殖因子基因轉(zhuǎn)錄T抗原(封閉Rb和p53蛋白)DNA病毒激活細(xì)胞增殖SV40病毒T抗原的致癌機(jī)理圖解——T抗原（T-antigen）：具有轉(zhuǎn)化作用SV40感染雖然動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板中均可生長(zhǎng)，但在體外利用培養(yǎng)罐進(jìn)行大量培養(yǎng)就不象培養(yǎng)細(xì)菌和酵母那樣容易，是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)難題之一。目前這一問(wèn)題已經(jīng)解決，人們?cè)谖⑸锱囵B(yǎng)用的發(fā)酵罐的基礎(chǔ)上研制出一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)罐，用以大量培養(yǎng)懸浮細(xì)胞（1個(gè)振動(dòng)攪拌器：可以使細(xì)胞得到充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣）。附：轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞的規(guī)?；囵B(yǎng)一、動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動(dòng)三、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的同步化方法二、動(dòng)物細(xì)胞系的建立技術(shù)講授提綱四、動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)細(xì)胞分裂的同步化，對(duì)研究細(xì)胞周期和染色體標(biāo)本制作等是非常有用的。只有使細(xì)胞周期同步化，獲得大量同周期階段的細(xì)胞，才有可能對(duì)一定周期階段的細(xì)胞進(jìn)行狀態(tài)和生化分析。只有使細(xì)胞周期同步化，才能獲得大量同步分裂的細(xì)胞，如利用秋水仙素處理得到大量中期染色體，以便進(jìn)行染色體組型、核酸原位雜交及FISH等研究。三、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的同步化方法細(xì)胞周期同步化的方法大致可分為3大類(lèi)：一、分選二、化學(xué)同步化三、物理同步化這一類(lèi)方法是把處于同一周期階段的細(xì)胞挑選出來(lái)，加以集中。最簡(jiǎn)單的方法是用微吸管在顯微鏡下手工挑選中期細(xì)胞。如果用專(zhuān)門(mén)的電子裝置挑選，每秒鐘可挑出1000個(gè)細(xì)胞。但要快速取得大量同步細(xì)胞，則要使用其它方法如過(guò)濾、蔗糖梯度離心和膜淘洗等。一、分選1.過(guò)濾：將細(xì)胞培養(yǎng)物用多層濾膜過(guò)濾，小細(xì)胞首先通過(guò)，集中起來(lái)進(jìn)行同步分裂。此法常用于微生物的分選。2.蔗糖梯度離心：混合細(xì)胞懸液經(jīng)密度梯度離心后，小細(xì)胞集中在蔗糖梯度的頂部，搜集起來(lái)便可進(jìn)行同步培養(yǎng)。酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可用此法同步化分選。3.膜淘洗：把細(xì)胞培養(yǎng)物先結(jié)合到濾膜上，再用溫?zé)岬呐囵B(yǎng)液連續(xù)緩慢流經(jīng)倒置濾膜，新形成的子細(xì)胞被沖洗下來(lái)，將在短時(shí)間內(nèi)沖洗下來(lái)的細(xì)胞集中則成為高度同步的細(xì)胞。如果濾膜夠大，即可得到大量同步化細(xì)胞。一種辦法是將培養(yǎng)液中減少某種細(xì)胞必需的營(yíng)養(yǎng)成分，過(guò)一段時(shí)間后再把該成分加進(jìn)去，以達(dá)到同步化的目的。二、化學(xué)同步化

另一種辦法是使用某種化學(xué)物質(zhì)將細(xì)胞暫時(shí)阻滯到有絲分裂的一定時(shí)期。大腸桿菌T-15秋水仙素、高壓氧化亞氮(nitrusoxide)、胸腺嘧啶核苷阻斷劑、長(zhǎng)春花堿1.溫度——細(xì)胞同步化的有效手段由于分裂前細(xì)胞中的一些酶對(duì)溫度非常敏感，高溫可使分裂停止,而生物合成繼續(xù)進(jìn)行，因此有些細(xì)胞發(fā)生分裂的時(shí)間推遲，其它后進(jìn)的細(xì)胞便趁此趕上來(lái)，達(dá)到同步化狀態(tài)。

Zeutnen和Scherbaum(1954年)發(fā)現(xiàn)，將四膜蟲(chóng)(Tetrahymena)在29.5℃(最適溫度)與34℃(抑制溫度)兩種溫度下每30min進(jìn)行交替培養(yǎng)，經(jīng)7次循環(huán)之后，再于24℃下培養(yǎng)，結(jié)果有85%的細(xì)胞發(fā)生了同步分裂。三、物理同步化2.輻射——引起細(xì)胞同步分裂的方法之一

分裂前的細(xì)胞對(duì)射線(xiàn)很敏感，輻射可使細(xì)胞在分裂前積累,隨后去除輻射，細(xì)胞便在同一時(shí)間開(kāi)始分裂。3.有絲分裂抖落法——哺乳動(dòng)物細(xì)胞同步分裂的常用方法有絲分裂抖落法(mitoticshaking-off)的原理是，處于有絲分裂階段的細(xì)胞外形變圓，附著力降低，因此經(jīng)震抖后很易從附著的表面上脫落下來(lái)；而處于其它階段的細(xì)胞因呈伸展?fàn)疃街?qiáng)，故不易被抖落，故通過(guò)震抖可將處于分裂期的細(xì)胞收集起來(lái)。細(xì)胞周期的同步化只是暫時(shí)性的，經(jīng)過(guò)幾代分裂之后，細(xì)胞群又會(huì)處于周期不同步狀態(tài)。一、動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)的啟動(dòng)三、培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的同步化方法二、動(dòng)物細(xì)胞系的建立技術(shù)講授提綱四、動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)四、動(dòng)物細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)由于生物細(xì)胞、組織器官甚至胚胎和個(gè)體在超低溫（-196℃）狀態(tài)下代謝完全停止，生命處于“靜止”狀態(tài)，故能得以長(zhǎng)期保存。冷凍保存技術(shù)就是以此為理論基礎(chǔ)、以液氮為冷凍劑對(duì)生物材料進(jìn)行長(zhǎng)期保存的技術(shù)。冷凍保存對(duì)于動(dòng)物種質(zhì)保存、遺傳多樣性保護(hù)以及動(dòng)物育種研究等具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。（一）動(dòng)物細(xì)胞的凍存技術(shù)冷凍保護(hù)劑及其濃度的選擇冷凍時(shí)細(xì)胞所處的生理狀態(tài)降溫速率冷凍保存溫度復(fù)蘇速率影響動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存效率的主要因子包括：冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，但對(duì)細(xì)胞一般均有毒性作用。1、冷凍保護(hù)劑的選擇冷凍保護(hù)劑按其能否滲透到細(xì)胞內(nèi)可分為兩種：滲透型冷凍保護(hù)劑非滲透型冷凍保護(hù)劑甘油、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇等常用的滲透型抗凍劑有：甘油、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇、乙酰胺、丙二醇等。滲透型冷凍保護(hù)劑：多屬于低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子，發(fā)生水合作用，使溶液的粘性增加，從而弱化了水的結(jié)晶過(guò)程，達(dá)到了保護(hù)細(xì)胞的目的。非滲透型抗凍劑：能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，它使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)，即可在特定溫度下降低溶質(zhì)濃度，從而起到保護(hù)作用。常用的非滲透型抗凍劑有乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇等。最常用的冷凍保護(hù)劑為二甲基亞砜；有時(shí)也經(jīng)常使用乙二醇、甲醇、甘油、甲醛、蔗糖等。由于每個(gè)物種甚至同一個(gè)物種的不同發(fā)育階段其最適冷凍保護(hù)劑不盡相同，因此，在使用冷凍保護(hù)劑時(shí)，常常單獨(dú)選擇使用某一種冷凍保護(hù)劑或某幾種冷凍保護(hù)劑混合使用。如：鯉魚(yú)不同胚胎發(fā)育時(shí)期的最適冷凍保護(hù)劑不同：桑椹胚時(shí)，二甲基亞砜和蔗糖的冷凍保護(hù)效果較好；半原腸胚時(shí)，二甲基亞砜、蔗糖、甲醇的冷凍保護(hù)效果較好；而心跳期胚胎時(shí)，甲醇，甘油為較好的冷凍保護(hù)劑。再如：斑馬魚(yú)胚胎冷凍保存時(shí)的最適冷凍保護(hù)劑為溶解于0.1M蔗糖中的甲醇，而且甲醇濃度要隨溫度的變化而變化(0℃時(shí)1M；-5℃時(shí)2M；-10℃時(shí)3M；-15℃5M)。大多數(shù)凍存劑都具有一定的毒性，如果讓細(xì)胞暴露在過(guò)高濃度的凍存劑中，會(huì)影響細(xì)胞的存活。在選用凍存劑時(shí)要根據(jù)所用實(shí)驗(yàn)材料、細(xì)胞時(shí)期、細(xì)胞活性狀態(tài)等具體對(duì)凍存劑及其使用濃度進(jìn)行篩選和測(cè)試，才能達(dá)到最佳凍存效果。2、冷凍時(shí)細(xì)胞所處的生理狀態(tài)凍存時(shí)，細(xì)胞所處的生理狀態(tài)非常關(guān)鍵。如細(xì)胞活性非常旺盛，則容易凍存成功，且凍存細(xì)胞的存活率高；如細(xì)胞活性不旺盛，則不易凍存成功，且凍存細(xì)胞的存活率低。凍存時(shí)，多選用處于活躍分裂的對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行凍存，以保證凍存成功和細(xì)胞的高存活率。3、降溫速率降溫速率也要根據(jù)所用實(shí)驗(yàn)材料和具體細(xì)胞類(lèi)型等來(lái)確定。一般采用的降溫程式：緩慢降溫(<1oC/min)降溫速率過(guò)快，在降溫過(guò)程中則會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，刺傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞死亡。4、冷凍保存溫度液氮：-196oC干冰：-100oC超低溫冰箱：-86oC——原則上可永久保存——1年左右——半年左右（二）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇技術(shù)復(fù)蘇的一般原則：盡可能快速?gòu)?fù)溫復(fù)蘇是指凍存細(xì)胞恢復(fù)至常溫后細(xì)胞仍然保持生物活性和正常的生物功能。細(xì)胞復(fù)蘇的成敗，關(guān)鍵在于復(fù)蘇速率！不同細(xì)胞的耐受溫度不同，不可機(jī)械制定復(fù)蘇溫度。如哺乳動(dòng)物37oC，魚(yú)類(lèi)30oC……

