第七章生物藥品成份提取純化技術(shù)第1頁(yè)學(xué)習(xí)關(guān)鍵點(diǎn)掌握幾個(gè)基本細(xì)胞破碎操作技術(shù)掌握超濾分離操作技術(shù)掌握幾個(gè)慣用沉淀分離操作技術(shù)掌握離子交換色譜操作技術(shù)第2頁(yè)第一部分必備知識(shí)生物制藥過(guò)程中，產(chǎn)物分離純化有以下特點(diǎn)：1、生物藥品有效成份在生物材料中濃度很低，有只到達(dá)萬(wàn)分之一，甚至百萬(wàn)分之一，所以，分離操作步驟多，不易取得高收率。2、雜質(zhì)含量相對(duì)比較高，雜質(zhì)種類繁多，各種雜質(zhì)形狀、大小、分子量和理化性質(zhì)都各不相同，沒(méi)有固定去除方法;第3頁(yè)3、生產(chǎn)中得到大多數(shù)目標(biāo)藥品都是含有生物活性物質(zhì)，對(duì)熱、酸、堿、重金屬及pH改變和各種理化原因都比較敏感，輕易變性、鈍化或破壞，分離過(guò)程中必須十分小心地保護(hù)這些化合物生理活性；4、生物制藥分離鈍化過(guò)程中，加工條件（溫度、pH、離子強(qiáng)度）對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響較大。第4頁(yè)產(chǎn)物初級(jí)分離階段和純化精制階段分離純化早期，因?yàn)榇制分谐煞輳?fù)雜，目標(biāo)物濃度較低，與目標(biāo)物理化性質(zhì)相同雜質(zhì)多，所以不宜選擇分辨能力較高純化技術(shù)，采取萃取、沉淀、吸附等一些分辨力低方法較為有利。精制階段，可采取高選擇性分離技術(shù)，如各種色譜技術(shù)、超濾技術(shù)等，將目標(biāo)物與雜質(zhì)分開(kāi)，使產(chǎn)物純度到達(dá)要求。第5頁(yè)第二部分操作技術(shù)

