教學(xué)目標(biāo)：1、闡明動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件和過(guò)程。2、簡(jiǎn)述干細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)工程中有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。3、闡明利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)制備單克隆抗體的過(guò)程，認(rèn)同單克隆抗體在臨床上有重要的應(yīng)用價(jià)值。4、闡明利用動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆動(dòng)物的過(guò)程和該技術(shù)的應(yīng)用前景。教學(xué)重點(diǎn)：1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件和過(guò)程。

2、干細(xì)胞在生物醫(yī)學(xué)工程中的應(yīng)用。3、單克隆抗體的應(yīng)用和制備。4、用動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆動(dòng)物的過(guò)程教學(xué)難點(diǎn)：?jiǎn)慰寺】贵w的制備過(guò)程；用動(dòng)物細(xì)胞體細(xì)胞核移植技術(shù)克隆動(dòng)物的過(guò)程。第2章細(xì)胞工程第2節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程運(yùn)用植物體細(xì)胞雜交技術(shù)，可以跨越不同種植物之間生殖隔離的屏障，培育出新的作物類(lèi)型。有沒(méi)有技術(shù)能讓不同種動(dòng)物的體細(xì)胞進(jìn)行雜交，培育出集不同細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)于一身的動(dòng)物細(xì)胞呢？1970年人-鼠細(xì)胞融合融合實(shí)驗(yàn)滅活的仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)2、結(jié)果：二、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體1、概念：（一）動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)就是使兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。誘導(dǎo)融合雜交細(xì)胞雜交細(xì)胞具有原兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的遺傳信息。3、原理：細(xì)胞膜的流動(dòng)性4、融合完成的標(biāo)志：細(xì)胞核融合，形成單核細(xì)胞物理方法：電融合法等誘導(dǎo)融合雜交細(xì)胞化學(xué)方法：PEG融合法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法與植物原生質(zhì)體融合的誘導(dǎo)方法相同5、誘融方法：生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法滅活：是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。原理：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞相互凝集，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開(kāi)，細(xì)胞發(fā)生融合。物理方法：電融合法等誘導(dǎo)融合雜交細(xì)胞化學(xué)方法：PEG融合法生物方法：滅活病毒誘導(dǎo)法與植物原生質(zhì)體融合的誘導(dǎo)方法相同思考：19世紀(jì)30年代，科學(xué)家曾在肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內(nèi)病毒等誘導(dǎo)多個(gè)體細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。5、誘融方法：6、意義：突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細(xì)胞膜的流動(dòng)性植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動(dòng)性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能7、應(yīng)用：（1）細(xì)胞融合技術(shù)已經(jīng)成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。（2）利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來(lái)的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開(kāi)辟了新途徑。誘導(dǎo)融合雜交細(xì)胞什么是抗體？怎么產(chǎn)生的？主要分布在哪？概念：

抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。產(chǎn)生：B細(xì)胞受抗原刺激后，增殖分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞合成并分泌抗體。分布：主要分布于血清中,也分布于組織液及外分泌液中（二）單克隆抗體及其應(yīng)用1、傳統(tǒng)抗體制備的方法產(chǎn)量低純度低特異性差缺點(diǎn)：反復(fù)注射抗原動(dòng)物產(chǎn)生抗體從動(dòng)物的血清中分離抗體如何獲得大量的單一抗體呢？每一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體單一B淋巴細(xì)胞細(xì)胞群選擇克隆產(chǎn)生大量純度高特異性強(qiáng)的抗體注意：在體外培養(yǎng)條件下一個(gè)B淋巴細(xì)胞不可能無(wú)限增殖有能無(wú)限增殖的細(xì)胞嗎？利用產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)無(wú)性繁殖（克?。?，形成細(xì)胞群，這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體稱(chēng)為單克隆抗體。2、單克隆抗體1975年英國(guó)科學(xué)家米爾斯坦和德國(guó)科學(xué)家科勒的設(shè)想：B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（能產(chǎn)生抗體）（能大量增殖）融合細(xì)胞（既能產(chǎn)生抗體，又能大量增殖）米爾斯坦科勒