細(xì)胞融合細(xì)胞融合是指2個(gè)或2個(gè)以上的細(xì)胞融合成1個(gè)細(xì)胞的過(guò)程。人工的細(xì)胞融合開(kāi)始于1950s，此后作為一門(mén)新興技術(shù)發(fā)展非常快，應(yīng)用范圍也極為廣泛，不僅同種類(lèi)細(xì)胞間可以融合，種間遠(yuǎn)緣細(xì)胞也能融合。

細(xì)胞工程的發(fā)展是建立在細(xì)胞融合基礎(chǔ)上的。在2003年8月出版的《CellResearch》上，一篇論文介紹了上海第二醫(yī)科大學(xué)盛慧珍教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組的研究成果：“那不成人兔雜交了嗎？它是人？是兔？還是半人半兔？”——倫理上的普遍質(zhì)疑他們將一位5歲男孩、兩位成年男性的包皮細(xì)胞、一位60歲女性面部細(xì)胞的細(xì)胞核，放入去掉細(xì)胞核的新西蘭兔卵母細(xì)胞中，成功讓融合后的細(xì)胞發(fā)育到胚泡階段，從而得到胚胎干細(xì)胞。細(xì)胞融合不僅可用于生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，而且在生產(chǎn)實(shí)踐上還有重要的應(yīng)用價(jià)值，如目前在單克隆抗體的制備、核質(zhì)關(guān)系、體細(xì)胞的遺傳和發(fā)育、新品種的培養(yǎng)、免疫作用、疾病的治療和性狀的改良、潛伏病毒的研究等，已取得了顯著的成績(jī)。其中最突出的就是在制作單克隆抗體方面的應(yīng)用！第二節(jié)

雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第三節(jié)

細(xì)胞融合和動(dòng)物新品種培育本章講授提綱第一節(jié)

細(xì)胞融合的技術(shù)方法第一節(jié)

細(xì)胞融合的技術(shù)方法細(xì)胞融合(Cellfusion)又稱(chēng)為細(xì)胞雜交(Cellhybridization)，現(xiàn)多統(tǒng)稱(chēng)為細(xì)胞雜交。同核體(homokaryon)：基因型相同的細(xì)胞融合成的雜交細(xì)胞異核體(heterokaryon)：來(lái)自不同基因型的雜交細(xì)胞根據(jù)所用促融劑的不同，細(xì)胞融合技術(shù)主要可分為四大類(lèi)：病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)化學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)電擊介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)激光介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)一、病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)促融劑：麻疹病毒、副流感病毒、新城雞瘟病毒、仙臺(tái)病毒以及其他一些副粘液科的病毒大體原理：病毒被膜中的糖蛋白含有融合蛋白(fusionprotein),既可介導(dǎo)病毒同宿主細(xì)胞融合,又可誘導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞融合。操作繁瑣；促融效果較好融合蛋白是副粘病毒的兩種包膜糖蛋白之一，其主要功能是引起病毒包膜與靶細(xì)胞膜或被感染的靶細(xì)胞膜之間發(fā)生融合。細(xì)胞融合過(guò)程需要另一種包膜糖蛋白――血凝素-神經(jīng)氨酸酶的協(xié)助。融合蛋白需要和同源性血凝素-神經(jīng)氨酸酶共同表達(dá)才能顯示出融合細(xì)胞的活性。病毒增殖紫外線(xiàn)滅活稀釋細(xì)胞懸液細(xì)胞融合誘導(dǎo)大體操作流程篩選二、化學(xué)介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)促融劑：大體原理：

一般認(rèn)為，PEG改變各類(lèi)細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進(jìn)而使其結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質(zhì)膜在修復(fù)時(shí)相互合并在一起,使兩細(xì)胞的胞質(zhì)溝通,從而造成相互接觸的細(xì)胞之間發(fā)生融合。操作簡(jiǎn)便；促融效果好誘導(dǎo)大體操作流程A細(xì)胞融合細(xì)胞B細(xì)胞A/B細(xì)胞混合物按一定數(shù)量比例混合與細(xì)胞混合物充分混勻一定溫度、一定時(shí)間計(jì)數(shù)篩選PEG配制：加熱溶化，按體積比加入預(yù)熱至50oC的無(wú)血清培養(yǎng)基后混勻，降溫至使用溫度待用PEG配制PEG(MW1000-4000,40~60%)促融效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG分子量越大、濃度越高,對(duì)細(xì)胞的毒性也就越大（在實(shí)驗(yàn)時(shí)常常采用的分子量1000~4000的PEG，濃度一般為40~60%）PEG介導(dǎo)細(xì)胞融合效果的影響因素：1.PEG分子量與濃度:融合效果與溫度成正比（質(zhì)膜流動(dòng)性與溫度成正比），為獲得最佳融合效果,在細(xì)胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當(dāng)提高處理的溫度（哺乳動(dòng)物細(xì)胞，一般采用38~40℃）2.PEG的pH值:pH8.0~8.2：融合效果較好3.PEG作用時(shí)間:處理時(shí)間越長(zhǎng)，融合效果越好,但對(duì)細(xì)胞的毒害也就越大（一般將處理時(shí)間限制在1min之內(nèi)）4.融合溫度:三、電擊介導(dǎo)的細(xì)胞融合技術(shù)操作簡(jiǎn)便、快速/促融效果好/高回收率/對(duì)細(xì)胞毒性小原理：游離動(dòng)物細(xì)胞或去壁原生質(zhì)體，在電融合室中，在高頻交流電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞被極化成偶極子，造成細(xì)胞間相互連接成點(diǎn)接觸狀態(tài)；然后施加方波脈沖予以刺激，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細(xì)胞接觸點(diǎn)處的質(zhì)膜，此時(shí)質(zhì)膜的脂類(lèi)分子發(fā)生重組，同時(shí)由于細(xì)胞表面的張力作用，兩個(gè)點(diǎn)接觸細(xì)胞逐步發(fā)生細(xì)胞融合。BioRad電融合儀動(dòng)物細(xì)胞0.6M甘露醇，0.5mMCaC12·2H2080-300V/cm,0.5-1兆赫茲,30-90秒0.5-1.5KV/cm,幅度脈寬25微秒融合細(xì)胞誘導(dǎo)大體操作流程篩選電擊液懸浮于融合小室的電極間加入至細(xì)胞排列成串電泳效應(yīng)正弦交變電場(chǎng)施加2-3個(gè)脈沖電場(chǎng)施加操作例克隆羊的制做方法原理：貼在一起的兩個(gè)細(xì)胞，用高峰值功率密度激光對(duì)細(xì)胞接觸處的質(zhì)膜進(jìn)行輻照，質(zhì)膜發(fā)生光擊穿，可產(chǎn)生微米量級(jí)的微孔，因質(zhì)膜上的微孔可逆，質(zhì)膜分子在重組過(guò)程中借助細(xì)胞連接處小孔的很高的表面曲率而處于高張力狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生融合。四、激光細(xì)胞融合技術(shù)激光細(xì)胞融合法與其它化學(xué)物理方法相比較具有許多優(yōu)點(diǎn)：（1）能選擇任意兩個(gè)細(xì)胞之間進(jìn)行融合；（2）因僅在兩個(gè)細(xì)胞的接觸點(diǎn)照射激光，故作用于細(xì)胞的應(yīng)力和障礙小;（3）可進(jìn)行非接觸、安全且遠(yuǎn)距離的無(wú)菌操作；（4）能適時(shí)觀察融合過(guò)程。第二節(jié)

雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第三節(jié)

細(xì)胞融合和動(dòng)物新品種培育本章講授提綱第一節(jié)

細(xì)胞融合的技術(shù)方法第二節(jié)

雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體1975年，英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler開(kāi)創(chuàng)了將產(chǎn)生抗體的單個(gè)細(xì)胞同瘤細(xì)胞融合的技術(shù)，解決了上述難題。兩位學(xué)者因此項(xiàng)發(fā)明而獲得了1984年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