第一節(jié)細(xì)胞破碎技術(shù)實(shí)踐中選擇破碎方法標(biāo)準(zhǔn)是：最正確破碎方法與最正確破碎條件相結(jié)合，以到達(dá)高產(chǎn)物釋放率；與后面分離純化相結(jié)合考慮，便于產(chǎn)物提?。坏湍芎?，降低成本。細(xì)胞破碎方法很多，有物理方法、化學(xué)方法、生物方法等。第6頁(yè)一物理方法重復(fù)凍融法：置-15~-20℃冰箱內(nèi)凍結(jié)，再置于室溫下，如此重復(fù)凍融幾次。動(dòng)物性材料急熱驟冷法：投入沸水浴中，在90℃左右?guī)追昼姡R上置于冰浴中快速冷卻。細(xì)菌及病菌材料超聲波破碎法：為預(yù)防有效成份變性，常在冰水或有外部冷卻條件容器中進(jìn)行。微生物材料碾磨法：為提升碾磨效率，常加入細(xì)砂、石英粉或氧化鋁等。適宜試驗(yàn)室使用組織搗碎法：為了預(yù)防發(fā)燒和升溫過(guò)高引發(fā)有效成份變性，通常轉(zhuǎn)10~20s，停10~20s。普通用于動(dòng)物組織、植物肉質(zhì)種子、柔嫩葉芽等第7頁(yè)高壓勻漿破碎法：利用高壓迫使細(xì)胞懸液高速經(jīng)過(guò)針形閥，經(jīng)過(guò)突然減壓和高速?zèng)_擊特制撞擊環(huán)，到達(dá)細(xì)胞破碎目標(biāo)。細(xì)菌和部分酵母菌細(xì)胞高速攪拌珠磨法：將玻璃小珠與細(xì)胞懸液一起高速攪拌，帶動(dòng)玻璃小球撞擊細(xì)胞，使細(xì)胞破碎方法。酵母菌和膠束狀微生物菌體第8頁(yè)二、化學(xué)方法酸堿法：用酸或堿處理微生物細(xì)胞能夠溶解細(xì)胞壁使胞內(nèi)產(chǎn)物溶出。大規(guī)模破碎中可與考慮用堿來(lái)溶解細(xì)胞。表面活性劑處理法：利用表面活性劑處理細(xì)胞，可增大細(xì)胞壁通透性，使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物輕易釋放出來(lái)。三、生物學(xué)方法自溶法：注意水解酶不但能夠使細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破壞，同時(shí)也可能會(huì)把一些需要提取有效成份分解。酶解法：利用酶先將細(xì)胞壁分解，再釋放內(nèi)含物。第9頁(yè)第二節(jié)沉淀分離技術(shù)應(yīng)用分離技術(shù)時(shí)考慮以下幾個(gè)原因采取沉淀技術(shù)對(duì)目標(biāo)物分離有高選擇性；采取分離條件不會(huì)破壞目標(biāo)物結(jié)構(gòu)或活性；加入溶液中沉淀劑輕易取得，在后續(xù)加工中輕易去除；殘留沉淀劑對(duì)人體無(wú)害；沉淀劑對(duì)環(huán)境污染小，易回收。第10頁(yè)一、鹽析沉淀技術(shù)1.鹽析操作最慣用是硫酸銨：價(jià)格廉價(jià)；溶解度大、尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高溶解度；分離效果好；不易引發(fā)變性，有穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶作用；廢液不污染環(huán)境。2.脫鹽操作透析時(shí)，注意預(yù)防透析袋外液體進(jìn)入透析袋，引發(fā)膨脹。為加緊透析速度，應(yīng)不停更換透析液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，為預(yù)防酶或蛋白質(zhì)變性，所以最好在低溫中進(jìn)行。透析慣用于脫除鹽、少許有機(jī)溶劑、生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等。第11頁(yè)二、等電點(diǎn)沉淀技術(shù)蛋白質(zhì)、酶、氨基酸、核酸等都是兩性電解質(zhì)，當(dāng)溶液在某一pH值時(shí)，這些生物大分子所帶正負(fù)電荷相等而呈電中性，此時(shí)溶液pH值稱為等電點(diǎn)。等電點(diǎn)技術(shù)是利用這些生物大分子在其等電點(diǎn)溶液中，溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離方法。三、有機(jī)溶劑沉淀技術(shù)有機(jī)溶劑沉淀技術(shù)時(shí)在含有溶質(zhì)水溶液中加入一定量親水有機(jī)溶劑，降低溶質(zhì)溶解度，使其沉淀析出。四、有機(jī)高聚合物沉淀技術(shù)有機(jī)高聚物沉淀技術(shù)是用有機(jī)高聚物作沉淀劑。第12頁(yè)五、結(jié)晶技術(shù)溶質(zhì)以固體形式從溶液中分出，析出物為無(wú)定形固體時(shí)稱為沉淀技術(shù)，析出物為晶體時(shí)則稱為結(jié)晶技術(shù)；它們共同特征都是溶質(zhì)從液相中析出，形成固相。第13頁(yè)第三節(jié)萃取分離技術(shù)萃取技術(shù)是利用目標(biāo)藥品在互不相溶溶劑之間分配系數(shù)不一樣而得以純化或濃縮技術(shù)。一、溶劑萃取技術(shù)：是利用目標(biāo)物在兩種互不相溶溶液中溶解度不一樣，使其從一個(gè)溶液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)溶液中去，以到達(dá)濃縮和提純目標(biāo)。二、雙水相萃取技術(shù)：將兩種不一樣水溶性高聚物溶液混合，當(dāng)高聚物濃度到達(dá)一定值時(shí)，體系會(huì)自然地分成不相溶兩相，這就是雙水相體系。第14頁(yè)三、超臨界萃取技術(shù)它以超臨界流體作為萃取劑，在超臨界狀態(tài)下，從物料中萃取待分離組分，然后借助壓力、溫度改變使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)則完全或基本析出，從而到達(dá)分離提純目標(biāo)，所以在超臨界流體萃取過(guò)程是由萃取和分離組合而成。最為慣用是CO2：臨界溫度為靠近常溫，適于分離對(duì)熱敏感物質(zhì)；臨界壓力輕易到達(dá)；能夠滲透原料，提取完全；選擇性好；無(wú)毒，不易殘余在提取物中；化學(xué)穩(wěn)定性高；價(jià)格低廉，能夠重復(fù)使用。第15頁(yè)超臨界為超臨界流體，是介于氣液之間一個(gè)既非氣態(tài)又非液態(tài)物態(tài)，這種物質(zhì)只能在其溫度和壓力超出臨界點(diǎn)時(shí)才能存在。超臨界流體密度較大，與液體相仿，而它粘度又較靠近于氣體。所以超臨界流體是一個(gè)十分理想萃取劑。物質(zhì)是以氣、液和固3種形式存在，在不一樣壓力和溫度下能夠相轉(zhuǎn)換。在溫度高于某一數(shù)值時(shí)，任何大壓力均不能使該純物質(zhì)由氣相轉(zhuǎn)化為液相，此時(shí)溫度即被稱之為臨界溫度Tc；而在臨界溫度下，氣體能被液化最低壓力稱為臨界壓力Pc。當(dāng)物質(zhì)所處溫度高于臨界溫度，壓力大于臨界壓力時(shí)，該物質(zhì)處于超臨界狀態(tài)。在壓溫圖中，高于臨界溫度和臨界壓力區(qū)域就稱為超臨界區(qū)，假如流體被加熱或被壓縮至其臨界溫度（Tc）和臨界壓力（Pc）以上狀態(tài)時(shí)，向該狀態(tài)氣體加壓，氣體不會(huì)液化，只是密度增大，含有類似液體性質(zhì)，同時(shí)還保留有氣體性能，這種狀態(tài)流體稱為超臨界流體。第16頁(yè)超臨界萃取技術(shù)原理超臨界CO2流體萃?。⊿FE）分離過(guò)程原理是利用超臨界流體溶解能力與其密度關(guān)系，即利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力影響而進(jìn)行。在超臨界狀態(tài)下，將超臨界流體與待分離物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小成份依次萃取出來(lái)。當(dāng)然，對(duì)應(yīng)各壓力范圍所得到萃取物不可能是單一，但能夠控制條件得到最正確百分比混合成份，然后借助減壓、升溫方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)則完全或基本析出，從而到達(dá)分離提純目標(biāo)，所以超臨界CO2流體萃取過(guò)程是由萃取和分離過(guò)程組合而成。第17頁(yè)第四節(jié)過(guò)濾與超出濾技術(shù)超濾技術(shù)是一個(gè)膜分離技術(shù)。膜分離技術(shù)是在一定壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑特制薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過(guò)，留在膜一邊，從而使大分子物質(zhì)得到部分純化技術(shù)。超濾技術(shù)分為：微孔過(guò)濾、超濾和反滲透三種。第18頁(yè)一、過(guò)濾技術(shù)過(guò)濾技術(shù)是指在外力作用下，懸浮液中液體經(jīng)過(guò)多孔介質(zhì)孔道而固體顆粒被截留下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)固、液分離技術(shù)。過(guò)濾操作所處理懸浮液稱為濾漿，所用多孔物質(zhì)稱為過(guò)濾介質(zhì)，經(jīng)過(guò)介質(zhì)孔道液體稱為濾液，被截留物質(zhì)稱為濾餅或?yàn)V渣。第19頁(yè)二、超濾技術(shù)超濾是一個(gè)加壓膜分離技術(shù)，是流體在一定壓力下，經(jīng)過(guò)特制一定孔徑薄膜時(shí)，溶劑、無(wú)機(jī)鹽和小分子溶質(zhì)能夠經(jīng)過(guò)，而大分子物質(zhì)則被截留，使其在原液中濃度逐步提升，從而實(shí)現(xiàn)了大小分子間分離、濃縮和純化目標(biāo)。超濾技術(shù)含有以下優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單；速度快，一次處理可完成濃縮和精制工作；操作條件溫和；回收率高；對(duì)被處理物理影響小等。第20頁(yè)第五節(jié)

