沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要本文主要對黃芩苷衍生物的抗心肌缺血作用進行了研究，并初步探討了其作用機苷衍生物可以顯著對抗大鼠心電圖T波的抬高及ST段的偏移；降低大鼠血清中肌酸磷含量、提高SOD、Na-K*-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性；減輕缺血苷衍生物可以顯著提高LVSP、±dp/dtmax等血流動力沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要2Inthispaper,weinvestigatetheprotectionofbaicalinderivantagainstmyocardialischemiainjuryanditsposmodelwasmadebyadministrationofPituitrin(Pit)andIsoproteischemiaratsinducedbyPitandIsowerederivant.inthemyocardiabaicalinderivantcouldsignificantlydecreaseactivcontentofmalondialdehyd(MDA),increasetheactivityofthesupandNa+-K-ATPase,Ca2-Mg2+-ATPaseinthemyocardialhomogchangesIso-inducedwerealsoameliomodelwasperformedwithleftanteriordindicatedleftventricularsystolSummarizingalltheexpmyocardialischemiainjuryinthewayofenhancingantioxidativepotencyoftheheart,inhibitinglipidperoxidation,ameKeywords:myocardialischemia;anti-oxidation;hemodynamics;myocardialinfarctionsize沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文3缺血性心臟病(ischemicheartdisease),亦稱冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronaryheartdisease,CHD),簡稱冠心病，是由于冠狀動脈器質(zhì)性(動脈粥樣硬化)病變或功能性(冠狀動脈痙攣)改變，引起心肌血氧供需之間不平衡而導(dǎo)致的心肌缺血、缺氧或壞死性損害，是心血管疾病中是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見病、多發(fā)病。臨床主要分為無癥狀性心肌缺血型、心絞痛型、心肌梗死型、缺血性心肌病型以及猝死型五種類型。在歐美各國死亡原因構(gòu)成中，冠心病多居首位，約為總病死率的40%-50%。20世紀(jì)80年代以來，隨著我國人民生活水平的不斷提高、社會老齡化與生活模式現(xiàn)代進程的加快，其患病率及死亡率也呈逐年上升的趨勢，并已成為人群中主要的死亡原因之一[]。據(jù)統(tǒng)計，目前我國60歲以上的人口中，有半數(shù)以上的人口不同程度的存在心肌缺血。目前已有的流行病學(xué)資料也推定，到2020年冠心病將位于人類死亡原因的第一位。因此，研究預(yù)防和治療缺血性心臟病的措施和藥物是目前醫(yī)藥界共同關(guān)注的重要課題。1.缺血性心臟病與抗心肌缺血藥物1.1心肌缺血的病理生理缺血性心臟病最常見的病因是冠狀動脈粥樣硬化，是隨著年齡的增長在某些體內(nèi)外環(huán)境變化等多種因素作用之下逐漸發(fā)展起來的，遺傳因素也起一定作用。粥樣硬化可累及冠脈四支中的一、二或三支，也可四支同時受累，其中以左前降支受累最為多見，病變也最重。冠狀動脈粥樣硬化(CAS)Ⅲ級以上狹窄時，在冠狀動脈粥樣硬化病變基礎(chǔ)上可并發(fā)斑塊破裂、出血或新鮮血栓形成，常造成管腔的嚴(yán)重狹窄或完全阻塞，導(dǎo)致相應(yīng)供血區(qū)的心肌發(fā)生嚴(yán)重缺血或急性心肌梗塞(2。