類胡蘿卜植物色素的分離與測定一，實驗目的1、學會類胡蘿卜素的分離測定的方法。二，實驗基本原理β-胡蘿卜素分子中的碳骨架是由8個異戊二烯單位連接而成的，它們是四萜類化合物。它們的分子中都有一個較長的π-π共軛體系，能吸收不同波長的可見光，因而，它們都呈現(xiàn)一定的綠色，β-胡蘿卜素是黃色物質，所以，又把它們叫做多烯色素。（β-胡蘿卜素）胡蘿卜素是最早發(fā)現(xiàn)的一種多烯色素。后來，又發(fā)現(xiàn)了許多在結構上與胡蘿卜素類似的色素，于是就把這類物質叫做胡蘿卜素類化合物，或者叫做類胡蘿卜素。這類化合物大都難溶于水，易溶于弱極性或非極性的有機溶劑，因此又把這類化合物叫做脂溶性色素。胡蘿卜素廣泛存在于植物的葉、花、果實中，尤以胡蘿卜中含量最高。胡蘿卜素有α、β、γ三種異構體，在生物體中以β-異構體含量最多，生理活性最強。在動物體中，胡蘿卜素在酶的作用下可轉化為維生素A，因此，胡蘿卜素又被叫做維生素A原。胡蘿卜素在人和高等動物體內就有重要的生理功能，是人和高等動物生存不可缺少的營養(yǎng)物質。三，實驗儀器與試劑儀器：三角瓶（50ml）、分液漏斗（150ml）、蒸餾瓶（50ml）、普通蒸餾裝置（或減壓蒸餾裝置）、色譜柱、硅膠薄層板、量筒、燒杯、試管、721分光光度計、層析缸。試劑：番茄（或番茄醬）或胡蘿卜、食鹽、丙酮、乙酸乙酯、石油醚（60~90℃）、乙醇、污水硫酸鎂、氧化鋁（層析用，100~200目）、硅膠（層析用，200~300目）、無水硫酸鈉、石油醚（60~90℃）：乙醇（2：1，V/V）、石油醚：丙酮（3：2，V/V）。四，實驗內容與步驟1、類胡蘿卜素的柱色譜分離：選一支1.5*20cm的色譜柱，用適量層析用氧化鋁（100~200目）作吸附劑干法裝柱，高度約10cm，要求緊密勻實。分離方式為梯度洗脫，第一步用石油醚（60~90℃）洗脫。先沿色譜柱管壁滴加5~8ml石油醚至柱體（各方向要均勻），待溶劑表面降至氧化鋁柱面頂端時，用滴管迅速地小心滴加5~10滴樣品至柱子中，待樣品液面即將在柱面上消失時，沿管壁小心滴加石油醚3~5滴，沖洗粘在管壁上的有色物質。如此重復3~4次，直至管壁沖洗干凈為止。隨后，在管內加入盡可能多的石油醚進行洗脫，第一步收集到的洗脫液為黃色。待洗脫液清亮無色后用石油醚：丙酮（3：2，V/V）的混合液洗脫，第二步收集到的洗脫液為紅色。最后用丙酮將前兩步不能洗脫的剩余組分洗脫下來。分別收集第三步洗脫液，用薄層色譜檢測及分光光度法測定。2、類胡蘿卜素的薄層色譜檢測：對前面得到的類胡蘿卜素樣品以及柱色譜分離得到的樣品分別進行薄層分析，以檢查柱色譜分離效果。薄層層析板預先用硅膠G制備并活化（110℃，1小時），展開劑為石油醚：丙酮（3：2，V/V）。薄層分離后觀察斑點位置，計算各斑點的Rf值，并明確各斑點歸屬。在本實驗條件下，薄層檢測結果為：β-胡蘿卜素，黃色，Rf值為0.89；番茄紅素，深紅色，Rf值為0.84。3、類胡蘿卜素的分光光度法測定取柱色譜分離后得到的樣品，用丙酮適當稀釋至儀器測量范圍，然后用721分光光度計分別在420~520范圍測定它們的光密度E，并做出E-λ曲線（每隔10nm測定一次光密度）。指出各自最大吸收峰λmax，并與標準吸收對照鑒定。五，注意事項：1、新鮮番茄果肉組織中含有大量水分，類胡蘿卜素處在含水量很高的細胞環(huán)境中，有機溶劑不易滲透進去，因此，為了提高提取效率，減少提取溶劑用量，應首先用食鹽對番茄果肉進行脫水處理。經(jīng)食鹽一次脫水處理后，番茄果肉里仍然有一定量水分，致使所用提取溶劑還是無法進入細胞內很好地將類胡蘿卜素溶出，故選用弱極性溶劑丙酮對之進一步脫水，同時也會溶出部分類胡蘿卜素。為了最大限度地減少類胡蘿卜素的損失，故應將前兩步脫除下來的水分及這一步的丙酮浸提液都濾入分液漏斗中合并處理。經(jīng)丙酮處理后的番茄果肉便可直接加有機溶劑浸提。如果用番茄醬或胡蘿卜作原料提?。活惡}卜素，食鹽脫水及丙酮進一步脫水處理這些步驟便可省去。2、濃縮提取液時應當用水浴加熱蒸餾瓶；最好用減壓蒸餾，而且不可蒸得太快、太干，以免類胡蘿卜素受熱分解破壞。3、如用乙酸乙酯提取類胡蘿卜素提取液濃縮至1~2ml后，