泡沫分離技術(shù)泡沫分離技術(shù)是依據(jù)表面吸附原理，借助鼓泡使溶液中目標(biāo)物聚集在氣-液界面，隨氣泡上浮至溶液主體上方，形成泡沫層，將泡沫和液相主體分開(kāi)，從而濃縮目標(biāo)成份分離技術(shù)。泡沫分離技術(shù)尤其適合于低含量產(chǎn)品，含有分辨率高、富集率高、運(yùn)行成本低、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。第21頁(yè)第六節(jié)干燥技術(shù)干燥是將潮濕固體、半固體或濃縮液中水分蒸發(fā)除去過(guò)程，通常是生物活性藥品成品化前最終加工過(guò)程，所以操作好壞直接影響到產(chǎn)品質(zhì)量。一、噴霧干燥技術(shù)是將一定濃度液態(tài)物料噴射成極細(xì)霧狀液滴，并與一定流速干燥介質(zhì)充分接觸，在很短時(shí)間內(nèi)霧滴中水分揮發(fā)，得到粉狀或顆粒制品。其特點(diǎn)是：干燥時(shí)間極短，防止產(chǎn)品活性破壞，適合用于熱敏性物料干燥；產(chǎn)品質(zhì)量好，易溶解；操作控制方便，適于連續(xù)化、自動(dòng)化、大型化生產(chǎn)；在密閉系統(tǒng)中進(jìn)行干燥，不受污染，產(chǎn)品衛(wèi)生情況好。第22頁(yè)二、真空冷凍干燥真空冷凍干燥技術(shù)簡(jiǎn)稱凍干技術(shù)，此技術(shù)是將待干燥物料在低溫下冷凍，使其所含水分結(jié)冰，然后在真空環(huán)境下加熱，讓水分由固態(tài)升華為氣態(tài)并移走，使物料得以干燥。（1）預(yù)凍過(guò)程：速率必須適當(dāng)。（2）升華過(guò)程：物品在真空條件下吸熱，冰晶就會(huì)升華成水蒸氣而從表面逸出。（3）干燥過(guò)程：干燥可降低制品凍干后回潮。第23頁(yè)第七節(jié)色譜分離技術(shù)第24頁(yè)文件綜述目標(biāo)物研究進(jìn)展生物藥品制備方案設(shè)計(jì)線路介紹研究目標(biāo)材料選擇細(xì)胞破碎建立分析方法預(yù)備試驗(yàn)固液分離濃縮色譜分離脫鹽凍干產(chǎn)品分析沉降離心過(guò)濾機(jī)械法、物理法化學(xué)法、生物法沉淀、吸附、超濾離心濃縮吸附色譜離子交換色譜凝膠色譜親和色譜疏水色譜逆流色譜提取溶劑萃取水相萃取溶解性能溶液穩(wěn)定性固體穩(wěn)定性物理性質(zhì)化學(xué)性質(zhì)生物活性、酶活力、比活組成和純度分析分子量、pI其它理化性質(zhì)分析透析、凝膠過(guò)濾冷凍干燥第25頁(yè)

