1斑馬魚(yú)飼育技術(shù)條件本文件規(guī)定了《斑馬魚(yú)飼育技術(shù)條件》的飼育魚(yú)房工藝布局、飼育設(shè)施、飼育環(huán)境條件、飼育密度與餌料及飼喂、繁育和遺傳資源保存、倫理維護(hù)以及質(zhì)量規(guī)范。本文件適用于斑馬魚(yú)的飼育。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB/T18883室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB/T31962污水排入城鎮(zhèn)下水道水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1斑馬魚(yú)胚胎zebrafishembryo未出殼膜的斑馬魚(yú)胚胎，一般指0dpf~3dpf（dayspostfertilization；受精后天數(shù)）的斑馬魚(yú)胚胎。3.2斑馬魚(yú)仔魚(yú)zebrafishlarva出殼膜后至發(fā)育到未成為幼魚(yú)之前的斑馬魚(yú)，一般指4dpf~28dpf的斑馬魚(yú)。3.3斑馬魚(yú)幼魚(yú)juvenilezebrafish外部形態(tài)與成魚(yú)相似但未性成熟的斑馬魚(yú)，一般指29dpf~84dpf的斑馬魚(yú)。3.4成年斑馬魚(yú)adultzebrafish性成熟、具備繁殖能力的斑馬魚(yú)。一般指年齡大于84dpf的斑馬魚(yú)。4飼育魚(yú)房工藝布局4.1飼育魚(yú)房總體要求獨(dú)立空間，凈高度不宜低于250cm；地面防潮、防水、防滑、耐沖擊、平整；墻壁光滑、耐潮、不吸水、抗擊碰性損壞、無(wú)縫隙。24.2飼育魚(yú)房功能分區(qū)包括去離子水制備區(qū)、循環(huán)系統(tǒng)流水處理區(qū)、飼育區(qū)、餌料生產(chǎn)區(qū)、儲(chǔ)存區(qū)、清潔區(qū)、隔離區(qū)和實(shí)驗(yàn)區(qū)。4.2.1去離子水制備區(qū)將符合GB5749《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》要求的水進(jìn)行反滲處理制備成去離子水的區(qū)域，可位于飼育魚(yú)房外獨(dú)立空間。4.2.2循環(huán)系統(tǒng)流水處理區(qū)對(duì)飼育用水進(jìn)行過(guò)濾、紫外消毒、充氣、pH調(diào)節(jié)和電導(dǎo)率調(diào)節(jié)等集中區(qū)，可獨(dú)立于飼育魚(yú)房外。4.2.3飼育區(qū)日常繁育斑馬魚(yú)的飼育區(qū)應(yīng)配備流水飼育設(shè)施飼育仔魚(yú)、幼魚(yú)與成年魚(yú)；配備靜水飼育設(shè)施飼育胚胎、仔魚(yú)以及用于親魚(yú)繁育。4.2.4餌料生產(chǎn)區(qū)包括培育開(kāi)口餌料草履蟲(chóng)的草履蟲(chóng)生產(chǎn)區(qū)和孵化豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)的豐年蟲(chóng)卵孵化區(qū)。分別配置供培育草履蟲(chóng)的容器和供孵化豐年蟲(chóng)卵的專(zhuān)用孵化設(shè)備。4.2.5儲(chǔ)存區(qū)配備冰箱存放斑馬魚(yú)餌料。4.2.6清潔區(qū)設(shè)有清潔用水池以及魚(yú)撈等漁具存放區(qū)。4.2.7隔離區(qū)外來(lái)的斑馬魚(yú)應(yīng)飼養(yǎng)在獨(dú)立于日常繁育飼育區(qū)之外的隔離區(qū)，胚胎經(jīng)消毒處理后方可進(jìn)入日常繁育飼育區(qū)。4.2.8實(shí)驗(yàn)區(qū)4.2.8.1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理的斑馬魚(yú)應(yīng)飼育在獨(dú)立于斑馬魚(yú)日常繁育飼育區(qū)外的實(shí)驗(yàn)區(qū)，可位于飼育魚(yú)房外的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。