由于發(fā)明了單克隆抗體的制備技術(shù)，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)單克隆抗體制備過(guò)程是怎樣的？B淋巴細(xì)胞多種骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合能產(chǎn)生抗體，但不能大量增殖不能產(chǎn)生抗體，但能大量增殖PEG融合法、電融合法、滅活病毒注射特定的抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞從脾中提取目的：獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的B細(xì)胞誘導(dǎo)融合之后，一定會(huì)得到雜交瘤細(xì)胞嗎？多種雜交細(xì)胞：未融合的細(xì)胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng)雜交瘤細(xì)胞：（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）第二次篩選：克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)（可進(jìn)行多次）抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)多孔細(xì)胞培養(yǎng)板（能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞）得到的雜交瘤細(xì)胞一定是所需的嗎？雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞抗體檢測(cè)呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）注射到小鼠腹腔內(nèi)體外培養(yǎng)單克隆抗體從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提?。墚a(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞）特定抗原多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合多種融合細(xì)胞選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選雜交瘤細(xì)胞抗體檢測(cè)分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射小鼠腹腔內(nèi)增殖克隆化培養(yǎng)多次篩選單克隆抗體獲取注射小鼠培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞未融合細(xì)胞(第一次篩選)(第二次篩選)3、制備過(guò)程：注：1、該過(guò)程中應(yīng)用到的技術(shù)：2、注射特定抗原的目的：3、第一次篩選的原因：

目的：

方法：原理：4、雜交瘤細(xì)胞的特點(diǎn)：動(dòng)物細(xì)胞融合、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用特定的抗原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞獲得雜交瘤細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選在選擇培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng)既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體有B、瘤、B-B、瘤-瘤、B-瘤細(xì)胞5、第二次篩選的目的：方法：選擇抗體檢測(cè)呈___性的雜交瘤細(xì)胞，即6、抗體檢測(cè)原理：7、如何獲取大量所需雜交瘤細(xì)胞：8、如何獲取單克隆抗體①體外培養(yǎng)：②小鼠腹腔內(nèi)培養(yǎng)：獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)（進(jìn)行多次篩選）分泌的抗體能與特定的抗原結(jié)合陽(yáng)抗原和抗體能夠特異性結(jié)合(分子水平的鑒定）在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)（接種于培養(yǎng)液中）或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖從細(xì)胞培養(yǎng)液中獲取從小鼠腹水中獲取思考·討論資料1:用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”在妊娠第8天就可以做出診斷，這比原來(lái)的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對(duì)胎兒造成不利影響。該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確率在90%以上。資料2:使用高效的細(xì)胞毒素類(lèi)藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。ADC示意圖問(wèn)題：細(xì)胞毒素沒(méi)有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會(huì)對(duì)健康細(xì)胞造成傷害。解決方法：抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)，將細(xì)胞毒素與能特異性識(shí)別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。抗體藥物接頭思考·討論ADC的作用機(jī)制示意圖①ADC②③④溶酶體裂解釋放藥物⑤細(xì)胞凋亡思考·討論討論：1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過(guò)特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原,將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞。藥物發(fā)揮治療效應(yīng)。如殺傷靶細(xì)胞。思考·討論2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療。一些作用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路來(lái)抑制其生長(zhǎng)，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療。3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床上各具有什么優(yōu)勢(shì)？單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng),因此檢測(cè)的特異性和靈敏度大大提高;生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用,有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒。ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識(shí)別的靶向作用和細(xì)胞毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)。思考·討論4.單克隆抗體在臨床上還有哪些應(yīng)用？單克隆抗體在臨床上的應(yīng)用涉及治療、診斷等方面。單克隆抗體藥物已被廣泛用于腫瘤、自身免疫病等疾病的治療,如利妥昔單抗被用于治療復(fù)發(fā)難治的低分化B細(xì)胞淋巴瘤；曲妥珠單抗被用于治療乳腺癌等。在臨床診斷方面,單克隆抗體被廣泛用于一些感染性疾病的檢測(cè)、腫瘤的診斷、激素和細(xì)胞因子的測(cè)定等。以單克隆抗體在診斷腫瘤方面的應(yīng)用為例,用放射性同位素或熒光標(biāo)記抗腫瘤表面抗原的單克隆抗體,可以用這些抗體來(lái)對(duì)體內(nèi)的腫瘤進(jìn)行定位，輔助診斷并確定腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移等。思考·討論①作為診斷試劑②運(yùn)載藥物③作為藥物治療疾病診斷疾病治療疾病4、單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確識(shí)別抗原的細(xì)微差異、與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合、可大量制備5、應(yīng)用：①作為診斷試劑應(yīng)用利用放射性同位素或熒光標(biāo)記的單克隆杭體，在特定的組織中成像的枝術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。病毒蛋白的檢測(cè)依賴(lài)抗體(如圖)優(yōu)點(diǎn)：可以省去提取病毒核酸的繁瑣步驟，直接用發(fā)病期患者的血清或痰液進(jìn)行蛋白免疫分析，在短時(shí)間內(nèi)就可得到結(jié)果。缺點(diǎn)：相比核酸檢測(cè)，蛋白檢測(cè)具有滯后性，不能及時(shí)檢測(cè)出是否感染病毒。②運(yùn)載藥物應(yīng)用ADC=單克隆抗體+接頭+藥物抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）由單克隆抗體、連接子和小分子細(xì)胞毒藥物偶聯(lián)而成，可以像精準(zhǔn)制導(dǎo)的導(dǎo)彈一樣對(duì)癌細(xì)胞實(shí)施精準(zhǔn)打擊。瞄準(zhǔn)裝置爆炸裝置脂質(zhì)體給藥高效

