第三節(jié)發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌1發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第1頁(yè)發(fā)酵普通流程種子擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基配制空氣除菌培養(yǎng)基滅菌發(fā)酵生產(chǎn)下游處理發(fā)酵設(shè)備2發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第2頁(yè)發(fā)酵設(shè)備——發(fā)酵罐發(fā)酵罐特點(diǎn)軸封嚴(yán)密，泄漏少能承受一定壓力、溫度攪拌通風(fēng)裝置確保氣液充分混合含有足夠冷卻面積死角少，滅菌徹底適宜徑高比（高與直徑比值為2.5—4）3發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第3頁(yè)發(fā)酵罐類(lèi)型攪拌釜反應(yīng)器鼓泡式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器4發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第4頁(yè)5發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第5頁(yè)發(fā)酵輔助設(shè)備無(wú)菌空氣系統(tǒng)無(wú)菌空氣要求滅菌系統(tǒng)、管道、閥門(mén)6發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第6頁(yè)培養(yǎng)基及其滅菌培養(yǎng)基（medium）培養(yǎng)基成份碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、前體物、促進(jìn)劑、抑制劑7發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第7頁(yè)培養(yǎng)基類(lèi)型按組成按狀態(tài)按用途8發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第8頁(yè)培養(yǎng)基滅菌空罐滅菌實(shí)罐滅菌連續(xù)滅菌：高溫短時(shí)9發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第9頁(yè)第四節(jié)發(fā)酵工程制藥

過(guò)程與控制10發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第10頁(yè)種子擴(kuò)大培養(yǎng)11發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第11頁(yè)微生物發(fā)酵方式分批發(fā)酵補(bǔ)料分批發(fā)酵半連續(xù)發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵12發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第12頁(yè)13發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第13頁(yè)發(fā)酵過(guò)程中中間分析項(xiàng)目產(chǎn)物產(chǎn)量pH糖氨基氮菌絲形態(tài)14發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第14頁(yè)發(fā)酵過(guò)程影響原因及控制菌體濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溫度pH溶氧泡沫染菌發(fā)酵終點(diǎn)判斷15發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第15頁(yè)菌體濃度在適合生長(zhǎng)速率下，發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)率與菌體濃度成正比關(guān)系。尤其是初級(jí)代謝產(chǎn)物。菌體濃度過(guò)低，產(chǎn)物產(chǎn)率下降。菌體濃度過(guò)高，產(chǎn)生其它影響。辦法：調(diào)整培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度。16發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第16頁(yè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)碳源氮源磷酸鹽：生長(zhǎng)亞適量濃度補(bǔ)料：半饑餓狀態(tài)17發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第17頁(yè)溫度考慮菌種及生長(zhǎng)階段綜合考慮其它培養(yǎng)條件考慮菌種生長(zhǎng)情況發(fā)酵熱18發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第18頁(yè)pH補(bǔ)加酸或堿和補(bǔ)料方式19發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第19頁(yè)溶氧和CO2溶氧異常下降溶氧異常上升辦法20發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第20頁(yè)泡沫負(fù)面影響辦法21發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第21頁(yè)染菌發(fā)酵前期染菌發(fā)酵后期染菌22發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第22頁(yè)發(fā)酵終點(diǎn)判斷提升產(chǎn)物產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益降低生產(chǎn)成本主要指標(biāo)與中間分析項(xiàng)目雷同23發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第23頁(yè)第五節(jié)發(fā)酵工業(yè)中