動(dòng)物受到抗原刺激后可發(fā)生免疫反應(yīng)，由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。一種抗原可具有不同的決定簇，故可為針對(duì)不同決定簇的多種抗體所識(shí)別。例如純系小鼠，每1種抗原即可為1000—8000種不同的抗體所識(shí)別。但在實(shí)際工作中只能測(cè)出5—6種。1個(gè)B淋巴細(xì)胞只能產(chǎn)生1種抗體。因此要想獲得大量純一的抗體，就必須使一個(gè)B淋巴細(xì)胞大量增殖。令人遺憾的是，1個(gè)B淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下不能無(wú)限大量增殖，因此，試圖通過(guò)培養(yǎng)1個(gè)B淋巴細(xì)胞增殖的方法，來(lái)制備針對(duì)某一特定抗原決定簇的大量單一抗體，是不可能的。而單一抗體無(wú)論在理論研究上還是在實(shí)驗(yàn)應(yīng)用上都有重要的價(jià)值，因而制作大量的單一抗體是擺在學(xué)者面前有待解決的課題。瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可以無(wú)限傳代，是“永生”的細(xì)胞。為了大量制做純一的單克隆抗體，他們?cè)O(shè)計(jì)的方法是，把小鼠骨髓瘤細(xì)胞同經(jīng)綿羊紅細(xì)胞免疫過(guò)的小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）在PEG或病毒的介導(dǎo)下發(fā)生融合。融合的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性：1)在體外培養(yǎng)條件下或移植到體內(nèi)可無(wú)限增殖，2)分泌抗綿羊紅細(xì)胞的抗體。Milestein和Kohler所創(chuàng)立的這種雜交瘤技術(shù)在免疫學(xué)上導(dǎo)致了一場(chǎng)“革命”！學(xué)者們紛紛利用這種技術(shù)來(lái)制造針對(duì)不同抗原的高度純一的單克隆抗體。大體操作流程目的抗原動(dòng)物免疫B淋巴細(xì)胞細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞的篩選分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞的克隆化分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆雜交瘤細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞單克隆抗體抗體檢測(cè)二、雜交瘤技術(shù)的關(guān)鍵操作步驟1.動(dòng)物免疫：目的：在細(xì)胞融合后獲得盡可能多的分泌針對(duì)于該目標(biāo)抗原的特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞.特定目標(biāo)抗原動(dòng)物免疫脾臟中B淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞大量增殖刺激能分泌針對(duì)于該抗原的特異性抗體常規(guī)免疫法脾內(nèi)一次性免疫法短程免疫法體外免疫法常用免疫方法：皮下注射腹腔注射靜脈注射免疫途徑：“省時(shí)”“操作繁瑣”抗原用量少，免疫程序短，不加佐劑，所得單克隆抗體的特異性較高等免疫效果穩(wěn)定；抗原用量多，免疫程序長(zhǎng)，需要添加佐劑，易形成優(yōu)勢(shì)克隆等常規(guī)免疫法：第1次免疫：抗原+福氏完全佐劑第2次免疫：抗原+福氏不完全佐劑第3次免疫：抗原第4次免疫：抗原(皮下注射或靜脈注射)(皮下注射)(皮下注射)(靜脈注射)抗體效價(jià)測(cè)定2、細(xì)胞融合及HAT篩選病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合PEG介導(dǎo)的細(xì)胞融合電擊介導(dǎo)的融合融合激光介導(dǎo)的細(xì)胞融合細(xì)胞融合方法：細(xì)胞懸液的制備與融合(1)脾細(xì)胞懸液的制備：最后一次免疫后第3天制備

(2)骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備：于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期制備(3)細(xì)胞融合：

50%PEG(1000~4000),pH8.0,38oC,1minDNA的合成途徑DNA合成的主要途徑DNA合成的應(yīng)急途徑dUMP(orGln)dTMPDNA四氫葉酸二氫葉酸二氫葉酸還原酶氨基喋呤甲基化次黃嘌呤嘌呤核苷酸嘧啶核苷酸胸腺嘧啶HGPRT,hypoxanthine－guaninephosphoribosyltransferase，次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶;TK,thymidinekinase，胸腺嘧啶核苷激酶TKHGPRTHAT培養(yǎng)基的篩選在HAT選擇培養(yǎng)液中含有次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，當(dāng)DNA主要合成途徑被氨基喋呤阻斷時(shí)，具有HGPRT酶和TK酶的細(xì)胞便可通過(guò)應(yīng)急途徑利用HAT培養(yǎng)液中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成DNA。未融合脾細(xì)胞未融合骨髓瘤細(xì)胞自身融合的脾細(xì)胞自身融合的骨髓瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(脾細(xì)胞/骨髓瘤細(xì)胞)存活存活存活死亡死亡脾細(xì)胞——HGPRT+和TK+用來(lái)制備雜交瘤細(xì)胞的骨髓瘤細(xì)胞——HGPRT-和TK-短命融合后細(xì)胞混合液HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)2周正常培養(yǎng)基HT培養(yǎng)基培養(yǎng)1周HAT培養(yǎng)基的篩選程序：雜交瘤細(xì)胞融合后的細(xì)胞混合液在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周后，只有雜交瘤細(xì)胞能存活下來(lái)所篩選出的雜交瘤細(xì)胞并非均分泌針對(duì)于目的抗原的抗體，還需要把含有分泌抗體雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)孔挑選出來(lái)，因此需要進(jìn)行抗體檢測(cè)。3、抗體檢測(cè)簡(jiǎn)便、快速、敏感;在短時(shí)間內(nèi)能檢測(cè)大量樣品常用方法：酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)間接免疫熒光法(Indirectimmunofluorescence,IFA)放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)雙相擴(kuò)散法要求抗原酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)第1抗體酶第2抗體待檢雜交瘤培養(yǎng)上清液底物有色產(chǎn)物酶標(biāo)儀檢測(cè)技術(shù)原理：4、克隆化在體外培養(yǎng)時(shí)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞的分裂速度要慢于不分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)后很容易丟失，故需要及時(shí)地把分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞挑選出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)。常用克隆化方法：有限稀釋法軟瓊脂平板法顯微挑揀法80個(gè)細(xì)胞/96孔飼養(yǎng)細(xì)胞(feedercells)ELISA法檢測(cè)單克隆雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，選出分泌特異性抗體的陽(yáng)性孔，所分泌抗體即為單克隆抗體。由單一克隆的雜交瘤細(xì)胞分泌的高度純一的抗體，只針對(duì)于一個(gè)抗原決定簇——單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體(monoclonalantibody,MAb)單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：

高度純一高度專(zhuān)一5、大規(guī)模培養(yǎng)——批量生產(chǎn)單克隆抗體的途徑常用的大規(guī)模培養(yǎng)方法：動(dòng)物接種法轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法反應(yīng)器培養(yǎng)法培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)克隆化培養(yǎng)單克隆雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中X抗體的檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞可持續(xù)分泌單克隆抗體規(guī)?；囵B(yǎng)獲得大量單克隆抗體動(dòng)物免疫細(xì)胞融合混合細(xì)胞的HAT篩選)分泌X抗體B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞X抗原B淋巴細(xì)胞瘤的突變株培養(yǎng)數(shù)天后細(xì)胞死亡無(wú)限生長(zhǎng)細(xì)胞分泌X抗體只有雜交瘤細(xì)胞可長(zhǎng)期存活下來(lái)BALB/c雜交瘤技術(shù)操作流程圖解應(yīng)用：疾病的診斷和治療(生物導(dǎo)彈)生物大分子的分類(lèi)、鑒定、定位和分離純化細(xì)胞器的鑒定、定位和分離特定細(xì)胞或病毒的鑒定、定位和分離產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞雜交瘤生產(chǎn)均一的淋巴因子研究生產(chǎn)其它細(xì)胞分泌產(chǎn)物單克隆抗體-藥物的結(jié)合物T細(xì)胞性的淋巴瘤或胸腺瘤同T淋巴細(xì)胞的融合第二節(jié)

雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第三節(jié)

細(xì)胞融合和動(dòng)物新品種培育本章講授提綱第一節(jié)

細(xì)胞融合的技術(shù)方法第三節(jié)

細(xì)胞融合和動(dòng)物新品種培育細(xì)胞融合技術(shù)是首先在動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)驗(yàn)成功的，此后在動(dòng)物細(xì)胞中最成功的應(yīng)用是單克隆抗體雜交瘤技術(shù)，而動(dòng)物細(xì)胞雜交技術(shù)則還主要應(yīng)用于核質(zhì)關(guān)系等理論研究和克隆動(dòng)物的制作中。所謂動(dòng)物細(xì)胞雜交，實(shí)際上也是以細(xì)胞融合為基礎(chǔ)的，即利用人工的方法把分離的不同品種或不同種的動(dòng)物細(xì)胞誘導(dǎo)成融合細(xì)胞，然后再經(jīng)體外培養(yǎng)、分化、植回體內(nèi)等操作生產(chǎn)雜種動(dòng)物的過(guò)程。獲得雜種動(dòng)物的大體技術(shù)路線(xiàn)目標(biāo)動(dòng)物1目標(biāo)動(dòng)物2靶細(xì)胞靶細(xì)胞細(xì)胞融合雜交細(xì)胞的篩選體外培養(yǎng)囊胚植入養(yǎng)母體內(nèi)雜種篩選與鑒定動(dòng)物幼體克隆牛的制做過(guò)程細(xì)胞融合去核盡管動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)已經(jīng)非常成熟，但由于動(dòng)物細(xì)胞核融合過(guò)程中雙親的染色體不親和性問(wèn)題非常嚴(yán)重，兩種動(dòng)物細(xì)胞融合后出現(xiàn)染色體的排斥與丟失現(xiàn)象十分普遍，且丟失幾乎是隨機(jī)性的，因此要篩選出理想的雜種動(dòng)物非常困難。一般來(lái)說(shuō)，兩種動(dòng)物的親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，其染色體排斥和丟失現(xiàn)象就越嚴(yán)重。可見(jiàn)，要獲得理想的雜種動(dòng)物，僅僅依靠?jī)煞N動(dòng)物細(xì)胞的直接雜交是很困難的，這就需要在研究思路上加以開(kāi)拓和創(chuàng)新。目前，在獲得理想雜種動(dòng)物方面，主要?jiǎng)?chuàng)建了核移植與動(dòng)物克隆等的技術(shù)和方法，而且已經(jīng)有了較多運(yùn)用成功的例子，如克隆魚(yú)、克隆蛙、克隆羊、克隆豬、克隆猴、克隆牛等?？寺⊥每寺∝埧寺『锟寺∝i創(chuàng)新應(yīng)用例多莉羊與寄母克隆馬克隆騾子體細(xì)胞克隆牛