一、原材料選擇標(biāo)準(zhǔn)：

原料有效成份含量高、起源豐富、產(chǎn)地較近、雜質(zhì)含量少、成本低。

生物藥品提取、分離、純化技術(shù)基礎(chǔ)第26頁(yè)

生物材料選擇：

1．生物活性物質(zhì)存在部位：胞內(nèi)、胞外、胞漿、質(zhì)膜、器膜、周質(zhì)

2．生物材料采集與質(zhì)控（1）品種判定；（2）預(yù)防污染與感染；（3）選擇富集目標(biāo)物材料；（4）冷凍保留

第27頁(yè)第28頁(yè)第29頁(yè)第30頁(yè)第31頁(yè)第32頁(yè)

二、生物藥品慣用提取方法與優(yōu)化

（一）幾個(gè)慣用提取方法

1．酸、堿、鹽水溶液提取方法

2．表面活性劑提取方法與反膠束提取方法

3．有機(jī)溶劑提取

4.雙水相萃取法

5．超臨界萃取法

第33頁(yè)（二）提取方法與優(yōu)化

1.溶劑選擇

2.選擇添加劑①保護(hù)劑；②酶抑制劑

3.提取條件①溫度；②pH；③鹽；④表面活性劑第34頁(yè)三．濃縮與干燥1.濃縮方法：①鹽析；②有機(jī)溶劑沉淀；③高分子脫水④超濾；⑤真空濃縮或薄膜濃縮；