代謝調(diào)控24發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第24頁(yè)代謝調(diào)控利用人為方法對(duì)微生物代謝調(diào)整系統(tǒng)進(jìn)行遺傳改造和條件控制，在確保微生物適當(dāng)生長(zhǎng)條件下，建立新代謝方式，以期按照人們意志有目標(biāo)地過(guò)量積累所需代謝產(chǎn)物，提升生產(chǎn)效率。25發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第25頁(yè)初級(jí)代謝能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)變成機(jī)體結(jié)構(gòu)物質(zhì)和對(duì)機(jī)體含有生理活性作用物質(zhì)，或是為機(jī)體生長(zhǎng)提供能量一類(lèi)代謝。26發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第26頁(yè)次級(jí)代謝存在于一些生物中（如一些植物和微生物），并在一定生長(zhǎng)久內(nèi)出現(xiàn)一類(lèi)代謝。在抵抗惡劣環(huán)境、偽裝躲避、去除本身毒素和排泄物時(shí)很主要。27發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第27頁(yè)微生物初級(jí)代謝與次級(jí)代謝關(guān)系多糖、蛋白質(zhì)、脂肪、無(wú)機(jī)鹽初級(jí)代謝中間產(chǎn)物（單糖、氨基酸、核苷酸、脂肪酸）蛋白質(zhì)、核酸、粘多糖、脂多糖等生物大分子分解合成分解代謝生物合成生長(zhǎng)抗生素、生物堿、色素、毒素等次級(jí)代謝產(chǎn)物28發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第28頁(yè)代謝產(chǎn)物合成調(diào)控初級(jí)代謝對(duì)次級(jí)代謝調(diào)整碳代謝物調(diào)整氮代謝物調(diào)整磷酸鹽調(diào)整ATP調(diào)整誘導(dǎo)物調(diào)整末端產(chǎn)物反饋調(diào)整細(xì)胞膜通透性調(diào)整其它：金屬離子、溶解氧等調(diào)整29發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第29頁(yè)初級(jí)代謝對(duì)次級(jí)代謝調(diào)整次級(jí)代謝產(chǎn)物以初級(jí)代謝產(chǎn)物為母體衍生而來(lái)。次級(jí)代謝產(chǎn)物合成反應(yīng)酶由初級(jí)代謝路徑酶演化而來(lái)。所以，初級(jí)代謝終產(chǎn)物過(guò)量往往會(huì)抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物合成。30發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第30頁(yè)碳代謝物調(diào)整葡萄糖效應(yīng)解除方法變更速效碳源和遲效碳源配比；流加葡萄糖。31發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第31頁(yè)氮代謝物調(diào)整分解代謝物阻遏效應(yīng)解除方法變更速效氮源和遲效氮源配比；流加無(wú)機(jī)氮。32發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第32頁(yè)磷酸鹽調(diào)整磷酸鹽效應(yīng)：類(lèi)似于葡萄糖效應(yīng)機(jī)制：促進(jìn)初級(jí)代謝、抑制次級(jí)代謝抑制次級(jí)代謝產(chǎn)物前體形成阻遏一些關(guān)鍵酶合成抑制一些關(guān)鍵酶活性增加菌體能荷狀態(tài)33發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第33頁(yè)ATP調(diào)整直接影響次級(jí)代謝產(chǎn)物合成和糖代謝中一些酶活性。如四環(huán)素合成。34發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第34頁(yè)誘導(dǎo)物調(diào)整一些參加次級(jí)代謝產(chǎn)物合成酶為誘導(dǎo)酶。需有誘導(dǎo)物存在，誘導(dǎo)酶才能形成。如甲硫氨酸誘導(dǎo)頭孢菌素C。35發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第35頁(yè)末端產(chǎn)物反饋調(diào)整末端產(chǎn)物抑制合成路徑中第一個(gè)酶活性，從而降低產(chǎn)物合成代謝能力。原位產(chǎn)物分離偶聯(lián)技術(shù)（insituproductremoval，ISPR）36發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第36頁(yè)細(xì)胞膜通透性調(diào)整利于代謝產(chǎn)物分泌到胞外，降低胞內(nèi)濃度，從而防止末端產(chǎn)物反饋調(diào)整。如：谷氨酸生產(chǎn)，采取控制生物素濃度、添加青霉素、添加吐溫80等表面活性劑、選育油酸缺點(diǎn)型菌株等方法。