細(xì)胞拆合真核細(xì)胞是由細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)兩大部分組成的，細(xì)胞的正常生命活動(dòng)都是在這兩部分密切配合下進(jìn)行的，兩部分間有一定的相互關(guān)系，為了探明這種相互關(guān)系的機(jī)理，學(xué)者們創(chuàng)建了細(xì)胞拆合技術(shù)。物理法化學(xué)法根據(jù)使用方法的不同，細(xì)胞拆合可以分為以下兩種類(lèi)型：所謂細(xì)胞拆合，就是把核與質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，然后把不同來(lái)源的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核相互配合，形成核質(zhì)雜交細(xì)胞。第一節(jié)

物理法

最早使用的核質(zhì)分離技術(shù)是用機(jī)械的方法或短波光把細(xì)胞核去掉。例如用微玻璃針或微吸管將原生動(dòng)物或魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)甚至哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞的細(xì)胞核去掉。還可使用紫外線(xiàn)或激光把細(xì)胞核破壞掉,形成去核的胞質(zhì)體，然后用微吸管吸入其它細(xì)胞核，組成新的雜交細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。核移植操作示意圖核移植操作流程圖兩棲類(lèi)的核移植第二節(jié)

化學(xué)法細(xì)胞松弛素B(cytochalasinB)有破壞微絲的作用。1967年Carter發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞松弛素B能誘發(fā)體外培養(yǎng)的小鼠細(xì)胞排核。至20世紀(jì)70年代初，Prescott用細(xì)胞松弛素B處理哺乳類(lèi)細(xì)胞，并結(jié)合離心技術(shù)，可將細(xì)胞分拆為核體(karyoplast)和胞質(zhì)體(cytoplast)兩部分。利用這種方法所得的胞質(zhì)體，純度可達(dá)90％以上，一次處理可獲得較大量的胞質(zhì)體。由于核體外表包有1層細(xì)胞膜和少量胞漿，因而也稱(chēng)為小細(xì)胞(minicell)。在PEG或仙臺(tái)病毒的介導(dǎo)下，核體可同另一胞質(zhì)體融合，形成重組細(xì)胞(reconstitutedcell)。重組細(xì)胞亦能合成RNA和進(jìn)行細(xì)胞分裂。為了把重組細(xì)胞與未去核的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)，應(yīng)先進(jìn)行標(biāo)記。將準(zhǔn)備制取核體的細(xì)胞，用3H-嘧啶核苷標(biāo)記核；而準(zhǔn)備制取胞質(zhì)體的細(xì)胞用小乳膠粒(Φ0.5μm)標(biāo)記細(xì)胞質(zhì)(乳膠?？杀煌淌蛇M(jìn)入細(xì)胞質(zhì))。真正融合的重組細(xì)胞，核為3H標(biāo)記，細(xì)胞質(zhì)中含有乳膠粒。大體操作流程細(xì)胞（制取核體用）細(xì)胞（制取胞質(zhì)體用）3H-嘧啶核苷標(biāo)記————小乳膠粒標(biāo)記雜交細(xì)胞細(xì)胞松弛素B細(xì)胞松弛素B離心離心核體胞質(zhì)體融合細(xì)胞器的裝配

細(xì)胞器的拆合是離體的裝配過(guò)程。第三節(jié)

細(xì)胞拆合工程的內(nèi)容線(xiàn)粒體的裝配細(xì)胞膜的裝配細(xì)胞拆合工程包括3個(gè)方面的內(nèi)容：

細(xì)胞的裝配

利用顯微操作器進(jìn)行細(xì)胞各部分的解剖，細(xì)胞各部分物質(zhì)的抽取和移植、注入各物質(zhì)、測(cè)量微電位的變化等。

細(xì)胞質(zhì)雜種細(xì)胞的研究胞質(zhì)雜種細(xì)胞是深入研究細(xì)胞質(zhì)作用的重要樣品，是不同種系之間的一種真正的新型細(xì)胞，在適宜條件下能成功地生存下去。在植物中已有煙草的細(xì)胞質(zhì)雜種個(gè)體。

1950年，美國(guó)科學(xué)家RobertBriggs和同事ThomasKing從豹蛙胚胎中取出一個(gè)細(xì)胞，用玻璃微針管取出其中的細(xì)胞核，再成功地將之注入到去核的卵細(xì)胞中。

兩年后，兩人完善了移植技術(shù)，在豹蛙的一系列實(shí)驗(yàn)中40%的重組卵發(fā)育成胚胎、蝌蚪和幼蛙，這是人類(lèi)第一次培養(yǎng)出的細(xì)胞核移植蛙，即克隆蛙。他們的研究結(jié)果發(fā)表在1952年3月出版的美國(guó)《國(guó)家科學(xué)院院刊》上。

童第周：《魚(yú)類(lèi)細(xì)胞核移植》《鯉魚(yú)細(xì)胞核和鯽魚(yú)細(xì)胞質(zhì)配合而成的核質(zhì)雜種魚(yú)》

1981年，中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所陳宏溪領(lǐng)導(dǎo)的研究小組把成年三倍體鯽魚(yú)的腎臟細(xì)胞核移植到二倍體鯽魚(yú)的去核卵子里獲得了三倍體的克隆魚(yú)并發(fā)育成成體，證明成年魚(yú)的體細(xì)胞也可以去分化和再程序化，具有發(fā)育成個(gè)體的全能性。研究論文發(fā)表在1986年的《水生學(xué)報(bào)》上，這是世界上第一次報(bào)道的體細(xì)胞克隆動(dòng)物。1.1963年童第周等首先報(bào)道，在魚(yú)類(lèi)中建立胚胎“細(xì)胞核移植”即“克隆”技術(shù)。2.1972年童第周等首先報(bào)道，在魚(yú)類(lèi)中獲得了“核質(zhì)雜種克隆魚(yú)幼魚(yú)”。中國(guó)的克隆魚(yú)3.1980年童第周等首先報(bào)道，在魚(yú)類(lèi)中獲得了“核質(zhì)雜種克隆魚(yú)”。草魚(yú)核—武昌魚(yú)去核卵獲得的“核質(zhì)雜種克隆魚(yú)”

武昌魚(yú)第一代移核魚(yú)草魚(yú)第二代移核魚(yú)4、1982年，中科院海洋所吳尚勤等報(bào)道用金魚(yú)的紅血球核移到去核金魚(yú)卵內(nèi)獲得了克隆魚(yú)成體。（此實(shí)驗(yàn)未重復(fù)）5、1986年，武漢中科院水生所陳宏溪等報(bào)道用培養(yǎng)的鯽魚(yú)腎細(xì)胞核移到鯽魚(yú)去核卵內(nèi)獲得了克隆魚(yú)成體。(此實(shí)驗(yàn)未重復(fù))6、1996年，沙市中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所余來(lái)寧等報(bào)道用培養(yǎng)的草魚(yú)肝細(xì)胞核移到草魚(yú)未去核卵內(nèi)獲得了克隆魚(yú)成體。（此實(shí)驗(yàn)未重復(fù)）

這種去核和移核手術(shù)很精細(xì)，必須在顯微鏡下用顯微操縱儀進(jìn)行操作，因而選用的材料有一定局限性，一些較小的體細(xì)胞，用這種移核方法很難奏效。細(xì)胞拆合技術(shù)在基礎(chǔ)研究方面是一種很有用的手段，利用這種手段證明了細(xì)胞核的核酸合成方式和基因表達(dá)受細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)的影響。例如，不產(chǎn)生白蛋白的小鼠淋巴細(xì)胞同能分泌白蛋白的大鼠肝癌細(xì)胞融合所組成的雜交細(xì)胞，既能產(chǎn)生大鼠白蛋白，也能產(chǎn)生小鼠白蛋白。

哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)與胚胎移植

第一節(jié)

胚胎培養(yǎng)早在1913年Brachet就嘗試對(duì)兔囊胚進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，可是由于對(duì)各種動(dòng)物胚胎所需的體外培養(yǎng)液配方不清楚，致使這方面工作在20世紀(jì)的上半世紀(jì)發(fā)展緩慢。1957年，美國(guó)學(xué)者Whitten找到了能使小鼠早期胚胎在體外生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)液配方，從而為哺乳動(dòng)物體外胚胎培養(yǎng)打開(kāi)了一條通路。哺乳動(dòng)物胚胎培養(yǎng)和胚胎移植在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)的發(fā)展中占有重要地位。近20多年來(lái)，世界上許多實(shí)驗(yàn)室均做了大量工作，發(fā)展迅速。把受精卵和不同發(fā)育時(shí)期的早期胚胎取到體外進(jìn)行培養(yǎng)，不僅是研究胚胎發(fā)育機(jī)理的重要手段，而且在培育試管嬰兒和試管動(dòng)物方面有著很大的應(yīng)用價(jià)值。哺乳動(dòng)物胚胎對(duì)發(fā)育條件要求嚴(yán)格，而且各種動(dòng)物胚胎所需的營(yíng)養(yǎng)條件又有所不同，因此無(wú)法制定胚胎培養(yǎng)液的通用配方。體外受精不同時(shí)期胚胎的體外發(fā)育潛能一定的合成培養(yǎng)液一定的氣相條件從已有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，體外胚胎培養(yǎng)有下列幾個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：成熟的卵子在試管內(nèi)同精子相遇完成受精作用的過(guò)程，稱(chēng)為體外受精。卵子的取得方法有多種，如自然排卵、激素誘發(fā)超數(shù)排卵(superovulation)、從卵巢手術(shù)取卵。人工受精率同卵子成熟度關(guān)系極大：卵巢中越接近排卵時(shí)間的卵子，受精率越高；未成熟或過(guò)熟的卵子受精率低下。一、體外受精人工受精所用的精子必須是獲能(capacitation)的，直接排出的精子或從附睪中取出的精子不能授精。所謂獲能即是精子在雌性生殖管道中停留期間，發(fā)生了一定的生理、生化和形態(tài)變化，從而獲得了同卵子結(jié)合的能力的過(guò)程。在體外，利用卵巢濾泡液、血清、輸卵管液、子宮液和人工培養(yǎng)液處理，同樣可使精子獲能。丙酮酸鈉、乳酸鈉和BSA對(duì)小鼠精子體外受精力的影響培養(yǎng)液成分卵數(shù)精子穿入的卵子數(shù)（%）基礎(chǔ)培養(yǎng)液

