丙泊酚對(duì)荷瘤大鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移及MTA1和Wnt1的影響靜脈全麻藥丙泊酚因其起效快、持續(xù)時(shí)間短、蘇醒迅速等優(yōu)點(diǎn),廣泛用于臨床麻醉的誘導(dǎo)、維持以及重癥病人的鎮(zhèn)靜。除了麻醉作用外,研究發(fā)現(xiàn),丙泊酚還具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、止吐等非麻醉作用。近年來(lái),隨著腫瘤發(fā)病率越來(lái)越高,探討麻醉方式和麻醉藥物包括丙泊酚對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響成了熱點(diǎn)。研究表明,丙泊酚可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分化,增強(qiáng)抗腫瘤免疫作用；還可以激活γ-氨基丁酸受體,抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；也可以抑制NF-κB的活性,減少乳腺癌細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力；肺癌細(xì)胞中,丙泊酚同樣可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。由此可見(jiàn),丙泊酚對(duì)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞而言,表現(xiàn)為抑制作用。轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(Metastasis-associatedgene,MTA)家族與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。它包含3個(gè)不同基因(MTA1、MTA2、MTA3)和6個(gè)已知亞型(MTA1、MTAls、MTAl-ZG29p、MTA2、MTA3、MTA3L)。其中,MTA1、MTA2和MTA3均被認(rèn)為是細(xì)胞核小體重塑和組蛋白去乙?；笍?fù)合物的組成部分,它們通過(guò)影響染色質(zhì)的狀態(tài)調(diào)整DNA復(fù)制及調(diào)控組蛋白去乙?；^(guò)程發(fā)揮生物學(xué)功能。MTA1是這個(gè)家族中第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的成員,它位于人類染色體14q32.3,全長(zhǎng)為2.2kb。包含一個(gè)獨(dú)立閱讀開(kāi)放框,起始密碼位于97-99位核苷酸,終止密碼位于2206-2208位核苷酸。MTA1蛋白的羧基末端有2個(gè)SH結(jié)合域,這個(gè)區(qū)域不僅參與信號(hào)傳導(dǎo)通路中蛋白與蛋白之間相互作用的調(diào)控,還構(gòu)成細(xì)胞骨架成分。MTA1蛋白分子中還包含一些蛋白與蛋白、蛋白與DNA相互作用的結(jié)構(gòu)域,如BAH結(jié)構(gòu)域、SANT結(jié)構(gòu)域、GATA鋅指模體等,這些結(jié)構(gòu)可能參與惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。MTA1在乳腺癌、卵巢癌、食管癌、肺癌、胃癌、大腸癌等腫瘤組織均過(guò)度表達(dá),且與腫瘤的分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),MTA1可通過(guò)多種途徑影響腫瘤轉(zhuǎn)移：①M(fèi)TA1通過(guò)影響染色體復(fù)制,調(diào)控組蛋白去乙?；^(guò)程,作用于某些抑癌基因,下調(diào)其轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移；②MTA1可以將缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)募集到組蛋白去乙?；?(HDAC1)上,使其乙酰化,增強(qiáng)HIF-1α的轉(zhuǎn)錄和其蛋白穩(wěn)定性,促進(jìn)血管生成,增加腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能；③MTAl蛋白可使p53基因脫乙?；?抑制p53基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；④MTA1可以顯著改變細(xì)胞角蛋白絲系統(tǒng)的組裝及細(xì)胞骨架蛋白的定位,使細(xì)胞獲得具有侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力的表型；⑤MTA1可作為Wntl轉(zhuǎn)錄和翻譯的重要的上游調(diào)節(jié)因素,抑制Six3表達(dá)導(dǎo)致Wntl去阻遏,促進(jìn)Wntl的轉(zhuǎn)錄和翻譯,啟動(dòng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路。而阻斷或下調(diào)MTA1的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力,MTA1可作為腫瘤治療的一個(gè)靶目標(biāo)。