第八章

酶免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)三大經(jīng)典標記技術(shù)三大經(jīng)典標記技術(shù)

第一節(jié)酶免疫技術(shù)的特點

主要試劑:

酶標記的抗體或抗原酶標物特點：

免疫學(xué)活性酶對底物的催化活性抗原抗體反應(yīng)的特異性+酶高效催化反應(yīng)的專一性原理及特點特點：靈敏度高、特異性強、準確性好酶標記試劑能夠較長時間保持穩(wěn)定操作簡便、對環(huán)境沒有污染。易與其它技術(shù)偶聯(lián)衍生出適用范圍更廣的新方法。原理：酶標抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)酶對底物的顯色反應(yīng)對抗原或抗體進行定位、定性或定量的測定分析

原理及特點標記酶的要求：

活性高性質(zhì)穩(wěn)定專一性強酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量方法敏感，重復(fù)性好，簡單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉

一、酶和酶作用底物辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關(guān)輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比，大于3.0RZ值（純度）與酶活性無關(guān)，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應(yīng)用最為廣泛的標記用酶常用酶酶和酶作用底物堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測定

常用酶酶和酶作用底物HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP供氫體DH2習(xí)慣上被稱為底物，底物有多種

H2O2為受氫體，HRP對受氫體的專一性很高

常用底物酶和酶作用底物HRP的常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯(lián)苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽

ABTS常用底物酶和酶作用底物OPD反應(yīng)后顯橙黃色，加酸終止反應(yīng)后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩(wěn)定，致癌性。TMB反應(yīng)后顯藍色，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)辄S色,測定波長450nm，穩(wěn)定，無致癌性，ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。

HRP的常見底物

酶和酶作用底物AP的底物

β-Gal的底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP

）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經(jīng)AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

酶作用后，生成高強度熒光物，用熒光計測量。常用底物酶和酶作用底物酶免疫技術(shù)的核心組成部分

酶結(jié)合物（conjugate）酶標記物

通過化學(xué)反應(yīng)或免疫學(xué)反應(yīng)，讓酶與抗體或抗原形成的結(jié)合物

二、酶標記抗體或抗原制備方法過碘酸鈉法（直接法）多糖羥基氧化醛基+蛋白游離氨基常用于HRP標記抗體或抗原

戊二醛交聯(lián)法(間接法)酶標記抗體或抗原戊二醛交聯(lián)法戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質(zhì)分子中的氨基結(jié)合。該法有一步法和二步法。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質(zhì)量較均一。

酶標記抗體或抗原純化及鑒定標記完成后應(yīng)除去反應(yīng)液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度

常用的純化方法：1.葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化2.50%飽和硫酸銨沉淀提純酶標記抗體或抗原固相抗體或抗原是非均相酶免技術(shù)中將游離和結(jié)合的酶標記物迅速分離的最常用方法

固相抗體或抗原就是把抗體或抗原結(jié)合到固相載體的表面

三、固相載體要求

結(jié)合抗體或抗原的容量大抗體或抗原牢固地固定在其表面不影響免疫反應(yīng)性利于反應(yīng)充分進行固相方法簡便易行，快速經(jīng)濟種類塑料制品

微顆粒膜載體

固相載體微量反應(yīng)板固相載體可作ELISA中載體的物質(zhì)很多，最常用的是聚苯乙烯。ELISA載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。最常用的載體為微量反應(yīng)板，專用于ELISA測定的產(chǎn)品也稱為ELISA板，國際通用的標準板形是8×12的96孔式。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標抗人IgG抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻?yīng)條件，使各讀數(shù)在0.8左右。計算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于10％。96孔反應(yīng)板將抗原或抗體結(jié)合于固相載體用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相載體表面未結(jié)合的位點，消除非特異性吸附包被coating封閉blocking包被與封閉將抗原或抗體固相化的過程稱為包被（coating）。如以聚苯乙烯ELISA板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液中，加于ELISA板孔中在4℃過夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有可能被此蛋白質(zhì)不完全覆蓋，其后加入的血清標本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，最后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用1％～5％牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。

第二節(jié)酶免疫技術(shù)分類

酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相（F/B不分離）非均相固相酶免疫測定（最常用）液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位

液體標本中抗原或抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定酶標記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標記酶的活性會發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理一、均相酶免疫測定最具代表性的兩種技術(shù)酶放大免疫測定技術(shù)EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫測定EMIT示意圖(測標本小分子抗原)色與量成正比CEDIA示意圖(標本抗原與酶標抗原競爭)成正比分類：液相酶免疫測定固相酶免疫測定以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是目前最為常用的固相酶免疫測定與均相不同之處需分離游離與結(jié)合的酶標記物二、非均相酶免疫測定

第三節(jié)酶聯(lián)免疫吸附試驗

底物顯色定性或定量的分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離1234一、基本原理ELISA試劑盒預(yù)包被抗體酶標反應(yīng)板系列標準品抗原酶標抗體（如抗HBsAg-HRP）質(zhì)控血清顯色底物終止液濃縮洗液固相的抗原或抗體

酶標記物（酶結(jié)合物）

酶反應(yīng)的底物

三個必要試劑

二、方法類型及反應(yīng)原理雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色應(yīng)用：

二價或二價以上的較大分子抗原測定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測抗原的方法E固相抗體標本（含抗原）酶標抗體EE底物雙抗體夾心法檢測抗原1、已知抗體包3、加酶標抗體4、加酶作用的底物2、加待檢物4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包2、加待檢物無抗3、加酶標抗體+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY競爭法

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結(jié)合。加底物顯色。

應(yīng)用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）ELISA檢測抗原的方法洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標抗原競爭與抗體結(jié)合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標抗原，酶標抗原與抗體結(jié)合YE間接法方法

用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優(yōu)點一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體應(yīng)用

常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定ELISA檢測抗體的方法1、已知抗原吸2、加待檢物3、加酶標抗Ig4、加酶作用的底物1、已知抗體吸2、加待檢物3、加酶標的抗Ig4、加酶作用的底物洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應(yīng)用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體的方法競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法

應(yīng)用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測ELISA檢測抗體的方法捕獲法

應(yīng)用：

病原體急性感染診斷中的IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測抗體的方法捕獲法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕獲待測標本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標記特異性抗原的抗體底物顯色

洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，與特異性抗體結(jié)合4、加酶標抗體與特異性抗原結(jié)合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結(jié)合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結(jié)合4、加酶標抗體無抗原結(jié)合，加底物不顯色注意事項:(補充）(一)加樣在ELISA中除了包被外，一般需進行4-5加樣。在定性測定中有時不強調(diào)加樣量的準確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時應(yīng)該使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應(yīng)力求準確。標本和結(jié)合物的稀釋液應(yīng)按規(guī)定配制。加樣時應(yīng)將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。（二）保溫在ELISA中一般有二次抗原抗體反應(yīng)，即加標本后和加結(jié)合物后，此時反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。濕盒應(yīng)該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物后，反應(yīng)的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于20℃，ELISA板可避光放在實驗臺上，不時觀察，待對照管顯色適當(dāng)時，已夠時間即可終止酶反應(yīng)。（三）洗滌洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)聚，但卻是決定實驗成敗的關(guān)鍵。洗滌的目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。在標本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結(jié)合的作用。ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；②將洗滌液注滿板孔；③放置2min，略作搖動；④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為3～4次，有時甚至需洗5～6次。（四）比色如陰性對照顏色極淺，在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定結(jié)果，準確性決定于ELISA板底的平整與透明度和比色計的質(zhì)量。定量用酶標儀

第四