+20毫克分子濃度乳酸鈉

+1毫克分子濃度丙酮酸鈉

+4毫克/毫升BSA*

+

以上三種成分18224221925833002065143289（0）（9）（30）（65）（88）*BSA,小牛血清白蛋白人工培養(yǎng)液中的丙酮酸鈉、乳酸鈉和小牛血清白蛋白（BSA）對(duì)小鼠精子的獲能影響很大。受精卵和最早期胚胎較難培養(yǎng)。例如，從豬輸卵管中收集到的受精卵，90％能發(fā)育到2細(xì)胞期，但很少超過(guò)4細(xì)胞期，可是從子宮中收集到的6-8細(xì)胞期的胚胎，卻有90％的可發(fā)育到桑棋胚或囊胚。又如牛受精卵：6％可培養(yǎng)到8-12細(xì)胞期；2細(xì)胞期胚胎：則有26％可發(fā)育到8-12細(xì)胞期；8細(xì)胞期胚胎：則有51％可發(fā)育到桑椹胚。二、不同時(shí)期胚胎的體外發(fā)育潛能例如，1956年Whitten最早配制的培養(yǎng)液只能使8細(xì)胞期鼠胚發(fā)育成囊胚。1957年Whitten發(fā)現(xiàn)，如果把培養(yǎng)液中加入乳酸鈣，則可使2細(xì)胞胚胎發(fā)育到囊胚。1967年Whittingham和Biggers又相繼發(fā)現(xiàn)，小鼠合子在含丙酮酸/乳酸的培養(yǎng)液中很容易分裂到2-細(xì)胞期。后來(lái)他們證明，丙酮酸和草酰乙酸是第一次卵裂的單一能源，不必要含有乳酸。綜上所述，在早期胚胎培養(yǎng)時(shí)，要牢記“受精卵和最早期胚胎較難培養(yǎng)”的規(guī)律，務(wù)必要根據(jù)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同選擇特定時(shí)期的胚胎，以便成功地啟動(dòng)動(dòng)物的胚胎培養(yǎng)。各種動(dòng)物胚胎對(duì)培養(yǎng)液成分要求不同。目前常用的培養(yǎng)液有BMOC-3液、Whitten液、Whittingham液、Ham’sF10+20%小牛血清、SOF培養(yǎng)液、PBS+15%小牛血清、TCM-199組織培養(yǎng)液、M12培養(yǎng)液、M16培養(yǎng)液等。三、一定的合成培養(yǎng)液例如，體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物早期胚胎往往存在一個(gè)發(fā)育阻斷（blocksofdevelopment）現(xiàn)象，即從受精卵開(kāi)始的體外培養(yǎng)很難一直發(fā)育到囊胚階段，而是停留在某一時(shí)期，無(wú)法向下發(fā)育。培養(yǎng)液組成成分對(duì)早期胚胎發(fā)育至關(guān)重要，不同動(dòng)物種類(lèi)以及不同發(fā)育時(shí)期的胚胎對(duì)培養(yǎng)液組成成分的要求不同。每種動(dòng)物都有比較固定的阻斷時(shí)期，如小鼠的2-細(xì)胞阻斷(2-cellblock)，是指小鼠體外培養(yǎng)的受精卵分裂一次成為2-細(xì)胞后，便不再繼續(xù)分裂，而如果從2-細(xì)胞晚期開(kāi)始培養(yǎng)則可以發(fā)育到囊胚。其它動(dòng)物如牛的的阻斷時(shí)期為8-16細(xì)胞時(shí)期，豬為4-細(xì)胞時(shí)期。針對(duì)這一現(xiàn)象，人們首先從改變培養(yǎng)液成分入手，分析阻礙發(fā)育的原因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖對(duì)小鼠胚胎發(fā)育有抑制作用，是造成2-細(xì)胞阻斷的原因。于是，Chatot(1988)對(duì)BMOC-2培養(yǎng)液進(jìn)行了改良，形成了目前受精卵體外培養(yǎng)普遍采用的CZB培養(yǎng)液，它是以谷氨酰氨代替葡萄糖，結(jié)果90%左右的受精卵發(fā)育到4-細(xì)胞時(shí)期，2-細(xì)胞阻斷被克服了。值得注意的是：葡萄糖雖然抑制小鼠胚胎2-細(xì)胞向4-細(xì)胞的發(fā)育，但葡萄糖對(duì)4-細(xì)胞以后的胚胎發(fā)育又是必需的。克服體外發(fā)育阻斷的另一方法為共同培養(yǎng)(co-culture)，是指將胚胎與輸卵管上皮細(xì)胞或子宮上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)，以促進(jìn)胚胎發(fā)育。利用共培養(yǎng)技術(shù)已使豬、牛、羊等克服了體外發(fā)育阻斷現(xiàn)象。哺乳動(dòng)物早期胚胎與輸卵管上皮或子宮上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)系統(tǒng)也是研究胚泡著床機(jī)理的良好手段。按照早期胚胎發(fā)育的不同階段中胚胎對(duì)環(huán)境成分的不同要求，配制出階段性的系列培養(yǎng)液，進(jìn)行序列更換，以滿(mǎn)足胚胎在體外不同發(fā)育階段生長(zhǎng)的需要，促進(jìn)胚胎的體外發(fā)育。序貫培養(yǎng)滿(mǎn)足了胚胎的生理需求和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，胚胎在體外條件下也能發(fā)育到囊胚的階段，序貫培養(yǎng)的囊胚更有活力，種植的潛能高。

序貫培養(yǎng)

目前已有多種商品化的序貫培養(yǎng)基應(yīng)用于臨床并取得較好效果：如G1.2、G2.2,S1、S2,Q1、Q2、Q3,P1、P2等系列培養(yǎng)基。G1,G2系列培養(yǎng)基：

G1含有與輸卵管液濃度相同的碳水化合物以及早卵裂期胚胎需要的非必需氨基酸、谷氨酰胺和EDTA，因此用于8-細(xì)胞期以?xún)?nèi)的胚胎培養(yǎng)。

G2的碳水化合物含量與子宮腔環(huán)境的含量相同，另外G2同時(shí)含有必需和非必需氨基酸，而沒(méi)有影響囊胚形成的EDTA。新的G3已經(jīng)面市，內(nèi)含透明質(zhì)酸。

小鼠胚對(duì)滲透壓的要求為276mosmol/L。

2-8細(xì)胞期的牛胚：滲透壓低于270mosmol/L時(shí)，分裂一次的細(xì)胞為57%；高于300mosmol/L時(shí)，則為26%。胚胎對(duì)培養(yǎng)液的滲透壓也有著嚴(yán)格的要求！牛卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)早期胚胎的培養(yǎng)液需配合一定的氣相條件。一般用含5％CO2的空氣或5％O2和90％N2的混合氣體調(diào)節(jié)pH值。胚胎對(duì)培養(yǎng)液酸度變化很敏感，pH值超出7.2-7.4的范圍，會(huì)引起胚胎死亡。磷酸緩沖液系統(tǒng)的酸度較穩(wěn)定，氣相可用空氣。四、一定的氣相條件進(jìn)行體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物胚胎，一般只是著床前的早期胚胎。胚胎著床后，同母體建立了密切的物質(zhì)交換關(guān)系，對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件的要求更加復(fù)雜。因此對(duì)著床后時(shí)期的胚胎體外培養(yǎng)更加困難。現(xiàn)在將小鼠胚胎培養(yǎng)時(shí)間最長(zhǎng)的是Y.O.Hsu和L.T.Chen(1983)把受精后3.5d的鼠胚培養(yǎng)到相當(dāng)于在子宮內(nèi)正常發(fā)育的第10d胚胎。胚胎發(fā)育經(jīng)過(guò)了原腸胚、神經(jīng)胚、體節(jié)期等階段，培養(yǎng)到第10d時(shí)發(fā)育出了肢芽、眼泡以及肺、肝、胰等器官。這在哺乳動(dòng)物胚胎全體外培養(yǎng)的道路上前進(jìn)了一大步。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外均有人實(shí)驗(yàn)將小鼠或兔等的胚泡與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞共培養(yǎng)，建立胚泡著床模型，試圖探明哺乳動(dòng)物胚泡著床的機(jī)理。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)孕酮、雌二醇等激素能促進(jìn)胚泡與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞之間的粘附率。第二節(jié)