低毒

靶向抗腫瘤藥物載體：阿霉素脂質(zhì)體和順鉑脂質(zhì)體已在國(guó)外上市。②運(yùn)載藥物應(yīng)用應(yīng)用③治療疾病單克隆抗體不僅可以運(yùn)載藥物，而且自身也能用于治療疾病。單克隆抗體藥物占有非常重要的地位。排名藥物中文名銷(xiāo)售額(億美元)適應(yīng)癥類(lèi)型1Humria修美樂(lè)199.36自身免疫疾病單抗6Herceptin赫賽汀70.32乳腺癌等多種癌癥單抗7Avastin安維汀68.98結(jié)腸癌等多中癌癥單抗8Rituxan美羅華68.01白血病單抗9Opdivo納武單抗67.35多種腫瘤單抗2018年全球藥物銷(xiāo)售額排名前10的單抗藥物修美樂(lè)已連續(xù)8年蟬聯(lián)榜首。2021年新冠疫苗(mRNA疫苗)位居榜首，修美樂(lè)位居第二位。修美樂(lè)(即阿達(dá)木單抗)是全人源化單克隆抗體的一種，也是一種可自我注射的生物治療藥物，是全球首個(gè)被批準(zhǔn)的腫瘤壞死因子全人源單克隆抗體。阿達(dá)木單抗在全球有10個(gè)適應(yīng)證獲批，在中國(guó)它先后在國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局獲批了2個(gè)適應(yīng)證，分別是類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎。例：多年位居全球藥物銷(xiāo)售榜首的單抗——修美樂(lè)PD-1及其配體（PD-L1）抑制劑是免疫哨點(diǎn)單抗藥物，其應(yīng)答之廣度、深度、和持久性均十分罕見(jiàn)，是近年來(lái)腫瘤免疫療法研究的熱點(diǎn)。已上市的尼伏單抗、潘利珠單抗和替雷利珠單抗屬于PD-1抑制劑，主要用于黑素瘤和非小細(xì)胞肺癌的治療，對(duì)腎細(xì)胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等的療效還在大規(guī)模臨床試驗(yàn)中。PD-L1抑制劑阿替珠單抗、度伐單抗和阿維單抗已被批準(zhǔn)用于治療尿道上皮癌。例：癌癥的免疫治療中國(guó)首個(gè)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)抗新冠特效藥：安巴韋單抗和羅米司韋單抗獲批。例：我國(guó)自主研制的抗新冠特效藥2021年，由清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授、清華大學(xué)全球健康與傳染病研究中心與艾滋病綜合研究中