基因工程概論第一章、基因工程的基本概念第二章、基因工程的基本原理第三章、基因工程所需要的基本條件第四章、基因工程操作過程第五章、目的基因克隆戰(zhàn)略第六章、動(dòng)植物基因工程簡介第一章基因工程的概念1、重組DNA技術(shù)的基本定義重組DNA技術(shù)是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組DNA技術(shù)的三大基本元件。2、基因工程的基本定義基因工程是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過程。第一章基因工程的概念3、重組DNA技術(shù)與基因工程的基本用途（1）分離、擴(kuò)增、鑒定、研究、整理生物信息資源（2）產(chǎn)生物活性物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)（3）設(shè)計(jì)、構(gòu)建生物的新性狀甚至新物種第一章基因工程的概念大規(guī)模生產(chǎn)生物活性物質(zhì)第一章基因工程的概念基因工程的特點(diǎn)1）不受親緣關(guān)系限制；2）可以定向改變生物的遺傳特征；3）增加目的基因的劑量。第一章基因工程的概念第一章基因工程的概念第二章基因工程的基本原理基因工程技術(shù)的基礎(chǔ)理論19世紀(jì)中孟德爾豌豆雜交試驗(yàn)遺傳因子經(jīng)典遺傳學(xué)20世紀(jì)摩爾根果蠅雜交實(shí)驗(yàn)基因基因?qū)W1944年艾弗瑞肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)遺傳物質(zhì)是DNA分子遺傳學(xué)－解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題1953年，沃森－克瑞克DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制分子生物學(xué)－解決了遺傳機(jī)制問題60年代確定了中心法則---解決了遺傳信息的傳遞問題70年代發(fā)現(xiàn)了工具酶1973年伯格－杰克森－考恩－鮑耶完成了DNA的體外拼接誕生了基因工程技術(shù)80年代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)形成第二章基因工程的基本原理基因的分子生物學(xué)基礎(chǔ)第二章基因工程的基本原理基因工程的基本原理（1）提高外源基因的劑量——分子遺傳學(xué)原理（2）篩選修飾重組基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，如：啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操作子、終止子、上游調(diào)控序列等——分子生物學(xué)原理（3）修飾構(gòu)建蛋白質(zhì)生物合成的翻譯調(diào)控元件，如：SD序列、mRNA非編碼區(qū)、密碼子等——分子生物學(xué)原理（4）基因工程菌（微型生物反應(yīng)器）的增殖及穩(wěn)定生產(chǎn)——生化工程學(xué)原理第二章基因工程的基本原理基因工程的支撐技術(shù)（1）核酸凝膠電泳技術(shù)（2）核酸分子雜交技術(shù)（3）細(xì)菌轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染技術(shù)（4）DNA序列分析技術(shù)（5）寡核苷酸合成技術(shù)（6）基因定點(diǎn)突變技術(shù)（7）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)第二章基因工程的基本原理第三章基因工程所需的基本條件A用于核酸操作的工具酶B用于基因克隆的載體C用于基因轉(zhuǎn)移的受體菌或細(xì)胞第三章基因工程所需的基本條件限制性內(nèi)切酶—主要用于DNA分子的特異切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特異性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸連接酶—用于DNA和RNA的連接核酸末端修飾酶—用于DNA和RNA的末端修飾其它酶類--用于生物細(xì)胞的破壁、轉(zhuǎn)化、核酸純化、檢測等。工具酶及其應(yīng)用第三章基因工程所需的基本條件限制性核酸內(nèi)切酶1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)及其生物功能識別雙鏈DNA分子中的特定序列，并切割DNA雙鏈主要存在于原核細(xì)菌中，幫助細(xì)菌限制外來DNA的入侵。1968年，Smith等人首先從流感嗜血桿菌d株中分離出HindII和HindIII。2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名A工具酶第三章基因工程所需的基本條件3、限制性核酸內(nèi)切酶的類型A工具酶第三章基因工程所需的基本條件4、II型限制性核酸內(nèi)切酶適合用于基因操作，其基本特性：識別雙鏈DNA分子中4-8對堿基的特定序列識大部分酶的切割位點(diǎn)在識別序列內(nèi)部或兩側(cè)識別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型回文結(jié)構(gòu)。A工具酶第三章基因工程所需的基本條件nicknickA工具酶第三章基因工程所需的基本條件nicknickA工具酶第三章基因工程所需的基本條件A工具酶第三章基因工程所需的基本條件DNA連接酶DNA連接酶的基本性質(zhì)：（1）修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵A工具酶第三章基因工程所需的基本條件（2）修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵A工具酶第三章基因工程所需的基本條件（3）連接多個(gè)平頭雙鏈DNA分子A工具酶第三章基因工程所需的基本條件DNA聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶I基本性質(zhì)：（1）5’→3’的DNA聚合酶活性（2）5’→3’的核酸外切酶活性（3）3’→5’的核酸外切酶活性用途：制備32P標(biāo)記的探針。A工具酶第三章基因工程所需的基本條件2、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）