胚胎移植

從一頭受孕母畜（供體）的生殖管道中取出受精卵或發(fā)育到一定時(shí)期的早期胚胎，移植到與供體母畜同步發(fā)情的母畜（受體）生殖管道的一定部位，繼續(xù)發(fā)長(zhǎng)、發(fā)育，長(zhǎng)成子畜的技術(shù)稱(chēng)為胚胎移植。在人類(lèi)中供體婦女和受體婦女在排卵周期同步的情況下，轉(zhuǎn)移受精卵或早期胚胎，在受體婦女體內(nèi)孕育到期的技術(shù)亦稱(chēng)胚胎移植。最早進(jìn)行胚胎移植實(shí)驗(yàn)的是Heape(1890)，他把4-細(xì)胞期的安哥拉家兔胚胎移植到一只交配過(guò)的比利時(shí)野兔體內(nèi)，生下了2只安哥拉小兔，獲得了成功。此后，學(xué)者們又對(duì)小鼠、綿羊、山羊、豬、牛和馬等哺乳動(dòng)物以及人胚進(jìn)行移植，均取得了成功。據(jù)統(tǒng)計(jì)，至1980年世界上通過(guò)胚胎移植生出的牛已超過(guò)2萬(wàn)頭。

胚胎移植技術(shù)有著重要的實(shí)踐意義，目前此行業(yè)興旺發(fā)達(dá)，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)效益。胚胎移植的應(yīng)用價(jià)值主要表現(xiàn)在：提高良種母畜的繁殖力胚胎分割/胚胎移植1頭母畜1次生雙胎胚胎性別選擇減少精液消耗凍存良種胚胎保護(hù)瀕危動(dòng)物試管嬰兒試管動(dòng)物許多細(xì)胞工程技術(shù)的最終步驟1頭母牛（母馬）1年生1胎，一生只能生育10頭左右的仔畜，可是其卵巢中卻含有75,000個(gè)生殖細(xì)胞，因此絕大部分卵未被利用。如果利用激素做超數(shù)排卵，1次可排10個(gè)卵，其中6—7個(gè)能成為正常胚胎，移植到寄母體內(nèi)成孕，平均可長(zhǎng)成3一4個(gè)胚。1頭母牛1年可做5次超級(jí)排卵，所以1年產(chǎn)仔數(shù)可比自然狀態(tài)增產(chǎn)15倍以上。1、提高良種母畜的繁殖力中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所和內(nèi)蒙古三北種羊場(chǎng)(1975)合作，使用超數(shù)排卵技術(shù)，使1頭7歲半的黑色三北羔皮羊一次排18個(gè)卵。這些卵受精后，移植到白色蒙古羊體內(nèi)，結(jié)果產(chǎn)出了11頭三北羔皮羊。因此，利用這種技術(shù)在短期內(nèi)即可使優(yōu)良家畜大幅度增加。牛1次成孕，一般只能1胎1犢，雙胎不多見(jiàn)。用胚胎移植可著雙胎，繁殖率可擴(kuò)大1倍。2、1頭母畜1次生雙胎將胚胎分割為二，再結(jié)合胚胎移植，造成一卵雙胎，使仔畜育成率提高1倍。3、胚胎分割/胚胎移植繁殖奶牛、奶羊可選擇雌性胚胎進(jìn)行移植。利用體外授精法，再進(jìn)行胚胎移植，精液用量少，可減少良種公畜精液的消耗。5、減少精液消耗4、胚胎性別選擇可把良種家畜的胚胎做超低溫凍存，建立“胚胎庫(kù)”。國(guó)際間的家畜貿(mào)易，可通過(guò)運(yùn)送冷凍胚胎進(jìn)行，不必再笨重地運(yùn)輸成體種畜。美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué)（1984）試圖利用胚胎移植術(shù)把亞洲水牛胚移植到當(dāng)?shù)厝榕ｓw內(nèi)孕育，以供肉牛、乳牛用。6、凍存良種胚胎充分利用瀕危動(dòng)物的卵子，結(jié)合胚胎冷凍和人工受精技術(shù)，盡可能多的得到瀕危動(dòng)物的胚胎，然后再經(jīng)胚胎移植技術(shù)，提高瀕危動(dòng)物的受孕率，以獲得更多的成體動(dòng)物。7、保護(hù)瀕危動(dòng)物利用體外受精結(jié)合胚胎移植，可以解除人的某些不孕癥。因?yàn)榫雍吐炎邮窃谠嚬苤薪Y(jié)合受精的，所以這樣得到的嬰兒又稱(chēng)試管嬰兒。1978年，世界上第一個(gè)試管嬰兒在英國(guó)誕生。目前，世界上出生的試管嬰兒已有上萬(wàn)個(gè)。近幾年，我國(guó)在這方面的工作進(jìn)展也相當(dāng)快。在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用這種技術(shù)還可減少先天遺傳病和提高后代的健康素質(zhì)。8、試管嬰兒同樣利用先體外授精再進(jìn)行胚胎移植技術(shù)而孕育出的動(dòng)物即為試管動(dòng)物。試管動(dòng)物技術(shù)已被應(yīng)用于畜牧業(yè)，所用卵子可以是從屠宰場(chǎng)廢棄的卵巢中分離獲得，其經(jīng)濟(jì)效益是顯而易見(jiàn)的。9、試管動(dòng)物許多細(xì)胞工程技術(shù)都是以胚胎移植作為最終步驟。如嵌合體技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)以及核移植技術(shù)等都是對(duì)哺乳動(dòng)物早期胚胎進(jìn)行操作的，而要使被操作胚胎變成動(dòng)物個(gè)體，必須通過(guò)胚胎移植使被操作胚胎在寄母子宮內(nèi)發(fā)育成熟。10、許多細(xì)胞工程技術(shù)的最終步驟第三節(jié)

無(wú)性繁殖在生產(chǎn)實(shí)踐中，要通過(guò)有性繁殖方法保存物種的某一理想表型是非常困難的?？墒?，如果將通過(guò)選育獲得的新表型，再通過(guò)無(wú)性生殖方式保存并繁殖（即生產(chǎn)同卵個(gè)體無(wú)性系）是一條可行的途徑，且很有經(jīng)濟(jì)價(jià)值。動(dòng)物雖不能通過(guò)體細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生個(gè)體，但通過(guò)性細(xì)胞的單性生殖有可能產(chǎn)生后代。單性生殖在自然界中即存在，不僅有許多無(wú)脊椎動(dòng)物是采取有性繁殖和單性繁殖兩種方式交替繁殖，而且在脊椎動(dòng)物中進(jìn)行孤雌生殖的也不乏其例，如有些爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)即是行孤雌生殖。火雞和少數(shù)雞種中也有孤雌生殖的品系，能至少獲得一代仔雞。這是通過(guò)單倍體卵二倍體化發(fā)育成的。雌核發(fā)育體細(xì)胞核移植同卵多胎目前，進(jìn)行人工單性生殖的技術(shù)途徑有如下幾種：卵子受精后，再將雄原核去掉，使雌原核加倍成純合二倍體，發(fā)育成胚胎后移植到寄母動(dòng)物體內(nèi)，發(fā)育成純合二倍體雌性個(gè)體。利用這種技術(shù)可以快速獲得動(dòng)物純系。如3周即可得到1個(gè)純種小鼠，9個(gè)月就可得到1頭純合子母牛。1、雌核發(fā)育另一種雌核發(fā)育方式是超越卵子的正常發(fā)育過(guò)程，不受精，只用簡(jiǎn)單的刺激，即可激發(fā)卵子發(fā)育。刺激的方法很多，如低溫、化學(xué)物質(zhì)和機(jī)械刺激等。朱冼等用帶紅細(xì)胞的玻璃針刺蟾蜍卵，少數(shù)卵發(fā)育成了有生殖力的成體，并得到了沒(méi)有“外祖父”的蟾蜍。但迄今還沒(méi)有得到哺乳動(dòng)物發(fā)育完全的單性生殖體，只在小鼠中發(fā)育到24體節(jié)階段。Hoppe(1982)把單性生殖體細(xì)胞核移入去核受精卵中，獲得了活仔鼠。目前，魚(yú)類(lèi)雌核發(fā)育研究相當(dāng)活躍，因?yàn)轸~(yú)類(lèi)精子處理及體外受精都比較容易。雌核發(fā)育在魚(yú)類(lèi)上具有很高的經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)顯微操作技術(shù)把早期胚胎一分為二或多個(gè)，然后經(jīng)移植發(fā)育成完全正常的個(gè)體。該技術(shù)對(duì)表型優(yōu)良的家畜具有實(shí)用價(jià)值。2、同卵多胎胚胎細(xì)胞分離技術(shù)又包括：胚胎分割卵裂球分離個(gè)體個(gè)體個(gè)體個(gè)體胚胎分割技術(shù)：一般是用不銹鋼刀片或微細(xì)玻璃針，將桑椹胚或囊胚切割成2部分或4部分，切割成的每一部分再單獨(dú)發(fā)育成個(gè)體。桑椹胚囊胚卵裂球分離技術(shù)是將2-細(xì)胞、4-細(xì)胞或8-細(xì)胞時(shí)期的早期胚胎用胰蛋白酶處理，使細(xì)胞之間的連接松散，再用玻璃微吸管將胚胎吹散成單個(gè)分裂球，再對(duì)每一個(gè)分裂球進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。當(dāng)然，并非每個(gè)分離的單個(gè)分裂球都能發(fā)育成動(dòng)物個(gè)體。核移植在兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)中已進(jìn)行了大量工作，如Gordon在兩棲類(lèi)中的移核實(shí)驗(yàn)和童第周等在魚(yú)類(lèi)種間的移核實(shí)驗(yàn)，都獲得了核質(zhì)雜交后代。3、體細(xì)胞核移植然而對(duì)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，由于卵的體積太小，移核技術(shù)比較困難。1981年，Illmensee和Hoppe將小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞核移入去核受精卵內(nèi)，發(fā)育成了有生育力的小鼠，這是哺乳動(dòng)物中首次克隆成功的報(bào)道。原來(lái)認(rèn)為，只有內(nèi)細(xì)胞細(xì)胞或稍晚期的胚胎內(nèi)胚層和外胚層細(xì)胞的核，移植后可發(fā)育到期?，F(xiàn)在，人們已將成年動(dòng)物體細(xì)胞核移植到去核成熟卵母細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)育成了完全由供體細(xì)胞核決定其遺傳性狀的動(dòng)物個(gè)體，這就是──克隆動(dòng)物技術(shù)。第四節(jié)

