§2

BiosynthesisofRNATranscriptionReplicationreversetranscript一、轉(zhuǎn)錄（Transcription）概念：DNA的遺傳信息轉(zhuǎn)移到RNA分子中的過程，即通過酶促合成與基因編碼鏈堿基序列相同的RNA鏈，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有3種RNA：mRNA,rRNA,tRNA。DNA-DependentSynthesisofRNA不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄

在生物體內(nèi)，DNA的兩條鏈中只有一條用于轉(zhuǎn)錄，另一條鏈可能對(duì)轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用。用于轉(zhuǎn)錄的鏈為模板鏈（templatestrand）/負(fù)鏈/反義鏈/非編碼鏈；另一條鏈稱為非模板鏈/正鏈/有義鏈/編碼鏈。

由于轉(zhuǎn)錄只在DNA的一條鏈進(jìn)行，所以稱為不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。基因的有義鏈并不總是在染色體DNA的同一條鏈上?；虻霓D(zhuǎn)錄是有選擇的：時(shí)間（不同的發(fā)育時(shí)期）、空間（不同的器官組織/細(xì)胞）。 區(qū)別于復(fù)制！

轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)是指mRNA開始轉(zhuǎn)錄的第一個(gè)堿基，此點(diǎn)常用+1表示。啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合和開始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。在RNA轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的上游，約100~200bp。注意原核啟動(dòng)子在-35和-10區(qū)域的保守序列-35序列提供了RNA聚合酶識(shí)別信號(hào)，-10序列有助于DNA局部雙鏈解開。轉(zhuǎn)錄單位

(transcript)：被轉(zhuǎn)錄成單個(gè)RNA分子的一段DNA

|||

||5'終止序列promoter起始位點(diǎn)調(diào)節(jié)區(qū)轉(zhuǎn)錄因子：參與RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活動(dòng)的輔助因子，為蛋白質(zhì)。終止子：提供轉(zhuǎn)錄停止信號(hào)的DNA序列（核苷酸片段）。upstream-112downstream(一)RNA合成的酶促反應(yīng)n1ATPn2GTPn3CTPn4UTP+DNAtemplate

AMPn1GMPn2CMPn3UMPn4RNARNApolymeraseMg2+,Zn2++(n1+n2+n3+n4)PPiRNAIsSynthesizedbyRNAPolymeraseσ因子轉(zhuǎn)錄開始時(shí)識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，使全酶結(jié)合在起始位點(diǎn)上，形成全酶-DNA復(fù)合物,而在轉(zhuǎn)錄合成開始后被釋放，由核心酶催化RNA的合成。結(jié)合調(diào)控序列催化磷酸二酯鍵形成與模板DNA結(jié)合識(shí)別啟動(dòng)子,起動(dòng)合成σ因子先識(shí)別-35區(qū)保守序列，并與之結(jié)合，該區(qū)是聚合酶的初始識(shí)別位點(diǎn)。原核中，-35與-10區(qū)之間的距離（16~19bp）對(duì)于轉(zhuǎn)錄很重要，而之間的堿基序列對(duì)轉(zhuǎn)錄并不重要。轉(zhuǎn)錄過程起始延長(zhǎng)終止轉(zhuǎn)錄起始σ因子識(shí)別DNA上的起始位點(diǎn)形成全酶-DNA二元復(fù)合物DNA解鏈，形成轉(zhuǎn)錄泡（transcriptionbubble）β亞基催化形成RNA的第一個(gè)核苷三磷酸（GTP或ATP），形成啟動(dòng)子、全酶和核苷三磷酸組成的三元起始復(fù)合物合成8-9ntRNA后，σ亞基被釋放脫離核心酶

終止轉(zhuǎn)錄終止需要終止信號(hào)，即轉(zhuǎn)錄終止子（terminators）的DNA序列。兩類終止子：

ρ-非依賴性終止子ρ-依賴性終止子

轉(zhuǎn)錄終止需要終止因子NusA：在RNA合成的延伸和終止時(shí)NusA可代替σ因子，和σ因子一樣，NusA與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，但不那么牢固。延長(zhǎng)

以NTP為原料和能量，DNA模板鏈為模板，靠核心酶的催化，核苷酸間通過3′,5′-磷酸二酯鍵成核糖核酸鏈(RNA)ρ-非依賴性終止子：在終止點(diǎn)之前具有一段富含G-C的回文序列；富含G-C的區(qū)域之后是一連串的dA堿基序列，它們轉(zhuǎn)錄的RNA鏈的末端為一連串U（連續(xù)6個(gè)）。轉(zhuǎn)錄出的RNA形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)中斷了DNA-RNA雜合體的形成ρ-依賴性終止子