基本性質(zhì)：大腸桿菌DNA聚合酶I經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理，獲得N端三分之二的大肽段，即為Klenow酶。Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性?；居猛荆貉a(bǔ)平由核酸內(nèi)切酶產(chǎn)生的5’粘性末端。A工具酶第三章基因工程所需的基本條件3、依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以RNA為模板聚合cDNA鏈A工具酶第三章基因工程所需的基本條件核酸酶1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）2、雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶III（ExoIII）大腸桿菌的核酸外切酶III特異性地從3‘端外切A工具酶第三章基因工程所需的基本條件3、雙鏈核酸外切酶：λ核酸外切酶（λExo）特異性地從5‘端外切4、單鏈核酸內(nèi)切酶：S1核酸酶：內(nèi)切單鏈DNA或RNAA工具酶第三章基因工程所需的基本條件其中又以Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體最為重要。漂洗后將非特異結(jié)合的探針去掉。20世紀(jì)摩爾根果蠅雜交實(shí)驗(yàn)基因基因?qū)W1、單鏈核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）平末端DNA片段加接頭值得警惕的是受傷的植物組織有時(shí)能產(chǎn)生冠癭堿，所以可以檢測到該化合物，即所謂本底。cDNA文庫的構(gòu)建過程因此作對照樣的分析是重要的。目前常用的人造染色體載體包括：它是由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)建而成。－解決了遺傳機(jī)制問題2）Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）第二節(jié)重組載體的構(gòu)建及細(xì)菌轉(zhuǎn)化2、限制性核酸內(nèi)切酶的命名用酚、酚/氯仿/異戊醇處理去除上2、目的基因與載體的連接第五章基因克隆的策略核酸修飾酶1、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（TdT）：不需要模板的DNA聚合酶，隨機(jī)摻入dNTPsA工具酶第三章基因工程所需的基本條件（不論是選擇標(biāo)記基因還是篩選標(biāo)記基因，后者亦稱報(bào)告基因）都必須具備以下四個(gè)條件：①編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；大腸桿菌作為寄主進(jìn)行DNA克隆的實(shí)驗(yàn)方案3’AAAAAAAA②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；第二章基因工程的基本原理它是由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)建而成。第四章重組DNA技術(shù)的操作過程因此作對照樣的分析是重要的。第三章基因工程所需的基本條件Klenow酶仍擁有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核核酸外切酶活性，但失去了5’→3’的核酸外切酶活性。將上述菌液在冰浴5分鐘,然后在4℃,4000rpm離心10分鐘;（2）修復(fù)與RNA鏈結(jié)合的DNA鏈上缺口處的磷酸二酯鍵用于基因工程的載體第三章基因工程所需的基本條件載體的功能及特征1、載體的功能（1）運(yùn)送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（2）為外源基因提供復(fù)制能力或整合能力（3）為外源基因的擴(kuò)增或表達(dá)提供必要的條件2、載體應(yīng)具備的條件（1）具有針對受體細(xì)胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）（2）具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)（3）具有較高的外源DNA的載裝能力（4）具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點(diǎn)（5）具有合適的篩選標(biāo)記B載體第三章基因工程所需的基本條件質(zhì)粒B載體第三章基因工程所需的基本條件人造染色體DNA載體人類、動(dòng)物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數(shù)百甚至上千kb的DNA片段，此時(shí)考斯質(zhì)粒和噬菌體載體的裝載量也遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要。將細(xì)菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當(dāng)大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。目前常用的人造染色體載體包括：細(xì)菌人造染色體（BAC）；酵母人造染色體（YAC）。B載體第三章基因工程所需的基本條件細(xì)菌人造染色體（BacterialArtificialChromosomesBAC）細(xì)菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50-300kb之間。主要適用于克隆大型基因簇（genecluster）結(jié)構(gòu)和構(gòu)建動(dòng)植物基因文庫。酵母人造染色體（YeastArtificialChromosomesYAC）B載體第三章基因工程所需的基本條件B載體P1噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的示意圖pAd10sacBⅡScaI+BamHI長臂+短臂加入外源DNA片段重組DNA分子離體包裝感染宿主細(xì)胞第三章基因工程所需的基本條件B載體植物克隆載體