第35頁(yè)第36頁(yè)2.干燥：①低溫真空干燥；②噴霧干燥；③冷凍干燥

第37頁(yè)第38頁(yè)第39頁(yè)四、分離純化1.生化制藥工藝中分離純化特點(diǎn):

(1)生物材料組成復(fù)雜

(2)目標(biāo)物含量低

(3)易變性、失活

(4)分離方法有很大經(jīng)驗(yàn)成份

(5)步驟多，逐層分離

(6)產(chǎn)品驗(yàn)證與化學(xué)上純度概念不完全相同第40頁(yè)2.分離純化原理

P162頁(yè)

(1)依據(jù)分子形狀與分子大小

(2)依據(jù)電荷差異

(3)依據(jù)分子極性與溶解度大小

(4)依據(jù)吸附特征

(5)依據(jù)生物配基特征第41頁(yè)3.選擇標(biāo)準(zhǔn)（1）粗品分離：大處理量,相對(duì)低分辨率鹽析，分級(jí)沉淀，萃取，超濾（2）精制：高分辨率各種色譜層析法,親和層析，HPLC，F(xiàn)PLC，電泳或等電聚焦第42頁(yè)五、生物制藥下游技術(shù)特點(diǎn)1、培養(yǎng)液（或發(fā)酵液）中所含欲分離生物藥品濃度很低，雜質(zhì)含量高，需進(jìn)行多步分離操作。2、穩(wěn)定性較差，加熱、pH、有機(jī)溶劑等可引發(fā)失活或分解。3、生物變異性大4、注意生物安全問(wèn)題第43頁(yè)生物藥品分離純化標(biāo)準(zhǔn)第44頁(yè)在分離純化設(shè)計(jì)中需要考慮原因：1、抑制宿主細(xì)胞或分泌產(chǎn)物中對(duì)應(yīng)酶活性，預(yù)防其消化降解待提純產(chǎn)物。2、使目標(biāo)產(chǎn)物成份有較高純度，降低對(duì)人體有害非目標(biāo)成份含量。3、確保生物藥品安全、有效。注意每個(gè)生產(chǎn)步驟時(shí)效性，對(duì)每一步驟質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。4、盡可能優(yōu)化分離純化工藝，降低分離步驟，降低生產(chǎn)成本。第45頁(yè)生物藥品分離純化1、溶劑與試劑2、pH3、添加物4、分離純化前準(zhǔn)備第46頁(yè)分離純化基本工藝流程第47頁(yè)預(yù)處理→細(xì)胞破碎與碎片處理→可溶性雜質(zhì)去除→分離純化第48頁(yè)分離純化單元操作特點(diǎn)1、各種技術(shù)相互交叉，新型分離純化方法不停涌現(xiàn)2、重視新材料研制3、分離純化設(shè)備推陳出新，發(fā)展快速第49頁(yè)分離純化方法選擇1、初步分離純化方法選擇2、各種分離純化方法交替使用第50頁(yè)第四部分知識(shí)與能力測(cè)試1、組織搗碎法怎樣預(yù)防因發(fā)燒和升溫過(guò)高引發(fā)有效成份變性？答：為了預(yù)防發(fā)燒和升溫過(guò)高引發(fā)有效成份變性，通常轉(zhuǎn)10~20s，停10~20s。2、選擇細(xì)胞破碎方法標(biāo)準(zhǔn)是什么？答：最正確破碎方法與最正確破碎條件相結(jié)合，以到達(dá)高產(chǎn)物釋放率；與后面分離純化相結(jié)合考慮，便于產(chǎn)物提??；低能耗，降低成本。細(xì)胞破碎方法很多，有物理方法、化學(xué)方法、生物方法等。第51頁(yè)3、板框過(guò)濾操作由哪幾部分組成？答：板框過(guò)濾機(jī)操作是間歇，每個(gè)操作循環(huán)由裝合、過(guò)濾、洗滌、卸渣、整理五個(gè)階段組成。4、為何進(jìn)行超濾前料液要進(jìn)行預(yù)處理？超濾膜怎樣清洗？答：超濾法中待處理溶液假如含有較