4.2.8.2僅為完成遺傳改造而實(shí)施過(guò)顯微注射的斑馬魚(yú)胚胎或僅用于簡(jiǎn)單顯微形態(tài)學(xué)觀測(cè)以評(píng)估質(zhì)量的斑馬魚(yú)可回到日常繁育飼育區(qū)。4.2.8.3所有經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理的斑馬魚(yú)（包括胚胎、仔魚(yú)、幼魚(yú)和成魚(yú)）不應(yīng)回到日常繁育飼育區(qū)。完成實(shí)驗(yàn)后通常需要進(jìn)行安樂(lè)死。5飼育設(shè)施5.1流水飼育系統(tǒng)5.1.1飼育架3應(yīng)由不銹鋼或其它防水防銹等無(wú)毒材料制成，層距不低于35cm。5.1.2飼育缸5.1.2.1材質(zhì)要求無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)放射性、耐腐蝕、耐高溫、耐高壓、耐沖擊、易清洗、易消毒滅5.1.2.2飼育缸由飼育蓋板、飼育缸體以及飼育后插板組成。5.1.2.3飼育蓋板設(shè)餌料投喂孔、流水單管孔和備用孔。5.1.2.4飼育缸體配有雙卡槽，可同時(shí)插入防仔魚(yú)和幼魚(yú)逃逸后插板以及導(dǎo)污后插板。5.1.3循環(huán)凈化設(shè)備包括過(guò)濾處理單元、水體循環(huán)設(shè)備、消毒單元、充氣補(bǔ)氧單元、PLC自動(dòng)化控制集成單元、給排水分配單元、生物凈化水槽、系統(tǒng)流量監(jiān)控單元、pH控制單元和電導(dǎo)率控制單元。5.2靜水飼育系統(tǒng)5.2.1飼育架同5.1.1。5.2.2交配缸內(nèi)外膽結(jié)構(gòu)，材料要求與飼育缸（5.1.2）一致；內(nèi)膽底部高于外盒底部2cm，并配有分離隔板和蓋板。5.2.3飼育缸同5.2.2，但無(wú)內(nèi)膽和分離隔板。6飼育環(huán)境條件6.1溫度室溫23℃~30℃,24h內(nèi)變動(dòng)不超過(guò)2.5℃。水溫25℃~29℃,24h內(nèi)變動(dòng)不超過(guò)1.0℃。6.2濕度相對(duì)濕度為45%~70%。6.3空氣空氣質(zhì)量符合GB/T18883《室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。另需有新風(fēng)輸入，至少每4h~5h輸入1次，每次空氣交換量是整體空間的2倍體積。6.4環(huán)境噪音低于70dB。6.5光照4采用14h光照10h黑暗的方式飼養(yǎng)。光照時(shí)間內(nèi)，飼育魚(yú)房?jī)?nèi)和魚(yú)缸水面光照強(qiáng)度均為54lx~6.6飼育用水6.6.1電導(dǎo)率450μS/cm~550μS/cm。6.6.2pHpH6.5~pH8.0。6.6.3氨氮含量＜0.02mg/l。6.6.4鹽度含量為0.3‰~0.5‰。6.6.5亞硝酸鹽含量＜0.2mg/l。6.6.6硝酸鹽含量＜5mg/l。6.6.7溶解氧含量為5mg/l~8mg/l。6.6.8二氧化碳含量為＜5mg/l。6.6.9硬度50mg/l~100mg/l。6.7流水循環(huán)速度小于10dpf的仔魚(yú)所在魚(yú)缸的水流速度應(yīng)小于10ml/min，10dpf至28dpf仔魚(yú)所在魚(yú)缸的水流速度為50ml/min~80ml/min，幼魚(yú)和成魚(yú)魚(yú)缸水流速度100ml/min~150ml/min。6.8日換水量6.8.1日排水量為系統(tǒng)總水量的2%~10%，根據(jù)系統(tǒng)中所負(fù)荷魚(yú)量適當(dāng)增加。6.8.2日常繁育斑馬魚(yú)的飼育用水符合GB/T31962《污水排入城鎮(zhèn)下水道水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，可直接排入城鎮(zhèn)下水道。