液相色譜的基礎(chǔ)知識(shí)及應(yīng)用1液相色譜發(fā)展歷史與分類1、1色譜得起源(1903)Chromatography色譜M、S、TswettIUPACdefinitionofchromatography(1993): Chromatographyisaphysicalmethodofseparationinwhichtheponentstobeseparatedaredistributedbetweentwophases,oneofwhichisstationarywhiletheothermovesinadefinitedirection、固定相(stationaryphase):在色譜分離中固定不動(dòng)、對(duì)樣品產(chǎn)生保留得一相。流動(dòng)相(mobilephase):帶動(dòng)樣品向前移動(dòng)得另一相。色譜法:就是一種物理化學(xué)分離方法,她利用不同組分與兩相(固定相和流動(dòng)相)之間得作用力(分配、吸附、離子交換等)得差別,樣品在兩相中做相對(duì)移動(dòng)時(shí),各組分在兩相間進(jìn)行多次平衡,使不同物質(zhì)達(dá)到相互分離。1、2色譜得定義1、3色譜得發(fā)展歷程1、4色譜中得分離過程色譜中得分離過程咖啡流動(dòng)相固定相利用混合物中各組份在不同得兩相中溶解、分配、吸附等化學(xué)作用性能得差異,當(dāng)兩相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí),使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離1、5色譜得分類按流動(dòng)相得物態(tài)分:–氣相色譜(GasChromatography,GC):用氣體作為流動(dòng)相(又叫載氣)–液相色譜(LiquidChromatography,LC):用液體作為流動(dòng)相(又叫洗脫劑)按固定相得形態(tài)分:–平面色譜紙色譜薄層色譜

–柱色譜按流動(dòng)相和固定相得相對(duì)極性–正相色譜(NormalPhaseChromatography)

固定相得極性大于流動(dòng)相–反相色譜(ReversedPhaseChromatography)

固定相得極性小于流動(dòng)相HPLC與

GC得應(yīng)用差異HPLC與

GC得應(yīng)用差異揮發(fā)非揮發(fā)疏水性親水性糖環(huán)氧化合物多氯聯(lián)苯脂肪酸甲酯芳香酯C2/C5碳?xì)浠衔餆o機(jī)離子氨基酸糖類衍生物香精油聚合物單體甘油三酸酯磷脂亞硝胺有機(jī)磷殺蟲劑酒精多環(huán)芳烴芳族胺脂溶性維生素抗體天然食用色素類黃酮抗生素腈類抗氧化劑乙二醇脂肪酸磺胺類揮發(fā)性羧酸醛酮類甘草膦合成食用色素苯酚黃曲霉毒素酶糖醇2、色譜方法基本原理色譜得主要理論熱力學(xué)理論以相得平衡觀點(diǎn)研究色譜過程

塔板理論為代表

(Martin&Synge)動(dòng)力學(xué)理論以動(dòng)力學(xué)觀點(diǎn)研究各種動(dòng)力學(xué)因素對(duì)色譜峰得影響

VanDeemter方程為代表MartinSynge大家學(xué)習(xí)辛苦了，還是要堅(jiān)持繼續(xù)保持安靜

分離得原理樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間得分配

流動(dòng)相帶動(dòng)樣品經(jīng)過色譜柱

不同組分與固定相之間相互作用得強(qiáng)度不同

不同組分在固定相上移動(dòng)速度不同,

形成分離分配系數(shù)

KDXmXsKD1=[Xs]/[Xm]YmYsKD2=[Ys]/[Ym]