第三章基因工程所需的基本條件第三章基因工程所需的基本條件基因工程的基本步驟基因分離酶切載體酶切基因和載體連接導(dǎo)入細(xì)菌重組質(zhì)粒繁殖重組克隆的選擇序列分析和基因表達(dá)等研究導(dǎo)入植物細(xì)胞第四章重組DNA技術(shù)的操作過程第五章基因克隆的策略引言第一節(jié)目的基因的獲得第二節(jié)重組體的構(gòu)建及細(xì)菌轉(zhuǎn)化第三節(jié)重組克隆的篩選和鑒定引言基因克隆的本質(zhì)是把某一目標(biāo)DNA片段通過無性的方式進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)，而這一過程往往是通過載體和寄主細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。一般而言，基因克隆包括四部分工作：1、目標(biāo)DNA片段的獲得；2、克隆載體的構(gòu)建；3、寄主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；4、重組體克隆的選擇和鑒定。

目前，以大腸桿菌為寄主，以質(zhì)粒和噬菌體等為載體的基因克隆體系已經(jīng)相當(dāng)?shù)某墒?，本章將以這種克隆模式為主體對基因克隆的策略展開討論和分析。大腸桿菌作為寄主進(jìn)行DNA克隆的實(shí)驗(yàn)方案DNA片段的獲得載體構(gòu)建細(xì)菌轉(zhuǎn)化重組體的鑒定限制性內(nèi)切酶消化機(jī)械切割雙鏈cDNA的合成化學(xué)法直接合成同聚物加尾粘性末端連接平末端連接加接頭造成粘性末端重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體外包裝進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)表型鑒定核酸雜交免疫學(xué)分析酶切鑒定第一節(jié)目的DNA片段的獲得1、化學(xué)法直接合成基因2、從基因組文庫中釣取目的基因3、從cDNA文庫中釣取目的基因4、通過PCR直接擴(kuò)增出目的基因1、化學(xué)法直接合成基因所謂基因就是具有特定生物學(xué)功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子結(jié)構(gòu)，完全可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人工合成。1977年，K.Itakura利用化學(xué)途徑首次合成了編碼腦激素的基因（生長激素釋放因子基因），并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了成功的表達(dá)。從此，化學(xué)合成基因得到了很大的發(fā)展迅速。早期通過化學(xué)合成的部分基因基因人胰島素轉(zhuǎn)運(yùn)RNA-干擾素腸促胰液肽尿抑胃激素-干擾素大?。╞p）12654281162453合成年代197819791981198219821984基因視紫紅質(zhì)前腦菲肽ATP酶溶菌酶RNA酶T1RNA酶Ａ大小（bp）105777170385324375合成年代1985198519851985198619872、從基因組文庫中釣取基因文庫（genelibrary）是指匯集了某一生物基因組DNA全部序列的重組體DNA群體（轉(zhuǎn)化子群）?；蚪M文庫的大?。磻?yīng)該包含多少個(gè)獨(dú)立的克?。┡c基因組本身的大小和克隆DNA片段的平均大小有關(guān)?；蚪M的大?。╞p）2×106（細(xì)菌）