嵌合體制做由兩個(gè)或多個(gè)具有不同基因型的胚胎或胚胎和胚胎細(xì)胞合并在一起發(fā)育成的一個(gè)完整的個(gè)體，稱(chēng)之為嵌合體。嵌和體內(nèi)不同來(lái)源的細(xì)胞相互調(diào)節(jié)、相互作用、共同發(fā)育，所以嵌合體個(gè)體中的組織器官是由不同基因型的細(xì)胞群組成的。例如，將黑色小鼠與白色小鼠的早期胚胎聚合培養(yǎng)后，將發(fā)育成黑白鑲嵌毛色的嵌合體小鼠。由于嵌合體中不同來(lái)源的胚胎或細(xì)胞帶有不同的遺傳標(biāo)記，如毛色、同工酶、基因型等，通過(guò)測(cè)定嵌合體成體中這些遺傳標(biāo)記，就可以知道不同來(lái)源細(xì)胞的發(fā)育命運(yùn)以及發(fā)育中細(xì)胞間的相互作用。小鼠各組織和器官的發(fā)生幾乎都是通過(guò)嵌合體方式研究的。因此，哺乳動(dòng)物嵌合體技術(shù)是研究哺乳動(dòng)物發(fā)育遺傳和細(xì)胞分化的有用手段。1965年由Mintz首次得到了活到成年的正常嵌合體小鼠。聚集法胚泡注射法制做哺乳動(dòng)物嵌合體的方法主要有兩種：聚集法是指將兩個(gè)或多個(gè)已去掉透明帶的早期胚胎，簡(jiǎn)單地聚合在一起培養(yǎng)成一個(gè)嵌合體胚胎的過(guò)程。聚集法操作簡(jiǎn)單，不需要特殊儀器，適用于同種、發(fā)育同步的胚胎，Mintz得到的第1只嵌合體小鼠即是用聚集法制作的。Gardner(1968)又創(chuàng)建了利用顯微操作儀將細(xì)胞注射至胚泡囊胚腔的方法制作嵌合體，注射的細(xì)胞既可以是卵裂球，也可以是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞。胚泡注射法可用于種間嵌合體制作，胚胎可處于不同的發(fā)育階段。把發(fā)育早期（8細(xì)胞期）的單性生殖體同正常二倍體有性生殖胚胎結(jié)合，所產(chǎn)生的嵌合體能發(fā)育完全。嵌合體中幾乎所有的組織，甚至配子細(xì)胞，都來(lái)源于單性生殖體的細(xì)胞。起初，嵌合體技術(shù)主要用于發(fā)育生物學(xué)的基礎(chǔ)研究。現(xiàn)在隨著細(xì)胞生物學(xué)其它技術(shù)的發(fā)展，嵌合體技術(shù)又有了新的應(yīng)用。由于ES細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞）能參與嵌合體各種組織，尤其是生殖系的形成，所以近年來(lái)人們常用胚泡注射法將ES細(xì)胞注射進(jìn)囊胚腔以獲得嵌合體。用于嵌合體制作的ES細(xì)胞往往是經(jīng)過(guò)基因突變處理的，這樣通過(guò)嵌合體個(gè)體可以研究突變基因的作用。此外，通過(guò)一定方法將某種基因?qū)隕S細(xì)胞，再用此ES細(xì)胞制作嵌合體，則可得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。事實(shí)上，通過(guò)ES細(xì)胞制作嵌合體正是獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種新途徑。第五節(jié)

胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞（EmbryonicStemCells,簡(jiǎn)稱(chēng)為ES細(xì)胞）作為細(xì)胞工程的一種材料，比其它細(xì)胞具有更多的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)：1.ES細(xì)胞不但具有發(fā)育多能性，而且可以在體外培養(yǎng)、傳代，這樣就可以按照人們的意愿對(duì)其進(jìn)行一系列的操作，如外源基因轉(zhuǎn)化、克隆、增殖、凍存、顯微注射等。實(shí)驗(yàn)證明，ES細(xì)胞注射到囊胚腔后，可參與宿主胚胎的發(fā)育，形成正常的胚胎即嵌合體胚胎。ES細(xì)胞不但形成嵌合體效率高和具有分化出各種組織的潛能，而且能形成有功能的生殖細(xì)胞。2.ES細(xì)胞在不同生長(zhǎng)條件下具有不同的功能狀態(tài)，如在飼養(yǎng)層細(xì)胞上ES細(xì)胞呈未分化狀態(tài)，在沒(méi)有飼養(yǎng)層的條件下或經(jīng)誘導(dǎo)ES細(xì)胞可分化成多種細(xì)胞，甚至形成胚狀體。所以，通過(guò)ES細(xì)胞可以進(jìn)行細(xì)胞分化、組織發(fā)生以及基因表達(dá)與調(diào)控的研究。3.胚胎干細(xì)胞不僅是基礎(chǔ)理論研究中一種很重要的實(shí)驗(yàn)材料，而且在實(shí)際應(yīng)用上用途廣泛、應(yīng)用價(jià)值很高。因此，ES細(xì)胞技術(shù)自1980s初建立以來(lái)，一直受到越來(lái)越廣泛的重視。制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物基因打靶克隆細(xì)胞和組織目前，ES細(xì)胞在下列三個(gè)方面得到了廣泛的應(yīng)用。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)中，有一種很重要的方法即是胚胎干細(xì)胞法。在培養(yǎng)條件下，定向改造ES細(xì)胞基因組或向基因組中添加一個(gè)特定的基因，獲得穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞后，將其注射到胚泡中，參加內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育和分化；胚胎發(fā)育成了嵌合體，ES細(xì)胞也能分化出生殖細(xì)胞，從而達(dá)到改造動(dòng)物品種的目的。一、制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的ES細(xì)胞途徑

轉(zhuǎn)化的ES細(xì)胞可通過(guò)核移植產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；通過(guò)聚合法或注射法產(chǎn)生嵌合體，經(jīng)過(guò)嵌和體的繁育獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。未受精卵受精卵DNA注射DNA注射ES細(xì)胞轉(zhuǎn)化ES細(xì)胞核移植聚合法注射法嵌合體轉(zhuǎn)基因動(dòng)物早期胚胎囊胚通過(guò)ES細(xì)胞途徑生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物正成為一個(gè)很有發(fā)展前景的研究和應(yīng)用方向！自從20世紀(jì)80年代末發(fā)明了基因敲除(geneknock-out)技術(shù)以后，胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用價(jià)值更顯重要，所謂的基因敲除又稱(chēng)基因打靶(genetargeting)。二、基因打靶打靶DNA構(gòu)建物（targetingDNAconstruct）具有兩個(gè)基本要點(diǎn)：①除掉為基因主要部分編碼的外顯子，而代之以新霉素盒(neomycincassette)(neo基因)，以便通過(guò)抗藥性和藥物敏感性來(lái)篩選正確插入靶DNA的ES細(xì)胞；②至少要有10％以上的同源DNA序列，以獲得較好的定點(diǎn)整合效率。基因敲除能夠定向改變胚胎干細(xì)胞內(nèi)的目的基因，使之失活，并根據(jù)基因同源重組的原理，將基因失活的DNA構(gòu)建物插入到ES細(xì)胞基因組的特定位點(diǎn)。再將這種特定基因失活的胚胎干細(xì)胞注射到宿主胚泡中，發(fā)育成嵌合體，篩選出目的基因缺陷型純合子個(gè)體，此即為基因敲除動(dòng)物?；虼虬袑?shí)驗(yàn)操作過(guò)程示意圖外顯子目標(biāo)基因抗藥基因打靶載體轉(zhuǎn)化ES細(xì)胞篩選抗藥細(xì)胞(靶插入細(xì)胞)目標(biāo)基因缺陷型通過(guò)檢測(cè)目的基因突變?cè)趥€(gè)體發(fā)育中的時(shí)空效應(yīng)和出現(xiàn)的異常表型，即可確定目的基因的調(diào)控功能。利用這種技術(shù)可制成針對(duì)某種疾病的動(dòng)物模型，并作為制定基因治療方案的依據(jù)。目前，已制成用于研究血管疾病的載脂蛋白E(apolipoproteinE,apoE)和低密脂蛋白受體(lowdensitylipoproteinreceptor,LDLR)的基因敲除動(dòng)物。目前此項(xiàng)技術(shù)需要改進(jìn)的關(guān)鍵，是如何提高定位敲除目的基因的效率。apoE基因敲除動(dòng)物已用于研究apoE基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化形成的分子機(jī)理等。器官移植一直是困擾醫(yī)學(xué)臨床治療的一大難題，這不僅是因?yàn)榇嬖诋愺w排斥問(wèn)題，而且還有器官來(lái)源匱乏的問(wèn)題。胚胎干細(xì)胞具有分化成各種細(xì)胞的潛能，如果ES細(xì)胞建系技術(shù)成熟，就可利用誘導(dǎo)人體胚胎干細(xì)胞定向分化的方法，制作病人所需要的細(xì)胞和組織。這無(wú)疑將是醫(yī)學(xué)上的一項(xiàng)重大成就。三、克隆細(xì)胞和組織正因?yàn)镋S細(xì)胞具有這種特點(diǎn)，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者正在努力培養(yǎng)人體ES細(xì)胞系，以利用誘導(dǎo)人體胚胎干細(xì)胞定向分化的方法，制作病人所需要的細(xì)胞和組織。如果此項(xiàng)技術(shù)獲得成功，就可利用細(xì)胞克隆技術(shù)來(lái)修復(fù)因疾病而受損傷的人體細(xì)胞或器官。這無(wú)疑是醫(yī)學(xué)上的一項(xiàng)重大成就。ES細(xì)胞雖然具有良好的應(yīng)用價(jià)值，但對(duì)它的分離培養(yǎng)卻非常困難。關(guān)鍵問(wèn)題是仍未找到各種動(dòng)物各自適宜的培養(yǎng)條件，而適宜的培養(yǎng)條件是胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)關(guān)鍵。雖然各國(guó)均努力試圖建立經(jīng)濟(jì)動(dòng)物如豬、牛、羊、兔等的ES細(xì)胞，但收效甚微，至今成功建立胚胎干細(xì)胞的動(dòng)物僅為小鼠、豬和兔。就小鼠ES細(xì)胞而言，除了合適的培養(yǎng)基外，還必需有飼養(yǎng)層的存在，飼養(yǎng)層細(xì)胞可用貼壁生長(zhǎng)的STO細(xì)胞或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制作。如果有飼養(yǎng)層的存在，則ES細(xì)胞能保持其未分化狀態(tài)；而一旦離開(kāi)飼養(yǎng)層，ES細(xì)胞就會(huì)生長(zhǎng)緩慢并且逐漸分化。ES細(xì)胞之所以依賴(lài)于飼養(yǎng)層，是因?yàn)轱曫B(yǎng)層細(xì)胞可分泌一種稱(chēng)為白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor,LIF)的生長(zhǎng)因子，該因子可抑制ES細(xì)胞分化，在傳代培養(yǎng)過(guò)程中保持未分化狀態(tài)。視黃酸視黃酸胰島素，甲狀腺素巨噬細(xì)胞集落刺激因子白細(xì)胞介素素-3白細(xì)胞介素素-1聯(lián)丁?；鵦AMP，視黃酸FGFFGF-2EGFFGF-2PDGF巨噬細(xì)胞神經(jīng)元平滑肌細(xì)胞脂肪細(xì)胞