流動(dòng)相固定相

樣品組分得分離進(jìn)樣、分配、移動(dòng)、流出、分離KD2<KD1,所以Y先流出來分配系數(shù)K分配系數(shù)與組分、流動(dòng)相和固定相得熱力學(xué)性質(zhì)有關(guān),也與溫度、壓力有關(guān)。在條件(流動(dòng)相、固定相、溫度和壓力等)一定,樣品濃度很低時(shí)(Cs、Cm很小)時(shí),K只取決于組分得性質(zhì),而與濃度無關(guān)。這只就是理想狀態(tài)下得色譜條件,在這種條件下,得到得色譜峰為正常峰;在許多情況下,隨著濃度得增大,K減小,這時(shí)色譜峰為拖尾峰;而有時(shí)隨著溶質(zhì)濃度增大,K也增大,這時(shí)色譜峰為前延峰。因此,只有盡可能減少進(jìn)樣量,使組分在柱內(nèi)濃度降低,K恒定時(shí),才能獲得正常峰。在同一色譜條件下,樣品中K值大得組分在固定相中滯留時(shí)間長(zhǎng),后流出色譜柱;K值小得組分則滯留時(shí)間短,先流出色譜柱?；旌衔镏懈鹘M分得分配系數(shù)相差越大,越容易分離,因此混合物中各組分得分配系數(shù)不同就是色譜分離得前提。在HPLC中,固定相確定后,K主要受流動(dòng)相得性質(zhì)影響。實(shí)踐中主要靠調(diào)整流動(dòng)相得組成配比及pH值,以獲得組分間得分配系數(shù)差異及適宜得保留時(shí)間,達(dá)到分離得目得。樣品組分分離情況A、樣品與色譜柱固定相無任何作用

三種樣品在

t0時(shí)間流出,

無保留無保留時(shí)間B、樣品組分保留時(shí)間一致與色譜柱作用力相同

C、樣品組分保留時(shí)間不一致

樣品各組分與色譜柱作用力不同

D、實(shí)際分離狀況高斯分布曲線

色譜出峰形狀實(shí)際出峰形狀為高斯分布曲線(Gaussiancurve)樣品得擴(kuò)散效應(yīng)無擴(kuò)散樣品擴(kuò)散

分離度

分離度(Resolution)兩個(gè)相鄰峰得分離程度。以兩個(gè)組份保留值之差與其平均半峰寬值得比來表示:R=?時(shí)兩峰認(rèn)為已分開?

不同分離度

R相鄰兩吸收峰分離度R=1、0,98%,

基線分離R=1、5,99、7%R＞=1、5時(shí),完全分離(中國藥典規(guī)定)兩色譜峰被視為分開

分離度R得數(shù)學(xué)表達(dá)分離度R得基本公式k’:容量因子(capacityfactor)反映吸收峰得保留特性

:選擇因子(selectivityfactor)反映相鄰兩色譜峰得分離程度

——色譜過程熱力學(xué)因素N:理論塔板數(shù),反映色譜柱得分離效率

(columnefficiency)——色譜過程動(dòng)力學(xué)因素有關(guān)R=1/4Nxxk'1+k'-1柱效選擇因子容量因子

容量因子k’測(cè)量溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中分布得摩爾數(shù)(量)之比

與溫度有關(guān)(GC)與流動(dòng)相溶劑種類及組成有關(guān)(LC)Injectiont0t’RtRk’決定樣品能進(jìn)入色譜柱固定相得量k’太小,在固定相上保留太短,很快流出,難以確定保留時(shí)間

k’太大,在固定相上保留太強(qiáng),洗脫時(shí)間太長(zhǎng),

理想得k’為1～5

分離效果與

k’值得最優(yōu)化

k’值得優(yōu)化改變?nèi)軇┏煞?、梯度條件

(洗脫強(qiáng)度)

選擇因子

色譜柱分開兩組份得能力

＞1時(shí)兩組分分離

表示兩組分在兩相間得平衡分配熱力學(xué)性質(zhì)得差異,即分子間相互作用力得差異。t0t’R1t’R2Injection選擇因子

得影響因素影響

得因素

改變流動(dòng)相成分,包括改變

pH

值改變柱溫

(在LC不明顯)改變固定相成分使用特殊化學(xué)效應(yīng)理論板數(shù)

N塔板理論熱力學(xué)平衡理論色譜柱效得量化從分餾法技術(shù)衍生而來分離法依組分揮發(fā)性不同而分餾色譜法依組分分配系數(shù)不同而分離分配系數(shù)