2×107（真菌）

3×109（動(dòng)物）

理論數(shù)實(shí)際數(shù)理論數(shù)實(shí)際數(shù)理論數(shù)實(shí)際數(shù)克隆片段的平均大?。╞p）5×10340018314000184186000002763110910×10320091920009208300000138155020×1031004581000460315000069077440×103502785002300750003543862、從基因組文庫中釣取因?yàn)榛蚪MDNA片段是隨即克隆的，所以基因組大小除以克隆片段大小得到的只是克隆數(shù)的理論值，從統(tǒng)計(jì)學(xué)的角度分析，從這個(gè)理論克隆數(shù)中克隆到特定基因片段的幾率只有50%。當(dāng)克隆數(shù)增加到這一理論值的2倍時(shí)，克隆到特定DNA片段的幾率就上升到75%。所以為了達(dá)到一種合理的幾率以克隆到目的基因，一個(gè)完整的基因組文庫就必須含有3-10倍于最低重組克隆數(shù)的克隆。1975年，L.Clarke和J.Carbon提出了一個(gè)計(jì)算完全基因組文庫所需實(shí)際克隆數(shù)的公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)。其中，N代表實(shí)際克隆數(shù)；p代表在重組群體中出現(xiàn)特定基因的幾率（一般的期望值都為99%）；f代表限制性片段的平均大小與相應(yīng)生物體基因組大小的比值。2、從基因組文庫中釣取目的基因1981年Ish-Horowics和Burke設(shè)計(jì)的特殊的基因組克隆方案，選用MboI或Sau3A進(jìn)行基因組DNA的酶切。不僅是因?yàn)樗鼈兪?堿基識別位點(diǎn)的酶，而且它們和BamHI是同尾酶。cosHindIIIBamHISalISalIHindIII磷酸化酶SalIBamHIBamHIHindIIIBamHIBamHISalIHindIIISau3A磷酸化酶32-47kb3、從cDNA文庫中釣取目的基因從真核生物基因組文庫中直接分離到目的基因十分困難，這主要是因?yàn)椋赫婧松锏幕蚪M太大，而其中非編碼區(qū)占的比例很大；另外，真核基因大都有很大的內(nèi)含子，很難從基因組文庫中直接分離到目的基因。

克隆真核生物的基因往往是從cDNA文庫的建立開始的。主要步驟包括：總RNA的提取和純化；cDNA的合成；cDNA文庫的構(gòu)建。A.文庫的構(gòu)建5’TTTTTTTTTDNA聚合酶I3、從cDNA文庫中釣取目的基因3’AAAAAAAAAAAAAAAA5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA多聚T引物反轉(zhuǎn)錄酶AAAAAAAATTTTTTTTT堿降解RNAS1核酸酶加接頭插入載體并導(dǎo)入寄主細(xì)胞重組克隆cDNA文庫的構(gòu)建過程A.文庫的構(gòu)建A.文庫的構(gòu)建

構(gòu)建好文庫后就需要從眾多的克隆中篩選出含有目的DNA片段的克隆,這時(shí)一般要用到菌落原位雜交技術(shù).如果兩條同原性很高的DNA序列解鏈后混合,當(dāng)條件恢復(fù)時(shí)來源于不同的DNA的單鏈間可以通過堿基互補(bǔ)而發(fā)生緊密結(jié)合（雜交）。所以我們可以將某種已知的DNA序列制備成探針（Probe），即將DNA序列用同位素或地高辛標(biāo)記，這樣就可以同過探針的雜交來篩選出含有特定DNA序列的克隆。用同位素標(biāo)記后可以通過X-光片的感光來探測到有雜交信號的克隆，用地高辛標(biāo)記后可以通過結(jié)合在抗地高辛抗體上的堿性磷酸酶與顯色底物的反應(yīng)直接觀察到發(fā)生了雜交的克隆（對應(yīng)位置顯為紫色）。B.克隆的篩選B.克隆的篩選將克隆轉(zhuǎn)移到一張硝酸纖維素膜或是尼龍膜上。用堿處理使的細(xì)胞中的DNA釋放出來并且發(fā)生解鏈。然后通過烘烤或紫外線照射將DNA固定在膜上。

