分子生物學(xué)常用技術(shù)第15章分子生物學(xué)常用技術(shù)分子生物學(xué)常用技術(shù)Ⅰ.核酸分子雜交（DNA/DNAorDNA/RNA）技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)，是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（CavnegieInstituteofWashington）的RoyBritten及其同事發(fā)明的。所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA，當(dāng)它們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。

分子生物學(xué)常用技術(shù)1、薩瑟恩DNA印跡雜交

根據(jù)毛細(xì)管作用的原理，使在電泳凝膠中分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由E.Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的，故又叫SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。分子生物學(xué)常用技術(shù)（a）（b）（c）（d）（e）基因組DNADNA限制片段硝酸纖維素濾膜同探針同源雜交的基因DNA片段X光底片Southern凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)分子生物學(xué)常用技術(shù)SouthernDNA印跡雜交之X光顯像圖片

水稻（OryzasativaL.)的葉綠體DNA分別用核酸內(nèi)切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加樣在含有EtBr染料的1%的瓊脂糖凝膠電泳中作電泳分離，然后同32P標(biāo)記的玉米psbA探針作Southern雜交。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶，表明含有水稻的psbA基因序列。分子生物學(xué)常用技術(shù)2、諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）

1979年，J.C.Alwine等人發(fā)展而來，是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法。由于這種方法與薩瑟恩DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾賽恩RNA印跡技術(shù)（Northernblotting）。而將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（Westernblotting）。分子生物學(xué)常用技術(shù)3、斑點(diǎn)印跡雜交和狹線印跡雜交

斑點(diǎn)印跡雜交（dotblotting）和狹線印跡雜交（slotblotting）是在Southern印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展的量種類式的快速檢測特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸雜交技術(shù)。由于在實(shí)驗(yàn)的加樣過程中使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置，使眾多待測樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上，并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣或線陣。這兩項(xiàng)技術(shù)更適應(yīng)與核酸樣品的定量檢測。分子生物學(xué)常用技術(shù)檢測重組體克隆的菌落雜交技術(shù)4、菌落雜交分子生物學(xué)常用技術(shù)核酸雜交常用幾種膜的性能比較分子生物學(xué)常用技術(shù)Ⅱ.蛋白質(zhì)/DNA、蛋白質(zhì)/RNA雜交技術(shù)分子生物學(xué)常用技術(shù)1、凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（Gelretardationassay）

又叫DNA遷移率變動實(shí)驗(yàn)（DNAmobilityshiftassay）是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質(zhì)型胡作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，也是當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。分子生物學(xué)常用技術(shù)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)的基本原理圖放射性標(biāo)記的DNA由于同一種細(xì)胞蛋白質(zhì)B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶ACB放射自顯影****凝膠電泳放射性標(biāo)記的DNA細(xì)胞蛋白質(zhì)提取物蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合******BDNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合分子生物學(xué)常用技術(shù)(a)(b)(c)

在凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)中競爭DNA與探針DNA之間的競爭作用（a）沒有加入競爭DNA的正常的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)，探針DNA與特異蛋白質(zhì)結(jié)合，出現(xiàn)阻滯條帶；（b）加入的超量競爭DNA與探針DNA競爭結(jié)合同一種蛋白質(zhì)，阻滯條帶消失；（c）競爭DNA與探針DNA分別結(jié)合不同的蛋白質(zhì)，出現(xiàn)同（a）一樣的阻滯條帶**********蛋白質(zhì)與未標(biāo)記的競爭DNA結(jié)合凝膠電泳放射自顯影蛋白質(zhì)與標(biāo)記的探針DNA結(jié)合**********分子生物學(xué)常用技術(shù)2、DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)（footprintingassay）

是一類用于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是，可以形象地展示出一種特殊的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域如果使用較大的DNA片段，通過足跡實(shí)驗(yàn)便可確定其中不同的核苷酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況如同凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)一樣，我們也可以加入非標(biāo)記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據(jù)此測定其核苷酸序列的特異性。分子生物學(xué)常用技術(shù)32p1510*14810*加入蛋白質(zhì)X加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影1510AB足跡(a)(c)(b)DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)常用技術(shù)3、甲基化干擾實(shí)驗(yàn)（methyltioninterferenceassay）根據(jù)DMS（硫酸二甲酯）能夠使G殘基甲基化，而六氫吡啶又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設(shè)計(jì)出了另一種研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法，即甲基化干擾實(shí)驗(yàn)。這種技術(shù)可以檢測靶DNA中特異G殘基的優(yōu)先甲基化對而后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。DMS化學(xué)干擾的主要局限性時(shí)，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實(shí)驗(yàn)的一種有效的補(bǔ)充手段，可以鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。具體操作如下頁圖所示。

分子生物學(xué)常用技術(shù)GGGGGGmⅠGGGⅢmGGGmⅡGGGmⅡGGGmⅠGGGⅢmDNA局部甲基化與蛋白質(zhì)提取物混合與蛋白質(zhì)結(jié)合不與蛋白質(zhì)結(jié)合與蛋白質(zhì)結(jié)合凝膠電泳與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA帶含有Ⅰ和Ⅲ兩種類型DNA片段不能與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA帶含有全部三種類型DNA片段切除所有結(jié)合與不結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA帶，并用六氫吡啶切割甲基化的G殘基結(jié)合帶非結(jié)合帶缺失的DNA帶表明相應(yīng)G殘基的重要意義，它得到結(jié)合蛋白質(zhì)的保護(hù)甲基化干擾實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)常用技術(shù)4、體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)GG×GG×meGGGGMeMe完整的細(xì)胞裸露的DNADMS分離DNA并用六氫吡啶切割凝膠分析PCR擴(kuò)增受保護(hù)的G殘基應(yīng)用甲基化保護(hù)作用進(jìn)行的體內(nèi)足跡實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)常用技術(shù)5、Southwestern雜交DNA與蛋白質(zhì)的體外吸附技術(shù)（Southwesternblotting）結(jié)合了Western印跡與southern印跡兩種實(shí)驗(yàn)方法的特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的一種檢測序列特異性DNA結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)方法6、Northwestern雜交RNA-蛋白質(zhì)印跡分子生物學(xué)常用技術(shù)Ⅲ.PCR技術(shù)

1、基因擴(kuò)增原理?xiàng)l件

分子生物學(xué)常用技術(shù)(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)分子生物學(xué)常用技術(shù)溫度（℃）時(shí)間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。分子生物學(xué)常用技術(shù)ReactionConditionforaTypicalPCRAssay分子生物學(xué)常用技術(shù)TypicalPCRThermalProfile*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllength分子生物學(xué)常用技術(shù)SomeDNAPolymerasesUsedinPCR分子生物學(xué)常用技術(shù)CharacteristicsofTaqPolymerase

分子生物學(xué)常用技術(shù)5’3’3’5’靶DNA片段引物A5’5’引物A’3’3’PCRPCRPCR3’3’5’5’PCR引物B引物C5’5’3’3’混合,變性,退火5’