從RNA提取到熒光定量PCR解決方案從RNA提取到熒光定量PCR解決方案從RNA提取到熒光定量PCR解決方案一、提取及反轉(zhuǎn)錄樣品收集提取的樣品要保證“新鮮”（屠宰后，立即放入液氮，過夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱）提取防止酶的污染：處理150-180℃烘烤3-4h從RNA提取到熒光定量PCR解決方案從RNA提取到熒光定量P1一、提取及反轉(zhuǎn)錄樣品收集提取的樣品要保證“新鮮”（屠宰后，立即放入液氮，過夜后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱）提取防止酶的污染：處理150-180℃烘烤3-4h一、提取及反轉(zhuǎn)錄樣品收集2氯仿（氯仿-異戊醇49:1）-異丙醇-75%乙醇試劑盒（離心柱濾膜吸附法）提取方法：氯仿（氯仿-異戊醇49:1）-異丙醇-75%乙醇提取方法：3檢測甲醛變性電泳:三條帶（28、18、5.8/5S）紫外吸光值檢測：260/280(1.8-2.0)（＜1.7蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.1異硫氰酸殘存或降解）260讀數(shù)（0.1-0.5）(線性關(guān)系好)得率260*稀釋倍數(shù)*40μl檢測4反轉(zhuǎn)錄模版：總、、體外轉(zhuǎn)錄的引物:（）、隨機引物、基因特異引物()反轉(zhuǎn)錄5反轉(zhuǎn)錄酶：

防止二級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致的反轉(zhuǎn)錄失?。?5℃5，冰上3-5，立即42℃反轉(zhuǎn)錄加入氫氧化甲基汞（3）或解鏈蛋白使用耐受高溫（55-65℃）的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄檢測利用內(nèi)參基因檢測反轉(zhuǎn)錄效果，如,β等。反轉(zhuǎn)錄酶：反轉(zhuǎn)錄檢測6利用普通初篩定量引物特異性、避免產(chǎn)生引物二聚體產(chǎn)物長度90-300之間退火溫度：60℃左右（內(nèi)參和目的基因一致）考慮目標(biāo)剪接體（若基因存在可變剪切）盡量跨內(nèi)含子設(shè)計引物利用普通初篩定量引物7檢測確定引物的有效性（擴增曲線、熔解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線）檢測8從RNA提取到熒光定量PCR解決方案9二、二、10從RNA提取到熒光定量PCR解決方案11熒光定量原理－－常用名詞概念擴增曲線熒光閾值值熒光定量原理－－常用名詞概念12從RNA提取到熒光定量PCR解決方案13從RNA提取到熒光定量PCR解決方案14熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為值（）。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光15從RNA提取到熒光定量PCR解決方案16從RNA提取到熒光定量PCR解決方案17從RNA提取到熒光定量PCR解決方案18從RNA提取到熒光定量PCR解決方案19從RNA提取到熒光定量PCR解決方案20:采用72℃延伸時采集熒光!95℃60℃左右:采用72℃延伸時采集熒光!95℃60℃左右21從RNA提取到熒光定量PCR解決方案22從RNA提取到熒光定量PCR解決方案23從RNA提取到熒光定量PCR解決方案24從RNA提取到熒光定量PCR解決方案25從RNA提取到熒光定量PCR解決方案26從RNA提取到熒光定量PCR解決方案27從RNA提取到熒光定量PCR解決方案28從RNA提取到熒光定量PCR解決方案29從RNA提取到熒光定量PCR解決方案30從RNA提取到熒光定量PCR解決方案31從RNA提取到熒光定量PCR解決方案32從RNA提取到熒光定量PCR解決方案33:質(zhì)粒獲得后，用限制性內(nèi)切酶單酶切，使其線性化！或者使用純化的產(chǎn)物。:質(zhì)粒獲得后，用限制性內(nèi)切酶單酶切，使其線性化！34:稀釋液可采用專用的定量稀釋液，如

:稀釋液可采用專用的定量稀釋液，如35從RNA提取到熒光定量PCR解決方案36標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳可能的原因：

1.加樣存在誤差，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不呈梯度；2.標(biāo)準(zhǔn)品降解：標(biāo)準(zhǔn)品盡量避免反復(fù)凍融；3.引物或探針不佳：重新設(shè)計；4.模板中存在抑制物，或模板濃度過高。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳可能的原因：37從RNA提取到熒光定量PCR解決方案38從RNA提取到熒光定量PCR解決方案39從RNA提取到熒光定量PCR解決方案40從RNA提取到熒光定量PCR解決方案41從RNA提取到熒光定量PCR解決方案42從RNA提取到熒光定量PCR解決方案43從RNA提取到熒光定量PCR解決方案44從RNA提取到熒光定量PCR解決方案45從RNA提取到熒光定量PCR解決方案46從RNA提取到熒光定量PCR解決方案47過程中經(jīng)常出現(xiàn)的幾個問題分析過程中經(jīng)常出現(xiàn)的幾個問題分析48值出現(xiàn)過晚（>30）：閾值設(shè)計過高；反應(yīng)條件不佳：未最佳反應(yīng)條件，可重新設(shè)計引物或探針，適當(dāng)降低退火溫度，增加鎂離子濃度等；各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不夠；擴增產(chǎn)物片段過長：一般采用100－200的擴增長度。值出現(xiàn)過晚（>30）：49陰性對照出現(xiàn)明顯的擴增：熒光或水被污染；氣溶膠的干擾；引物二聚體的出現(xiàn)：在35循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴增屬正常情況，可配合溶解曲線進行分析。陰性對照出現(xiàn)明顯的擴增：50結(jié)果的重復(fù)性不好：加樣不準(zhǔn)確；儀器在樣品上溫度條件有差異，溫度均一性不好；模板濃度低：樣品初始濃度越低，重復(fù)性越差，應(yīng)減少樣品的稀釋倍數(shù)。結(jié)果的重復(fù)性不好：51擴增效率低：反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解；反應(yīng)條件不佳：適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴增法；反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入，應(yīng)先把模板適當(dāng)稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。擴增效率低：52熒光定量值一般在多少后認(rèn)為模板沒擴增：當(dāng)進入對數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35時，檢測無效，基因沒有表達；