菌落原位雜交的基本流程是：B.克隆的篩選將轉(zhuǎn)好的膜在含有探針的雜交液中雜交，使得探針與目標(biāo)DNA緊密結(jié)合。漂洗后將非特異結(jié)合的探針去掉。探針為地高辛標(biāo)記時(shí)，可以通過抗體和地高辛的二次雜交和顯色反應(yīng)在含有特定DNA片段的克隆對應(yīng)位置出現(xiàn)紫色印記。如果探針為同位素標(biāo)記時(shí)，可以通過放射自顯影使得X-光片感光而在相應(yīng)位置出現(xiàn)感光信號。C.目標(biāo)DNA片段的獲得一般來說將篩選到的克隆提取其中質(zhì)粒DNA，通過酶切就可以獲得所要的目標(biāo)DNA片段。但是，有時(shí)克隆到的片段還是比較大，為了進(jìn)一步獲得更精確的DNA片段，我們還要進(jìn)一步的DNA雜交。比如，我們可以將克隆到的DNA片段用某一種或幾中限制性內(nèi)切酶消化，再通過電泳將不同分子的DNA分開，然后通過毛細(xì)管法將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，最后用探針雜交以確定含有特定片段的目的DNA片段。4、通過PCR直接擴(kuò)增出目的基因如果已經(jīng)知道了某一基因家族中某一成員的序列，則可以根據(jù)該家族基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物直接從該生物基因組DNA中擴(kuò)增獲得該基因的特定區(qū)域，甚至是全基因。如果該基因很大是，可以分段進(jìn)行克隆，然后再將獲得的片段連接起來，最終得到目的基因的全序列。第二節(jié)重組體的構(gòu)建及細(xì)菌轉(zhuǎn)化1、載體的選擇和分離2、目的基因與載體的連接3、重組體向寄主細(xì)胞的導(dǎo)入質(zhì)粒DNA的分離方法很多，但其中共同的步驟是：用溶菌酶處理含有載體的寄主細(xì)胞培養(yǎng)物，以破壞細(xì)胞壁；加入SDS（sodiumdodecylsulfate,十二烷基硫酸鈉）之類的去污劑使寄主細(xì)胞發(fā)生溫和的溶菌作用。這時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的環(huán)狀質(zhì)粒DNA、多聚核糖體、可溶性蛋白質(zhì)等生物大分子放出來，而核染色體仍然附著在細(xì)胞的碎片上。通過離心將細(xì)胞碎片及附著于其上的染色體DNA等物質(zhì)去除，這時(shí)質(zhì)粒DNA分布在上清液中。e.用酚、酚/氯仿/異戊醇處理去除上清液中的蛋白質(zhì)，最終獲得質(zhì)粒。1、載體的選擇和分離互補(bǔ)粘性末端分子間的連接用同一可產(chǎn)生粘性末端的限制性內(nèi)切酶去切割外源DNA分子和載體時(shí)，所產(chǎn)生的粘末端DNA分子間很容易進(jìn)行連接。當(dāng)然，通過同尾酶切割后的DNA片段也具有這種特性。除了盡量選用粘性末端連接外，構(gòu)建載體還應(yīng)注意：實(shí)驗(yàn)步驟要盡量簡單易行，并設(shè)法提高連接的效率（如防止載體的自連）；連接到載體上的外源片段應(yīng)該能重新切割下來，以便于回收克隆的DNA片段。如果是要求實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的序列，還要注意轉(zhuǎn)錄和翻譯的密碼子結(jié)構(gòu)的正確性。要注意插入片段的方向性。2、目的基因與載體的連接載體自連或產(chǎn)生二具體等2、目的基因與載體的連接POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH連接酶連接酶連接酶堿性磷酸酶2Pi寄主修復(fù)缺口載體自連或產(chǎn)生二具體等載體去磷防止連接反應(yīng)中的載體自連外源DNA片段的定向插入當(dāng)兩個(gè)末端具有相同得粘性末端的DNA分子或是平末端的DNA分子插入到載體中時(shí)，會出現(xiàn)正向和反向插入兩種情況。一方面，我們可以通過對重組質(zhì)粒的酶切鑒定來選擇正向插入的克隆或反向插入的克??；另一方面，通過選用兩種合適的限制性內(nèi)切酶分別對載體和外源DNA進(jìn)行切割也可以實(shí)現(xiàn)外源DNA分子的定向插入。2、目的基因與載體的連接HindIIIBamHIHindIIIBamHIHindIIIBamHI平末端DNA片段加接頭在實(shí)際操作中，往往會出現(xiàn)找不到合適酶切位點(diǎn)，或是所產(chǎn)生的外源DNA只能是平末端的情況，這時(shí)就需要對平末端的DNA分子進(jìn)行連接。對于這種連接實(shí)驗(yàn)，我們可以采用加接頭法，也可以采用末端轉(zhuǎn)移酶加尾法，當(dāng)然用平末端直接連接也是可以的，只是連接效率要低得多。CCGAATTCGGGGCTTAAGCC磷酸化CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHOHPPPOHOHT4連接酶CCGAATTCGGGGCTTAAGCCPOHPOHEcoRICCGAATTCGGGGCTTAAGCCAATTCGGGCCCCGGGCTTAA2、目的基因與載體的連接3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA連接酶平末端DNA片段末端加尾法連接2、目的基因與載體的連接3、重組載體向寄主細(xì)胞的導(dǎo)入