Wnt信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò),至少包括三條信號(hào)通路：①經(jīng)典信號(hào)通路：Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路,主要在細(xì)胞核內(nèi)激活靶基因；②細(xì)胞極性通路：Wnt/PCP通路,主要涉及氨基末端激酶和細(xì)胞骨架重構(gòu)；③Wnt/Ca2+信號(hào)通路,主要調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞粘著性。它們參與細(xì)胞分化、細(xì)胞極性形成、細(xì)胞遷移和增殖等生物學(xué)過(guò)程。而經(jīng)典信號(hào)通路還參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。Wntl是Wnt經(jīng)典信號(hào)通路中的主要成員之一,也是Wnt家族中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)成員。在Wnt信號(hào)通路中：當(dāng)Wntl蛋白信號(hào)存在時(shí),Wntl與靶細(xì)胞上相對(duì)應(yīng)的跨膜受體卷曲蛋白和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP5/6)特異性結(jié)合,激活胞內(nèi)散亂蛋白,抑制胞內(nèi)游離p-連環(huán)蛋白的降解并使其在胞內(nèi)逐漸積聚,進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi),與淋巴細(xì)胞因子／淋巴增強(qiáng)因子等DNA結(jié)合蛋白形成復(fù)合物,激活下游相關(guān)靶基因c-Myc、cyclinD1、Slug等的轉(zhuǎn)錄,抑制E-鈣粘素等的表達(dá),增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。而當(dāng)Wntl蛋白信號(hào)缺失時(shí),p-連環(huán)蛋白與APC和軸蛋白形成復(fù)合物,促使p-連環(huán)蛋白以泛素化方式降解。導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)無(wú)β-連環(huán)蛋白聚集。使得輔阻遏物與淋巴細(xì)胞因／淋巴增強(qiáng)因子等作用,抑制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。在乳腺癌、胃癌、肝癌、大腸癌、前列腺癌等腫瘤組織中,Wntl均過(guò)度表達(dá),且與腫瘤的分期、分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)。因此,Wntl是影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素之一。MTAl可作為Wntl轉(zhuǎn)錄和翻譯的重要的上游調(diào)節(jié)因素,而且MTA1和Wntl與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),阻斷或下調(diào)二者的表達(dá),可以抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。丙泊酚是否通過(guò)降低MTAl和Wntl在腫瘤組織中的表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MADB106腫瘤細(xì)胞大鼠肺轉(zhuǎn)移模型,觀察不同劑量丙泊酚對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移瘤組織MTA1和Wntl表達(dá)的影響。材料和方法1.動(dòng)物準(zhǔn)備與分組40只清潔級(jí)Fischer344雄性大鼠,12-14周齡,體重200-220g,隨機(jī)分為4組：生理鹽水組(S組)、脂肪乳劑組(F組)、丙泊酚30mg/kg組(P30組)和50mg/kg組(P50組),每組10只。實(shí)驗(yàn)前后,大鼠均飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(室溫25-27℃,濕度50%-70%,5只一籠,自由攝取食物和水,早晚8：00做燈光變換,避免強(qiáng)光刺激)。2.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及培養(yǎng)傳代MADB106腫瘤細(xì)胞系,來(lái)源于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,是乳腺癌肺轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞經(jīng)Fischer344大鼠卵化培養(yǎng)的高選擇性細(xì)胞系,經(jīng)靜脈注射后高選擇性的種植在大鼠肺部形成轉(zhuǎn)移瘤。將MADB106中瘤細(xì)胞培養(yǎng)于含有90%RMPI1640培養(yǎng)液,10%胎牛血清和0.1%雙抗的完全培養(yǎng)基中,放置在溫度為37℃,含5%CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于細(xì)胞培養(yǎng)皿中,每2-3天更換一次培養(yǎng)液,并用0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代,傳代比例約為1：2-1：3,一周大概傳代1-2次,控制細(xì)胞傳代次數(shù)在20代以內(nèi)。3.實(shí)驗(yàn)實(shí)施過(guò)程腹腔注射1%戊巴比妥鈉50mg/kg誘導(dǎo),待大鼠達(dá)到預(yù)定麻醉深度(翻正反射和角膜反射消失)后,行股靜脈置管。