6.8.3實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)用于斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)處理的飼育用水應(yīng)按照生物類(lèi)實(shí)驗(yàn)室的要求處理，不應(yīng)直接排入城鎮(zhèn)下水道。7飼育密度與餌料及飼喂57.1飼育密度7.1.1胚胎飼育密度10ml飼育用水飼育的胚胎數(shù)不超過(guò)50枚。7.1.2仔魚(yú)飼育密度4dpf~17dpf仔魚(yú)的飼育密度不超過(guò)40尾/l、大于18dpf的仔魚(yú)飼育密度不超過(guò)20尾/l。7.1.3幼魚(yú)飼育密度不超過(guò)6尾/l。7.1.4成魚(yú)飼育密度5尾/l。7.2飼育餌料7.2.1斑馬魚(yú)餌料包括草履蟲(chóng)活體和豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)活體，可自行培育或購(gòu)買(mǎi)。7.2.2草履蟲(chóng)培育方法見(jiàn)附錄A。培育出的草履蟲(chóng)活體直接用于斑馬魚(yú)仔魚(yú)的飼喂。7.2.3豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)孵化方法見(jiàn)附錄B。孵化出的幼蟲(chóng)經(jīng)脫鹽處理后用于斑馬魚(yú)的飼喂。7.3飼喂7.3.1飼喂總則斑馬魚(yú)的每日飼喂次數(shù)為2次~4次。7.3.2飼喂量7.3.2.1發(fā)育時(shí)期為4dpf~6dpf仔魚(yú)，每次按草履蟲(chóng)1×105個(gè)/l~3×105個(gè)/l投喂。發(fā)育時(shí)期為7dpf~10dpf仔魚(yú)，以草履蟲(chóng)和豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)混合喂飼，草履蟲(chóng)每次投喂密度為3×105個(gè)/l~5×105個(gè)/l，豐年蟲(chóng)為1×104個(gè)/l~4×104個(gè)/l，依發(fā)育時(shí)間逐步提高豐年蟲(chóng)比例。發(fā)魚(yú)時(shí)期為11dpf~28dpf仔魚(yú)，以豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)飼喂，飼喂量為約3×104個(gè)/l~4×104個(gè)/l。7.3.2.2幼魚(yú)每次投喂豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)5×104個(gè)/l~9×104個(gè)/l。7.3.2.3成魚(yú)每次投喂豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)1×105個(gè)/l~3×105個(gè)/l。8繁育和遺傳資源保存8.1繁育安排使用交配缸進(jìn)行斑馬魚(yú)交配繁育。親本的雌雄比例為雌2尾雄1尾~2尾，一個(gè)交配缸內(nèi)最多不超過(guò)7尾魚(yú)。8.2新創(chuàng)制遺傳資源保存根據(jù)國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心的要求填寫(xiě)相關(guān)表格，向國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心遞交新創(chuàng)制的基因組改造的詳細(xì)遺傳信息；同時(shí)遞交新創(chuàng)制的基因型和遺傳背景明確的斑馬魚(yú)成魚(yú)，用于國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心保存。69倫理維護(hù)9.1福利保障應(yīng)制定斑馬魚(yú)使用與管理的具體規(guī)章制度；不應(yīng)執(zhí)行任何不符合動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范的斑馬魚(yú)使用與管理方案。