重組DNA分子構(gòu)建好后必須轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能得到擴(kuò)增和表達(dá)。將普通的質(zhì)粒分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化（tranformation）;將具有感染能力的噬菌體DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染（transfection）；而噬菌體主動(dòng)將其DNA注入受體細(xì)胞得過程稱為感染（infection）.1970年，Mandel和Higa等發(fā)現(xiàn)，用CaCl2溶液處理過的大腸桿菌細(xì)胞比較容易獲得噬菌體的DNA；1972年，Cohen等也發(fā)現(xiàn)用CaCl2溶液處理過的大腸桿菌能被環(huán)狀的質(zhì)粒DNA分子所轉(zhuǎn)化。這種經(jīng)過處理能夠接受外源DNA的細(xì)胞成為感受態(tài)細(xì)胞（copetentcell）.3、重組體向寄主細(xì)胞的導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備在不含抗生素的LB平板上涂布大腸桿菌DH5α，于37℃培養(yǎng)過夜(16-20h)；挑一個(gè)單菌落接種于25mL無菌的LB培養(yǎng)液中，37℃中速震蕩培養(yǎng)3h；將上述菌液在冰浴5分鐘,然后在4℃,4000rpm離心10分鐘;將細(xì)菌沉淀用5mL預(yù)冷的CaCl2（0.1M）重懸，冰浴一會后于4℃4000rpm離心10分鐘；將細(xì)菌沉淀用1mL預(yù)冷的CaCl2（0.1M）重懸，取200uL用于細(xì)菌轉(zhuǎn)化,其余菌液加入20%的無菌甘油,搖勻后于-20℃保存?zhèn)溆?質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌的程序3、重組體向寄主細(xì)胞的導(dǎo)入用冷的無菌槍頭吸取200uL感受態(tài)細(xì)胞到一新的離心管中,加入質(zhì)粒DNA后冰浴30分鐘；立即將轉(zhuǎn)化用的離心管置入42℃水浴中靜置90秒；迅速將離心管移入冰水混合物中冰浴1-2分鐘;加入800uL的LB培養(yǎng)基,混勻后于37℃水浴5分鐘；將離心管側(cè)向固定在搖床上,37℃緩慢震蕩培養(yǎng)45分鐘;于室溫1000rpm離心5分鐘,棄取約800uL的培養(yǎng)液,再將剩余的培養(yǎng)液和細(xì)菌重懸,然后涂布到含有抗生素的LB平板上37℃選擇培養(yǎng)過夜(16h);檢測選擇平板上的抗性菌落,并提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行鑒定.第三節(jié)重組克隆的篩選和鑒定根據(jù)所使用克隆載體的特性不同，重組克隆的篩選方法也多種多樣。比如，用噬菌體DNA作為載體時(shí)就不需要篩選，所有正常的噬菌斑都是重組體；當(dāng)使用pUC系列載體時(shí)，白色菌落一般都是重組體；如果所用的質(zhì)粒并不具備明顯的鑒別特性，那么我們也可以利用DNA的酶切分析進(jìn)行直接鑒定。比如，從平板上隨機(jī)挑選10個(gè)菌落，然后提取其中的質(zhì)粒DNA分子，并對其進(jìn)行酶切分析，同樣可以準(zhǔn)確地選擇得到所要的重組克隆，而且同時(shí)可以鑒定外源片段插入的方向，選擇得到所要的理想克隆。有時(shí)，我們不僅想知道哪些是重組體克隆，而且想知道重組體克隆中哪些是含有某個(gè)基因的克?。ū热缭赾DNA文庫的篩選中，我們就需要選擇到含有目的基因克?。?。這時(shí)我們可以用比較復(fù)雜的核酸雜交或免疫化學(xué)的方法。隨機(jī)挑取提取質(zhì)粒第三節(jié)重組克隆的篩選和鑒定連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化空載體轉(zhuǎn)化酶切質(zhì)粒1.00.53.5kb1234567891011M1.00.50.51.04.03.05.0AA第六章

植物基因工程載體及其構(gòu)建第一節(jié)

植物基因工程載體種類第二節(jié)

根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能第三節(jié)

Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化機(jī)理第四節(jié)

Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建第五節(jié)

常用選擇標(biāo)記和報(bào)告基因植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)l

1.載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體、病毒轉(zhuǎn)化載體）l

2.