有的終止子要因子的幫助才能終止轉(zhuǎn)錄。其回文結(jié)構(gòu)不富含G-C區(qū)，其后無寡聚U。細(xì)菌中少見，噬菌體中廣泛存在。

（三）真核生物轉(zhuǎn)錄作用真核生物有三種RNA聚合酶：RNA聚合酶I、II、IIIP562~565真核生物的啟動(dòng)子由轉(zhuǎn)錄因子而不是RNA聚合酶所識(shí)別對(duì)α-鵝膏蕈堿的敏感性不敏感敏感中等敏感（四）轉(zhuǎn)錄過程的選擇性抑制劑按照作用的對(duì)象、性質(zhì)不同，分為2種：一、模板功能的抑制劑嵌合劑：如放線菌素D(p266)嵌入dG-dC之間溴乙錠EB為高靈敏度熒光試劑

吖啶二、RNA聚合酶的抑制劑原核生物：利福霉素（衍生物：利福平）真核生物：-鵝膏蕈堿（五）轉(zhuǎn)錄后加工

(post-transcriptionalprocessing)

定義：各種RNA合成時(shí)，先以DNA為模板生成分子量較大的RNA前體（primarytranscript），然后在專一酶的作用下切除多余的部分，或進(jìn)行修飾，最后才生成有活性的“成熟”RNA。原核生物：mRNA不需加工，轉(zhuǎn)錄的同時(shí)即進(jìn)行翻譯。但rRNA、tRNA前體需要加工。真核生物：三種RNA前體均需轉(zhuǎn)錄后加工rRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA前體的加工真核mRNA前體的加工

1.rRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工（1）

原核生物rRNA前體的加工30S→16S、23S、5S、tRNA（2）真核生物rRNA前體的加工45S→5.8S、18S、28S（5SrRNA由其它途徑產(chǎn)生）甲基化修飾：修飾在堿基(原)、核糖(真)上

剪切作用：需專一核酸酶參與

自我剪接：一種核酶的作用（真）加工過程2.tRNA前體的加工

細(xì)胞內(nèi)tRNA種類多，各種tRNA加工方式不同，但主要方式有以下幾種：除去前體5’和3’端多余的核苷酸（有時(shí)tRNA分子酶解產(chǎn)生2個(gè)或更多的tRNA）3’末端加上CCA堿基的修飾：甲基化、脫氨和還原作用堿基甲基化修飾：甲基供體是SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。ProcessingoftRNAsinbacteriaandeukaryotesRNaseP(5’成熟酶）、RNaseD（3’成熟酶）均識(shí)別tRNA空間結(jié)構(gòu)；堿基甲基化修飾：甲基供體是SAM（S-腺苷甲硫氨酸）。3.真核mRNA前體的加工

CP：hnRNAandmaturemRNA？1）5’端加帽2）3’端加多聚A（polyA）3）剪接（Splicing）：去除內(nèi)含子，連接外顯子加工在細(xì)胞核中進(jìn)行m7Gppp5’端加帽子結(jié)構(gòu)5′,5′–三磷酸橋5’端加帽反應(yīng)在RNA合成了30核苷酸后就開始進(jìn)行。甲基化反應(yīng)由SAM（S-腺苷甲硫氨酸）提供甲基。5‘端為三磷酸嘌呤核苷3’端加polyAa.thecleavagesignalsequencesisboundbyanenzymecomplex.b.TheRNAiscleavedbytheendonucleaseatapoint10to30nucleotides3‘to(downstreamof)thesequenceAAUAAA.c.Thepolyadenylatepolymerase(多聚腺苷酸聚合酶)synthesizesapoly(A)tail80to250nucleotideslong,beginningatthecleavagesite.RNASplicing：在基因轉(zhuǎn)錄過程中，內(nèi)含子與外顯子同時(shí)被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物為RNA前體，切除前體中的內(nèi)含子，將外顯子連接形成成熟RNA的過程。*RNA剪接與RNA修飾無關(guān)，對(duì)不存在Cap、polyA的mRNA序列同樣可以剪接。*真核生物細(xì)胞核mRNA前體的剪接是在形成剪接體（spliceosome）后才能進(jìn)行。剪接體是包括mRNA前體在內(nèi)的多組分復(fù)合物。*內(nèi)含子一般以GU開始到AG結(jié)束。RNA剪接4種類型類型Ⅰ自我剪接（groupⅠself-splicing）類型Ⅱ自我剪接（groupⅡself-splicing）核mRNA剪接體的剪接（nuclearmRNAsplicesomalsplicing）核tRNA的酶促剪接（nucleartRNAenzymaticsplicing）RNASplicing：在基因轉(zhuǎn)錄過程中，內(nèi)含子與外顯子同時(shí)被轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物為RNA前體，切除前體中的內(nèi)含子，將外顯子連接形成成熟RNA的過程。類型Ⅰ自我剪接兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)親核試劑來自鳥苷酸真核生物細(xì)胞器基因，低等真核生物核rRNA基因，細(xì)菌和噬菌體個(gè)別基因。例：四膜蟲6400nt

pre-rRNA的加工類型Ⅱ自我剪接兩次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)親核試劑來自內(nèi)含子真菌線粒體，植物葉綠體基因RNAediting：RNA編碼序列的改變。RNArecoding：RNA讀碼和編碼方式的改變。☆原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄與復(fù)制比較：合成方向均為5