星形膠質(zhì)細(xì)胞少突細(xì)胞ES細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化也是一項(xiàng)有待突破的技術(shù)。培養(yǎng)的ES細(xì)胞ES細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)是把已知基因轉(zhuǎn)移到真核細(xì)胞，并整合到基因組中得到穩(wěn)定表達(dá)的技術(shù)。是改變物種遺傳性狀的最根本途徑。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是1980s初興起的一項(xiàng)生物高技術(shù)，1980年，Gordon將克隆的外源基因?qū)胄∈笫芫训男墼酥?，率先獲得了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動(dòng)、植物方面都有開(kāi)展，而且正以強(qiáng)勁的勢(shì)頭在發(fā)展。通過(guò)人工操作的方式，將外源基因整合到動(dòng)物的基因組內(nèi)，使該動(dòng)物能穩(wěn)定地將此基因遺傳給后代的實(shí)驗(yàn)技術(shù)就稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物最早最成功的例子是“超級(jí)小鼠”（supermouse）的誕生。1982年底美國(guó)四個(gè)實(shí)驗(yàn)室報(bào)導(dǎo)，將大白鼠生長(zhǎng)激素的結(jié)構(gòu)基因GH與金屬硫蛋白基因MT-1的啟動(dòng)子拼接在一起，組成雜交基因MGH。然后把克隆化MGH基因用顯微注射器注入到小鼠受精卵原核內(nèi)，將受精卵再移植到假孕母鼠體內(nèi)發(fā)育，結(jié)果得到了7只帶有MGH基因的小鼠，其中6只顯著大于同窩小鼠。這些小鼠生長(zhǎng)快，74天時(shí)的體重即接近同窩正常小鼠的兩倍。有的超級(jí)小鼠血清中的生長(zhǎng)激素（GH）水平竟達(dá)正常小鼠的100—800倍。這一成果的意義在于不僅為遺傳工程和遺傳疾病的研究提供了模型，而且也為加速經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的生長(zhǎng)提供了新的技術(shù)途徑。一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作過(guò)程二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)方法三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的理論和實(shí)踐意義講授提綱轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)是一項(xiàng)復(fù)雜而且涉及內(nèi)容廣泛的技術(shù)，其制作過(guò)程大致如下：1、目的基因的獲得、克隆與重組一、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作過(guò)程2、目的基因的導(dǎo)入3、目的基因整合與表達(dá)的檢測(cè)利用限制性?xún)?nèi)切酶獲取目的基因；利用mRNA反轉(zhuǎn)錄出cDNA；人工體外合成DNA片斷；PCR法擴(kuò)增特定基因片斷。1、目的基因的獲得、克隆與重組（1）目的基因的獲得：要把基因轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，首先要把基因克隆化，然后，給目的基因接上適當(dāng)?shù)膯?dòng)子進(jìn)行重組，以使外源基因有效地整合和表達(dá)。目前已經(jīng)得到了若干真核細(xì)胞克隆化基因，如

-珠蛋白基因、TK基因等。（2）目的基因的克隆與重組：即基因轉(zhuǎn)移，利用顯微操作或其它方法把外源基因注入到動(dòng)物早期胚胎中，再把胚胎植入到動(dòng)物子宮內(nèi)，發(fā)育成的個(gè)體不僅能表達(dá)注入基因決定的性狀，而且能把該基因傳到第二代。2、外源基因的導(dǎo)入轉(zhuǎn)入的基因一般是隨機(jī)整合到宿主動(dòng)物基因組，但并非所有的外源基因都能整合到動(dòng)物基因組，而整合的基因也并非都能表達(dá)。通過(guò)顯微注射將外源基因?qū)牒?，大部分基因在?xì)胞經(jīng)過(guò)幾次分裂后就丟失，只有一少部分DNA得以整合。3、外源基因整合與表達(dá)的檢測(cè)因此，需要對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行嚴(yán)格的篩選！目前常用的檢測(cè)手段是利用PCR方法結(jié)合Southernblot雜交法來(lái)檢測(cè)外源基因是否整和并表達(dá)。只有外源基因整和并表達(dá)的動(dòng)物才是真正的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因小鼠的制做過(guò)程圖解在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作中，基因轉(zhuǎn)移是影響外源基因整合效率的十分關(guān)鍵的一個(gè)步驟，也是技術(shù)難度最大的一個(gè)步驟，基因轉(zhuǎn)移需要熟練的操作技術(shù)和技巧。原核顯微注射法逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎法胚胎干細(xì)胞法精子載體法二、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)方法目前，動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的方法已發(fā)展成許多種，其中主要方法如下：顯微注射法是通過(guò)顯微操作儀將外源基因直接注射到受精卵的原核中，該法是產(chǎn)生最早且又最為有效的轉(zhuǎn)基因方法，目前使用非常廣泛。但原核顯微注射法技術(shù)難度比較大，不僅需要昂貴的儀器，而且需要一定的操作技巧。1、原核顯微注射法基因原核注入顯微圖像將外源基因重組到DNA病毒或RNA病毒上，再用重組的DNA病毒或RNA病毒去感染著床前后的胚胎，隨著病毒基因插入到宿主胚胎基因組中，外源基因也自然整合到胚胎基因組中。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎法是近年來(lái)興起的基因轉(zhuǎn)移方法，操作相對(duì)簡(jiǎn)單而且感染后基因的整合效率高。2、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胚胎法利用ES細(xì)胞被注射到宿主囊胚中可參與胚胎發(fā)育形成嵌和體胚胎的特點(diǎn)，首先將外源基因?qū)隕S細(xì)胞，再將ES細(xì)胞注射到宿主囊胚中，參與宿主發(fā)育形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。由于目前ES細(xì)胞的研究只有小鼠比較成功，所以用ES細(xì)胞途徑制作的轉(zhuǎn)基因小鼠比較多，而其它如牛羊等大型動(dòng)物ES細(xì)胞研究尚未成熟，無(wú)法應(yīng)用ES細(xì)胞途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作。3、胚胎干細(xì)胞法將成熟的精子與外源DNA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)之后，使精子有能力攜帶外源基因進(jìn)入卵子，從而使外源基因整合于宿主基因組中。這種方法具有簡(jiǎn)單有效的特點(diǎn)。4、精子載體法基因轉(zhuǎn)移除了上述方法以外，又發(fā)展起來(lái)一些新的方法，如人工酵母染色體(yeastartificialchromosome,YAC)法、電脈沖法等。YAC法是以YAC作為載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，其優(yōu)點(diǎn)是可以用YAC攜帶大片段的基因(30～150萬(wàn)bp)。電脈沖法主要用于魚(yú)類(lèi)轉(zhuǎn)基因研究，因?yàn)橛行~(yú)類(lèi)的卵殼較硬，而且看不清受精卵原核，所以用顯微注射法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因比較困難，而將魚(yú)的受精卵放入外源基因溶液內(nèi)，并施以一定的電脈沖，就可得到一定整合率的轉(zhuǎn)基因魚(yú)。受精卵4-cell囊胚原腸胚轉(zhuǎn)基因動(dòng)物胚胎干細(xì)胞DNA精子DNA顯微注射顯微注射DNA轉(zhuǎn)染、電轉(zhuǎn)移反轉(zhuǎn)錄病毒感染反轉(zhuǎn)錄病毒感染電