DNA直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（原生質(zhì)體、基因槍）l

3.種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（花粉管通道法、生殖細(xì)胞浸泡法、胚囊子房注射法）。載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前植物基因工程中使用最多、機(jī)理最清楚、技術(shù)最成熟的、最重要的一種轉(zhuǎn)化系統(tǒng),其中又以Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體最為重要。第一節(jié)植物基因工程載體種類根據(jù)其功能和構(gòu)建過程，可分為以下種類。（1）目的基因克隆載體：其功能是保存和克隆目的基因。與微生物基因工程相似，通常是由多拷貝的E.Coli小質(zhì)粒為載體。（2）中間克隆載體：是構(gòu)建中間表達(dá)載體的基礎(chǔ)質(zhì)粒。是由大腸桿菌質(zhì)粒插入T-DNA片段、目的基因和標(biāo)記基因等構(gòu)建而成。（3）中間表達(dá)載體：是含有植物特異啟動(dòng)子的中間載體。是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的質(zhì)粒。（4）卸甲載體：是解除武裝的Ti質(zhì)粒或Ri質(zhì)粒，是構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體的受體質(zhì)粒。（5）植物基因轉(zhuǎn)化載體：是最后用于目的基因?qū)酥参锛?xì)胞的載體，亦稱工程載體。它是由中間表達(dá)載體和卸甲載體構(gòu)建而成。雙元載體系統(tǒng)的中間載體與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處是①無同源序列；②具有LB和RB;③無Co1E1復(fù)制點(diǎn)

五、載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記及報(bào)告基因如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個(gè)重要問題?？茖W(xué)家家一直試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個(gè)標(biāo)記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標(biāo)記基因，并已插入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標(biāo)記基因。（不論是選擇標(biāo)記基因還是篩選標(biāo)記基因，后者亦稱報(bào)告基因）都必須具備以下四個(gè)條件：①編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；④檢測容易，并且能定量分析。選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因除具有上述共同之處外，它們在功能和性質(zhì)上還有一定差異。選擇標(biāo)記基因的功能主要是該基因的產(chǎn)物給予植物細(xì)胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞對該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長等，從而將轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇出來，例如，Cat（氯霉抗性基因）。篩選標(biāo)記基因強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識別作用，故稱報(bào)告基因。2．報(bào)告基困的應(yīng)用在理想狀態(tài)下，所有的在含有選擇劑培養(yǎng)條件下再生的植株都是被轉(zhuǎn)化體。不幸的是事情并非盡如人愿。由于種種原因，例如生理抗性的產(chǎn)生，選擇與植物種類的敏感性，無性系的變異性，甚至“逃避者”或漏洞的出現(xiàn)等，都會產(chǎn)生非轉(zhuǎn)化植株的再生。因此，對在選擇劑條件下再生的植株或組織乃至細(xì)胞都要進(jìn)一步的篩選確定其是否屬于真正的基因轉(zhuǎn)化體。這是篩選標(biāo)記基因的第一個(gè)作用。篩選標(biāo)記基因的第二個(gè)功能是在轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中通過瞬時(shí)表達(dá)檢測來確定轉(zhuǎn)化是否成功，或檢測轉(zhuǎn)化的基因是否能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中得到表達(dá)，因此起到報(bào)告的作用，故亦稱之為報(bào)告基因（reportgene）。第三功能是被用于啟動(dòng)子表達(dá)特性的評估和亞細(xì)胞區(qū)問的研究分析等。目前作為篩選標(biāo)記的基因1）冠癭堿opine基因至今廣泛用于轉(zhuǎn)化載體作為篩選標(biāo)記之一是合成冠癭堿基因。各種農(nóng)桿菌菌