3

比較

轉(zhuǎn)錄

復(fù)制 底物 NTP(A、G、C、U) dNTP(A、G、C、T) 酶 RNA聚合酶DNA聚合酶 （無核酸外切酶活性） 模板 模板DNA的1條鏈 模板DNA的2條鏈 引物 不需要 需要 核對(duì)作用 無（堿基錯(cuò)配率較高） 有 第1個(gè)產(chǎn)物ATP或GTP RNA引物，NTP 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需加工產(chǎn)物無需加工忠實(shí)性相對(duì)弱高保真起始？延伸？終止？此RNA聚合酶特點(diǎn):模板特異性很高，它只識(shí)別病毒自身的RNA。底物為四種NTP，不需要引物，需Mg2+。催化RNA復(fù)制的RNA聚合酶，以RNA為模板，故該酶又叫RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶（RNA-dependentRNA

Polymerase，RDRP

；RNAreplicase）。5

RNA-5

3

3

RNA+釋放釋放3

5

3

3

5

5

RNA+RNA+RNA-RNA-及

RNA+的合成方向均為5‘3’例:噬菌體Qβ二、RNA的復(fù)制以RNA攜帶遺傳信息，并能通過RNA復(fù)制與自身相同RNA分子的生物，如（+）RNA和（-）RNA：通常將具有mRNA功能的鏈稱為（+）RNA，而它的互補(bǔ)鏈為（-）RNA。帶（+）RNA的病毒可直接進(jìn)行與病毒繁殖有關(guān)的蛋白質(zhì)合成。1.（+）RNA病毒：不含復(fù)制酶，如灰質(zhì)炎病毒和噬菌體Qβ。2.（-）RNA病毒：含有復(fù)制酶，如狂犬病病毒，H1N1流感病毒。3.（±）RNA病毒：含雙鏈RNA和復(fù)制酶，如呼腸孤病毒。4.逆轉(zhuǎn)錄病毒：致癌RNA病毒，如白血病病毒，AIDS病毒。RNA復(fù)制類型以病毒RNA直接作為復(fù)制的模板；以病毒RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，然后再?gòu)腄NA轉(zhuǎn)錄出病毒RNA。特殊的復(fù)制方式三、逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）

——RNA指導(dǎo)的DNA合成

1970年，Temin、Mizufani、Baltimore同時(shí)分別從致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶——逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)，有利地證明了Temin于1964年提出的前病毒學(xué)說(previrustheory)。

（1975年獲NobelPrize）

前病毒學(xué)說：致癌RNA病毒的復(fù)制需經(jīng)過一個(gè)DNA中間體即前病毒，此中間體可部分或全部整合到細(xì)胞DNA中，并隨細(xì)胞增殖而傳遞至子代細(xì)胞，細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化就是由前病毒引起的。所有已知的致癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶，因此被稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus），基因組均由兩條相同的（+）RNA鏈所組成。逆轉(zhuǎn)錄酶是一種多功能酶，兼有3種酶活：RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H活性n1dATPn2dGTPn3dCTPn4dTTP+RNAtemplate

dAMPn1dGMPn2dCMPn3dTMPn4DNADNApolymerasePrimer,Zn

2++(n1+n2+n3+n4)PPi逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下合成與其堿基互補(bǔ)的DNA的過程。合成的DNA稱cDNA(complementaryDNA)。逆轉(zhuǎn)錄過程需要引物

(tRNA)兩次轉(zhuǎn)換模板Primerbindingsite,PBSPolypurinetract,PPT1234/5RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H活性No3

-5

proofreading1errorper20,000fasterrateofviralevolution6789/10Longterminalrepeat,LTRDNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象并不僅限于病毒。如后來發(fā)現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)座子，表明逆轉(zhuǎn)錄過程在細(xì)胞中頻繁發(fā)生。但在一般的細(xì)胞中并無可覺察的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。其實(shí)端粒酶就是一種逆轉(zhuǎn)錄酶，其活性只存在于胚胎和腫瘤細(xì)胞中，可能細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄酶只在一定條件下才能表達(dá)，這也是細(xì)胞染色體遺傳信息得以保持相對(duì)穩(wěn)定的一個(gè)原因。OVER基因重組與DNA“克隆”geneticrecombination

and

DNAclone基因重組(geneticrecombination)：染色體DNA分子內(nèi)或分子間發(fā)生交換。自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組是無目的基因工程有目的1865年G.J.Mendel的豌豆雜交試驗(yàn)1944年O.T.Avery的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)基因工程大事記1973Cohen第一例成功的克隆實(shí)驗(yàn)（美斯坦福大學(xué)）1978Genentech公司人胰島素世界上第一種基因工程蛋白藥物（美）

1982第一個(gè)基因工程藥物--重組人胰島素在英、美獲準(zhǔn)使用

1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國(guó)水生所不育轉(zhuǎn)基因魚1993保鮮延熟型西紅柿在美國(guó)上市1999.9中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃，負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的1%2000.6.26科學(xué)家公布人類基因組工作草圖2001.2.11公布人類基因組基本信息克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。DNA克隆DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各