1進(jìn)出口化妝品中病原菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法第2部分：金黃色葡萄球菌本文件描述了進(jìn)出口化妝品中金黃色葡萄球菌的微滴式數(shù)字PCR檢測方法。本文件適用于進(jìn)出口化妝品中金黃色葡萄球菌的快速檢測。本文件所能達(dá)到的檢出限(LODm)為0.76CFU/g(mL)-3.93CFU/g(mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最忻版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測SN/T5075化妝品微生物檢驗(yàn)制樣規(guī)范化妝品安全技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要等定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA:脫氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcd)dAPCR:微滴式數(shù)字PCR(dropletdigitalPdyineraseChainReaction)PCR:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction)16SrRNA:168核糖體RNA(16SribosomalRNA)5方法原理針對金黃色葡萄球菌16SRNA編碼基因的保守序列設(shè)計(jì)引物、探針。將一定濃度的引物、探針與模板DNA及反應(yīng)預(yù)混液混合，配成PCR反應(yīng)體系。將該數(shù)字PCR體系分布到12000個(gè)~20000個(gè)微滴中，使大部分微滴中模板DNA分子的數(shù)量為1或0,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16SrRNA基因探針5°端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記MGB。利用數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測通道，可對每個(gè)微滴的熒光信號進(jìn)行采集分析。含有模板DNA的微滴出現(xiàn)熒光信號的增強(qiáng)，形成陽性微滴簇。最終根據(jù)陽性微滴的2有無判定樣品中是否含有金黃色葡萄球菌。6設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：6.1恒溫培養(yǎng)箱：36℃±1℃。6.2冰箱：2℃~8℃、-20℃。6.3均質(zhì)器或乳液分散機(jī)(轉(zhuǎn)速1000r/min以上)。6.4電子天平：感量0.1g。6.5高速微量離心機(jī)(最大離心力不小于10000g)。6.6渦旋振蕩儀。6.7加熱裝置：95℃-100℃。6.8核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。6.9無菌均質(zhì)袋或均質(zhì)杯。6.10生物安全柜。6.11ddPCR擴(kuò)增儀及相關(guān)配套設(shè)備。6.12移液器及配套吸頭：100μL-1000μL、20μL~200μL,101100μL、0.5μL-10μL。6.14陽性對照：金黃色葡萄球菌ATCC6538或等效菌株或含目的片段的DNA。7材料與試劑7.1僅使用分析純試劑和符合GB/T6682規(guī)定的一級水。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。7.2DNA提取液：見附錄A中A17.3大豆酪蛋白卵磷脂吐溫80(SCDLP)液體培養(yǎng)基：見附錄A中A.2。7.4細(xì)菌基因組提取試河盒7.5生理鹽水：見附錄A.3。7.6ddPCR反應(yīng)配套試劑。7.7金黃色葡萄球菌16SrRNA編碼基因特異性序列片段參見附錄B,引物探針如下：Primer-F:5'-CGTCCCTAATACATGCAAGTCGPrimer-R:5'-GGTTTCCCGAAGTTATCCCAGTCProbe-P:5'-FAM-AACGGACGAGAAGCT-M8檢驗(yàn)程序進(jìn)出口化妝品中金黃色葡萄球菌ddPCR檢驗(yàn)程序見圖1。吸取10mL1:10樣品稀釋液接種到90mLSCDLP增菌液中，置于36℃±1℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)棄去上清液。在沉淀中加人50μLDNA提取液振蕩混勻，于95℃~100℃加熱10min,室溫冷卻義4按照公式(1)計(jì)算DNA的濃度。p—DNA濃度，單位為納克每微升(ng/L);A—260mm處的吸光值；N——核酸稀釋倍數(shù)。A/Am在1.8-20之間，DNA濃度為0.01ng/μL-10ng/μL時(shí)，適用ddPCR檢測。檢測過程中分別設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。以金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA或含目的片段的DNA作為陽性對照，以非金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為陰性對照，用等體積的一級水代替模板DNA作為空白對照。每個(gè)待檢樣品提取的DNA溶液進(jìn)行3個(gè)平行ddPCR檢測。按照表1配制dIPCR反應(yīng)體系。"一水一一將配制好的ddPCR反應(yīng)混合液，加人微滴生成裝置加樣孔中，按儀器操作說明生成微滴。將生成的微滴八連管加蓋后，緩慢轉(zhuǎn)移至PCR儀上，按以下參