37發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第37頁(yè)抗生素發(fā)酵生產(chǎn)38發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第38頁(yè)抗生素定義生物在其生產(chǎn)活動(dòng)過(guò)程中所產(chǎn)生，并能在低微濃度下有選擇性地抑制或殺滅其它微生物或腫瘤細(xì)胞有機(jī)物。39發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第39頁(yè)發(fā)展歷史1929年，英國(guó)弗萊明發(fā)覺(jué)青霉素。二戰(zhàn)期間，大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，世界上最早用于臨床抗生素。20世紀(jì)60-70年代，利用生物合成和半合成方法研制抗生素衍生物。20世紀(jì)80年代至今，依據(jù)作用機(jī)理理性篩選階段，包含耐藥篩選模型等。40發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第40頁(yè)抗生素分類(lèi)依據(jù)抗生素生物起源分依據(jù)抗生素作用對(duì)象分依據(jù)抗生素作用機(jī)制分依據(jù)抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)分41發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第41頁(yè)依據(jù)抗生素生物起源分放線菌產(chǎn)生抗生素：鏈霉素、四環(huán)素、紅霉素真菌產(chǎn)生抗生素：青霉素、頭孢菌素細(xì)菌菌產(chǎn)生抗生素：多粘菌素、桿菌肽42發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第42頁(yè)依據(jù)抗生素作用對(duì)象分抗G+抗生素：青霉素、紅霉素抗G-抗生素：鏈霉素、多粘菌素廣譜抗生素：氨芐青霉素抗真菌抗生素：兩性霉素抗病毒和噬菌體抗生素：氯霉素、艾霉素抗原蟲(chóng)抗生素：滅滴蟲(chóng)素抗癌抗生素：阿霉素、博萊霉素43發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第43頁(yè)依據(jù)抗生素作用機(jī)制分抑制細(xì)胞壁合成：青霉素、頭孢菌素抑制細(xì)胞膜功效：多粘菌素干擾蛋白質(zhì)合成：四環(huán)素抑制核酸合成：博萊霉素、利福霉素抑制生物能作用：抗霉素44發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第44頁(yè)依據(jù)抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)分β-內(nèi)酰胺類(lèi)：青霉素類(lèi)、頭孢菌素類(lèi)氨基糖苷類(lèi)：鏈霉素、慶大霉素大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)：紅霉素、麥迪加霉素四環(huán)類(lèi)：四環(huán)素、土霉素多肽類(lèi)：多粘菌素45發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第45頁(yè)

HNONSCH3CH3HCOO-H-lactamringβ-內(nèi)酰胺環(huán)RnaturalpenicillinR=CH2-CO-β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)特征46發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第46頁(yè)氨芐青霉素甲氧苯青霉素羧芐青霉素苯唑西林47發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第47頁(yè)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)和四環(huán)類(lèi)抗生素結(jié)構(gòu)特征48發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第48頁(yè)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素生物合成L-α-氨基己二酸+L-半胱氨酸+L-纈氨酸ACV三肽ACV合成酶異青霉素N(IPN)異青霉素合成酶6-APA青霉素N，…青霉素G頭孢菌素C49發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第49頁(yè)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素代謝調(diào)控碳源分解代謝物阻遏賴(lài)氨酸反饋調(diào)整：共同中間體L-甲硫氨酸對(duì)頭孢菌素C誘導(dǎo)作用頭孢菌素C擴(kuò)環(huán)/羥化雙功效酶需Fe2+，分子氧等輔助因子纈氨酸是青霉素生物合成前體50發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第50頁(yè)青霉素發(fā)酵生產(chǎn)工藝流程51發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第51頁(yè)工藝控制關(guān)鍵點(diǎn)生產(chǎn)種子制備絲狀菌生產(chǎn)種子是由保藏在低溫冷凍安瓿管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到?。ù螅┟坠腆w培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7天，真空干燥并以這種形式保留備用。生產(chǎn)時(shí)按10%接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、尿素為主種子罐內(nèi)，26℃培養(yǎng)至菌絲濃度達(dá)6-8%，菌絲形態(tài)正常，按10-15%接種量移入含有花生餅粉、葡萄糖為主二級(jí)種子罐內(nèi)，27℃培養(yǎng)至菌絲濃度10-12%，形態(tài)正常，即可作為發(fā)酵種子。