S組：以5ml/kg的劑量泵入生理鹽水1h；F組：以5ml/kg的劑量泵入脂肪乳劑1h；P30組：以30mg/kg的劑量泵入丙泊酚1h；P50組：以50mg/kg的劑量泵入丙泊酚1h；麻醉過(guò)程中使用加熱毯使實(shí)驗(yàn)大鼠肛溫保持在36-37℃,間斷計(jì)數(shù)呼吸頻率和心率,呼吸頻率保持在約60次/分,心率保持在320-340次/分左右。分別泵入上述藥物30min后,用0.25%胰蛋白酶消化MADB106腫瘤細(xì)胞并在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù),用PBS溶液稀釋到濃度為2×105ml。待各組泵入上述生理鹽水或藥物1h后,每只大鼠均經(jīng)股靜注0.5mlMADB106腫瘤細(xì)胞。拔除股靜脈置管,縫合切口,肌注青霉素2萬(wàn)U/kg。實(shí)驗(yàn)完畢后,將大鼠繼續(xù)在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3周。4.標(biāo)本采集3周后1%戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,頸部正中切開(kāi),行氣管插管并固定。放血處死大鼠后,快速打開(kāi)胸腔分離左右肺。將大鼠置于頭高腳低位,經(jīng)氣管插管緩慢注入4%多聚甲醛固定液,待整個(gè)肺的下3/4完全膨脹后停止注入固定液,取出全肺,用生理鹽水沖洗肺表面,將全肺投入4%多聚甲醛固定液中固定24小時(shí)。5.肺部轉(zhuǎn)移瘤計(jì)數(shù)將固定好的肺組織取出,放在濾紙上吸干表面的固定液后,由兩名未參與實(shí)驗(yàn)人員直接計(jì)數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。6.免疫組化染色標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋,切成4μm薄片,貼于載玻片上,經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水,蒸餾水洗5min；熱修復(fù)抗原后自然冷卻,PBS洗3次,5min／次；在3%H202孵育5-10min消除內(nèi)源性過(guò)氧化酶影響；PBS洗3次,5mmin/次；滴加正常山羊血清封閉液室溫下20-30min,甩去多余液體；滴加一抗4℃過(guò)夜；37℃下復(fù)溫30min;PBS洗3次,5min/次；加生物素化二抗,室溫下30min;PBS洗3次,5min/次；DAB顯色；蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片。7.免疫組化圖片分析在400倍高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野用OlympusDP70CCD采集圖像。采用Image-proplus10.0免疫組化彩色圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析,以圖片中一個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞為基礎(chǔ),測(cè)定、分析整幅圖片的陽(yáng)性細(xì)胞平均光密度(OD)值。8.統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,相關(guān)性分析采用Pearson法,以P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目S組和F組的肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目分別為13.50±2.63個(gè)和12.20±2.15個(gè),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與S組和F組相比,P30組和P50組的肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目分別為7.00±1.05個(gè)和4.20±1.55個(gè),兩組肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。1930組和P50組中肺轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目與丙泊酚劑量負(fù)相關(guān),Pearson相關(guān)系數(shù)為-0.879(P<0.01)。2.轉(zhuǎn)移瘤MTAl和Wntl表達(dá)MTAl主要在轉(zhuǎn)移瘤的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。S組和F組的OD值分別為1.33±0.14和1.27±0.83,表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)。P30組和P50組的OD值分別為0.93±0.91和0.53±0.13,兩組差異顯著(P<0.01),且均明顯低于S組和F組(P<0.01)。MTA1的表達(dá)與丙泊酚劑量負(fù)相關(guān),Pearson系數(shù)為-0.980(P<0.01)。Wntl主要在轉(zhuǎn)移瘤的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá),S組和F組的OD值分別為0.67±0.90和0.63±0.73,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；P30