9.2飼育人員技能斑馬魚(yú)生產(chǎn)與使用人員應(yīng)在上崗前接受專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，了解斑馬魚(yú)繁殖生物學(xué)的基本知識(shí)、飼育規(guī)范以及使用與管理規(guī)范等。9.3生長(zhǎng)記錄記錄每日的水溫、室溫、濕度、飼喂、清潔、整理、魚(yú)缸清洗、受精卵收集、草履蟲(chóng)飼育和豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)孵化情況等。9.4標(biāo)識(shí)黏貼在飼育缸或交配缸外的斑馬魚(yú)標(biāo)簽的信息應(yīng)包括：動(dòng)物的受精日期、基因型和傳代代數(shù)等內(nèi)容。9.5安樂(lè)死將斑馬魚(yú)置于冰水混合物中快速預(yù)冷2min后，放入-20℃冰箱凍存。斑馬魚(yú)安樂(lè)死后應(yīng)及時(shí)轉(zhuǎn)移至飼育魚(yú)房外的專(zhuān)用斑馬魚(yú)尸體存放冰箱的冷凍室中凍存，集中進(jìn)行無(wú)害化處理。10質(zhì)量規(guī)范10.1斑馬魚(yú)來(lái)源斑馬魚(yú)的遺傳背景應(yīng)該明確。不應(yīng)飼育遺傳背景不明的斑馬魚(yú)；不應(yīng)使用來(lái)源于寵物市場(chǎng)的斑馬魚(yú)。10.2胚胎的質(zhì)量應(yīng)具備與發(fā)育時(shí)期一致的正常的顯微形態(tài)學(xué)特征。10.3仔魚(yú)的質(zhì)量10.3.1應(yīng)從殼膜中孵出，具正常的顯微形態(tài)學(xué)特征，可在水中自由游泳。10.3.24dpf仔魚(yú)魚(yú)鰾的后部腔室開(kāi)始充氣。約20dpf，仔魚(yú)魚(yú)鰾的前部腔室開(kāi)始充氣。約21dpf時(shí)，魚(yú)鰾前后兩個(gè)腔室的充氣完成。10.4幼魚(yú)與成魚(yú)的質(zhì)量10.4.1健康的斑馬魚(yú)應(yīng)保持充分放松的姿態(tài)以與水面平行的方式在水中游泳。10.4.2斑馬魚(yú)的正常行為包括均勻的呼吸（通過(guò)活動(dòng)鰓蓋）、以及保持對(duì)游泳和捕食運(yùn)動(dòng)的興趣。10.4.3斑馬魚(yú)生病的特征包括體重與體長(zhǎng)的比例下降、急促的呼吸、明顯的身體組織的損傷（潰瘍、外傷）、以及體色、體型和運(yùn)動(dòng)方式等的改變。當(dāng)斑馬魚(yú)急速翻身、向一側(cè)傾斜、或者與水面垂直也可以作為生病的特征。10.4.4表現(xiàn)出異于正常斑馬魚(yú)行為的基因組改造斑馬魚(yú)突變體，不應(yīng)視作病魚(yú)。10.4.5生病的斑馬魚(yú)通常要進(jìn)行及時(shí)的安樂(lè)死。10.4.6如果病魚(yú)十分珍貴，可將病魚(yú)轉(zhuǎn)移至隔離區(qū)隔離治療。8（資料性）草履蟲(chóng)培育在3l缸中加入0.1g氯化鈉（分析純）和約5粒大麥粒，倒入1.5l~2l煮沸去離子水后混勻，放置室溫待用，待溶液降至室溫后加入0.1g酵母粉搖勻備用，吸取母液10%作為種子液，加入混合好的新鮮培養(yǎng)液中，室溫下培養(yǎng)1周，于體視顯微鏡下檢測(cè)培養(yǎng)效果，一般可達(dá)到2,000個(gè)/ml的草履蟲(chóng)，此時(shí)可直接使用。3周~4周后需利用種子液，再行培養(yǎng)新鮮草履蟲(chóng)。9（資料性）豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)孵化及脫鹽處理豐年蟲(chóng)幼蟲(chóng)是通過(guò)購(gòu)買(mǎi)市售的豐年蟲(chóng)休眠卵孵化而來(lái)。孵化使用符合GB5749《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》要求的市政自來(lái)水配制的溶液完成。孵化溶液含鹽量（使用50目以下的細(xì)海鹽或孵化專(zhuān)用海鹽）為1.5%~2.5%；pH8.0~p