52發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第52頁(yè)培養(yǎng)基成份控制碳源產(chǎn)黃青霉菌可利用碳源有乳糖、蔗糖、葡萄糖等。當(dāng)前生產(chǎn)上普遍采取是淀粉水解液、糖化液為碳源，進(jìn)行連續(xù)流加方式。53發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第53頁(yè)氮源氮源常選取玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮，并補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源（硫酸氨、氨水或尿素）。54發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第54頁(yè)前體生物合成含有芐基基團(tuán)青霉素G，需在發(fā)酵液中加入前體。前體可用苯乙酸、苯乙酰胺，一次加入量小于0.1%，并采取屢次加入，以預(yù)防前體對(duì)青霉素毒害。55發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第55頁(yè)無(wú)機(jī)鹽加入無(wú)機(jī)鹽包含硫、磷、鈣、鎂、鉀等,且用量要適度。另外，因?yàn)殍F離子對(duì)青霉菌有毒害作用,必須嚴(yán)格控制鐵離子濃度，普通控制在30μg/ml。56發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第56頁(yè)發(fā)酵培養(yǎng)控制加糖控制加糖量控制是依據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過(guò)程中pH值確定。最好是依據(jù)排氣中CO2量及O2量來(lái)控制，普通在殘?zhí)墙抵?.6%左右，pH值上升時(shí)開(kāi)始加糖。加糖率：0.07-0.15%，每2h一次或連續(xù)流加。57發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第57頁(yè)補(bǔ)氮及加前體補(bǔ)氮是指加硫酸銨、氨水或尿素。發(fā)酵60-70開(kāi)始補(bǔ)加，使發(fā)酵液氨基氮控制在0.01%-0.05%。發(fā)酵8-12h后補(bǔ)前體，以使發(fā)酵液中殘余苯乙酰胺濃度為0.05%-0.08%。58發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第58頁(yè)pH值控制普通為pH6.5-6.9，盡可能防止超出pH7.0。pH上升能夠補(bǔ)加葡萄糖或天然油脂來(lái)控制；pH下降則提升通氣量，或補(bǔ)加氨水和碳酸鈣來(lái)控制。當(dāng)前生產(chǎn)上趨于采取直接加酸或加堿自動(dòng)控制pH。59發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第59頁(yè)溫度控制前期25-26℃，后期23℃，以降低后期發(fā)酵液中青霉素降解破壞。60發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第60頁(yè)溶解氧和攪拌速率控制普通要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧30%。通風(fēng)比普通為1:0.8vvm。攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)依據(jù)需要而調(diào)整。61發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第61頁(yè)泡沫控制在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫，能夠用天然油脂，如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑“泡敵”來(lái)消泡，應(yīng)該控制其用量并要少許屢次加入，尤其在發(fā)酵前期不宜多用，不然會(huì)影響菌體呼吸代謝。62發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第62頁(yè)發(fā)酵液質(zhì)量控制生產(chǎn)上按要求時(shí)間從發(fā)酵罐中取樣，用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)改變來(lái)控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱(chēng)“鏡檢”，依據(jù)“鏡檢”中菌絲形改變和代謝改變其它指標(biāo)調(diào)整發(fā)酵溫度，經(jīng)過(guò)追加糖或補(bǔ)加前體等各種辦法來(lái)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，以取得最多青霉素。63發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第63頁(yè)青霉素提取純化工藝64發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第64頁(yè)發(fā)酵液過(guò)濾和預(yù)處理低溫過(guò)濾：鼓式過(guò)濾或板框過(guò)濾雜蛋白去除：硫酸調(diào)pH4.5-5.0，0.07%絮凝劑PPB和0.07%硅藻土二次過(guò)濾。65發(fā)酵設(shè)備及消毒滅菌專(zhuān)家講座第65頁(yè)萃取乙酸丁酯（BA）二次萃取法一次萃取：pH1.8-2.2，濃縮倍數(shù)1.5-2.0。反萃?。簆H6.8-7.2，濃縮倍數(shù)3-4。二次萃取