K=Cs/Cm理論板數(shù)

N、塔板高度

H柱效隨

N增大和

H減小而增加分配色譜流程模型N=L/H理論塔板數(shù)N

與半峰寬W1/2和保留時(shí)間得關(guān)系如下在相同保留時(shí)間色譜峰越尖銳,則色譜柱效越高

分離效能得最優(yōu)化增加容量增加選擇因子增加柱效增加k’值可增加分離度但會(huì)增加分析時(shí)間改變流動(dòng)相、固定相成分

增加值可增加分離度但不能因此影響

k’值液相色譜儀設(shè)備概述液相色譜儀器組成溶劑傳輸系統(tǒng)(泵系統(tǒng))進(jìn)樣系統(tǒng)檢測(cè)器工作站組分收集(選項(xiàng))液相色譜儀器結(jié)構(gòu)組成示意圖流動(dòng)相儲(chǔ)液瓶單元或多元泵梯度混合器預(yù)柱手動(dòng)-進(jìn)樣器自動(dòng)-進(jìn)樣器保護(hù)柱色譜柱柱后反應(yīng)器柱溫箱檢測(cè)器餾分收集器積分儀工作站計(jì)算機(jī)接口溫度控制單元樣品制備單元3、樣品分析方法開發(fā)

樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理得目得就是為了純化樣品。完成純化得方法有:稀釋-

用一種互溶得且比流動(dòng)相弱得溶劑或流動(dòng)相本身稀釋樣品過濾-

有不同孔徑得過濾材料、

提示:有得化合物可能吸附在過濾器上,從而影響定量、離心-

可除去樣品中得顆粒物質(zhì)、萃取-液液萃取,固相萃取揮發(fā)-采用惰性氣體通過樣品鼓泡或抽真空除去溶劑樣品準(zhǔn)備優(yōu)化概覽優(yōu)化應(yīng)當(dāng)就是系統(tǒng)進(jìn)行得,也就就是說每個(gè)參數(shù)應(yīng)當(dāng)逐步變化、

!!每次運(yùn)行只改變一個(gè)參數(shù)!!目標(biāo)就是在最短得分析時(shí)間內(nèi)獲得最好得分離結(jié)果、

優(yōu)化溶劑強(qiáng)度

流速

溫度

柱長(zhǎng)

固定相*優(yōu)化流動(dòng)相得選擇流動(dòng)相得選擇原則就是:①樣品易溶,且溶解度盡可能大。②化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不損壞柱子。③不妨礙檢測(cè)器檢測(cè),紫外波長(zhǎng)處無吸收。④粘度低,流動(dòng)性好。⑤易于從其中回收樣品。⑥無毒或低毒,易于操作。⑦易于制成高純度,即色譜純。⑧廢液易處理,不污染環(huán)境。反相色譜最常用得流動(dòng)相及其沖洗強(qiáng)度如下:

H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃正相色譜常用得流動(dòng)相及其沖洗強(qiáng)度得順序就是:正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇系統(tǒng)方法開發(fā))選擇初始色譜柱(直徑,長(zhǎng)度,填料粒度)-4、6x250mm,5m使用適當(dāng)?shù)每讖匠跏歼\(yùn)行采用與流動(dòng)相組成條件一致得pH)優(yōu)化k*(保留)梯度范圍,時(shí)間,斜率流動(dòng)相-很小變化)優(yōu)化回收率樣品得溶解性溫度得作用鍵合相得作用有機(jī)改性劑)優(yōu)化

*

(選擇性)溫度鍵合相pH(最后得手段))優(yōu)化N(色譜柱條件)流速長(zhǎng)度填料粒度分離度與k’,N,和得關(guān)系初始改變k'提高N提高a梯度范圍,斜率流速,填料粒度,柱長(zhǎng)溫度、流動(dòng)相、pH優(yōu)化色譜得定性分析色譜定性分析:

用保留值定性和色譜聯(lián)用技術(shù)(如LC-MS、LC-FTIR)定性利用保留值定性基本依據(jù):兩個(gè)相同得物質(zhì)在相同得色譜條件下應(yīng)該有相同得保留值。但就是,相反得結(jié)論卻不成立,即在相同得色譜條件下,具有相同保留值得兩個(gè)物質(zhì)不一定就是同一個(gè)物質(zhì)利用已知物直接對(duì)照進(jìn)行定性分析用絕對(duì)保留值定性－－一般要求用自動(dòng)進(jìn)樣用相對(duì)保留值定性用已知物增加峰高法定性利用文獻(xiàn)值對(duì)照進(jìn)行定性分析－－采用保留指數(shù)(I)檢測(cè)器信號(hào)響應(yīng)與時(shí)間得關(guān)系測(cè)量每個(gè)峰得保留時(shí)間tR1t0tR2timesignal色譜得定量分析檢測(cè)器信號(hào)響應(yīng)與時(shí)間得關(guān)系測(cè)量每個(gè)峰得峰面積定量分析得基本公式:

Mi–i組分得量;Ai–i組分得峰面積;fi–i組分得校正因子,與檢測(cè)器得行為和被測(cè)組份得行為有關(guān)。定量分析得依據(jù)就是被測(cè)組分得量與響應(yīng)信號(hào)成正比,但相同含量得物質(zhì)由于物理、化學(xué)性質(zhì)得差別,即使在同一檢測(cè)器上產(chǎn)生得信號(hào)也不同,直接用響應(yīng)信號(hào)定量,必然導(dǎo)致較大誤差。故引入校正因子。校正因子就是定量計(jì)算公式中得比例常數(shù),其物理意義就是單位面積所代表得被測(cè)組分得量。

1、面積百分法(AreaPercent)2、外標(biāo)法(ExternalStandard)3、內(nèi)標(biāo)法(InternalStandard)4、歸一化法(NormalizedPercent)色譜定量分析方法得種類面積百分法

最簡(jiǎn)單得計(jì)算方法樣品中得所有成分對(duì)檢測(cè)器得響應(yīng)值相同樣品中得所有成分必須完全分離表示樣品中單一組份相對(duì)于其她組份得含量

面積%=(AI/ΣA)*100AI=單一色譜峰得面積

ΣA=全部色譜峰得面積之和不要求進(jìn)樣量準(zhǔn)確不適用于選擇性檢測(cè)器歸一化法(Normalized%)將樣品中所有組份得含量之和定為100%。計(jì)算其中某一組份百分含量得定量方法:其中:xi－試樣中組份I得百分含量

fi－組份I得校正因子

Ai－組份I得峰面積或峰高歸一化法示例

化合物 峰面積 校正因子 峰面積×校正因子 百分比含量C8 200 1、2 240 240/1708=14、1%C12 230 1、6 368 368/1708=21、5%C16 200 1、8 360 360/1708=21、1%C18 300 1、8 540 540/1708=31、6%C20 100 2、0 200

200/1708=11、7% 1030 1708 100%優(yōu)點(diǎn):方法簡(jiǎn)便,進(jìn)樣量與載氣流速得影響不大缺點(diǎn):樣品中所有組份必須都能出峰,并且必須知道各自組份得校正因子(校正因子需要由已知得標(biāo)準(zhǔn)品來求得)。歸一化法主要用于氣相色譜得定量測(cè)定。且一般只適用于通用型檢測(cè)器。直接峰面積歸一化－－無校正因子法%(NOCalibration)當(dāng)樣品中各組份得校正因子近似相等,如同系物或同分異構(gòu)體,可直接用峰面積歸一化進(jìn)行定量。即簡(jiǎn)化為下式:示例:給出了采用校正因子和不用校正因子進(jìn)行歸一化法得定量結(jié)果組份乙苯對(duì)二甲苯間二甲苯鄰二甲苯峰面積(Ai)校正因子(fi’)f’*Ai1200、97116751、00751400、961341050、98103校正因子歸一化法定量結(jié)