另外，冠狀動脈痙攣和冠狀動脈血栓(thrombosis)也是形成急性心肌梗塞發(fā)生的主要原因，尤其是在冠脈己有粥樣硬化病變的基礎(chǔ)上，冠狀動脈痙攣和血栓可能是造成急性冠脈閉塞的重要原因。心肌缺血的基本矛盾是對氧的供需失調(diào)，即供血、供氧減少而耗氧增加；同時出現(xiàn)心肌細胞代謝產(chǎn)物聚集而加重心肌缺血。造成心肌缺血、缺氧的病理生理基礎(chǔ)可以從以下方面來闡述：心肌缺血時最早出現(xiàn)的病理生理改變是代謝變化3。當(dāng)心肌發(fā)生缺血、缺氧時，能量供應(yīng)以糖酵解為主，使組織中乳酸和丙酮酸增多、H?在組織中大量堆積，引起心肌細胞酸中毒，酸中毒可進一步抑制通過糖酵解產(chǎn)生能量，加重缺血心肌的能量缺乏。在茶酚胺釋放增多等因素促使下游離脂肪酸(FFA)形成增加，從而增加心肌耗氧量、加重沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章前言4載的程度。但線粒體過多攝入Ca2+,除增加ATP消耗外，Ca2+與線粒體內(nèi)含磷酸根的化體內(nèi)有多種產(chǎn)生自由基的物質(zhì)，而對機體有損害的主要是活性氧，其中包括：超防御系統(tǒng)，主要有超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶研究證明，許多心血管疾病的病理過程中都有過量活性氧的產(chǎn)生，是誘導(dǎo)細胞死性改變；LP的產(chǎn)物丙二醛(MDA)極易修飾低密度脂蛋白(LDL),成為MDA-LDA后，能沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文5(2)形成新的滲透通道，特別是對鈣離子的特殊通道，同時LP使心肌細胞膜和肌漿網(wǎng)膜破壞，造成心肌細胞漿Ca2+過度負荷，進而鈣鹽在線粒體中聚積、抑制心肌能量產(chǎn)生；(3)使膜上蛋白質(zhì)和磷脂交聯(lián)，造成蛋白質(zhì)的不可逆失活；(4)氧化膜結(jié)合酶活性中心上的巰基，導(dǎo)致酶活性的喪失；(5)由LP的激活，磷脂酶和脂膜的活化、溶血磷脂和游離脂肪酸的洗滌作用組成的脂質(zhì)三聯(lián)體(Lipidtriad),造成缺血心肌由可逆性損傷發(fā)展成為不可逆性壞死10-12?？傊锬ね暾云茐募熬€粒體功能障礙是急性缺血性心肌細胞損壞的特征。抑制脂質(zhì)過氧化物的生成和增強氧自由基的清除，能有效地保護缺血性心肌細胞，限制梗死范圍。1.1.2心臟舒縮功能的變化心肌缺血導(dǎo)致心肌組織代謝和血液營養(yǎng)成分及氧氣的供需不平衡。血氧供應(yīng)不足，能量物質(zhì)生成減少導(dǎo)致心臟舒縮功能減退。心肌缺血時心肌能量利用發(fā)生障礙，可引起左室舒張不全。有文獻報道，當(dāng)心肌缺血造成心臟某一部分心肌血流完全中斷時，數(shù)秒鐘之內(nèi)心肌收縮程度減弱，隨之收縮功能喪失，1分鐘之內(nèi)缺血部分出現(xiàn)收縮期反向膨出，而這一現(xiàn)象可能是心肌細胞斷裂，心肌壞死區(qū)變薄所致[13-14]。嚴(yán)重心肌于心肌階段性活動障礙，收縮期該部分缺血心肌反向膨出，而舒張期恢復(fù)原狀，可影響左室順應(yīng)性。左室舒張期順應(yīng)性降低或左室僵硬是引起左室舒張功能衰竭的重要原因之一。隨著心肌缺血范圍的擴大及心肌損傷程度的加重，左室收縮功能也嚴(yán)重損傷。1.1.3血液流變學(xué)改變血液流變學(xué)(Hemorrheology)是研究循環(huán)血液的流動性、變形性、凝固性及粘彈性的科學(xué)。血液流變學(xué)的異常也是導(dǎo)致心肌缺血缺氧的重要原因?；既毖孕难芗膊r，紅細胞聚集性及紅細胞壓積增高，而其變形性卻降低。血液粘滯度增高時，血流變慢，其后果如下[15]:(1)血液遞氧功能發(fā)生障礙，引起局部組織缺氧、酸中毒，使紅細胞的可塑性降低，從而使全血粘滯度進一步增高。(2)可促使血小板的粘附性和聚集性增高，有助于其在小血管中形成微血栓，導(dǎo)致微循環(huán)障礙。血小板粘附若發(fā)生在動脈壁，則有助于動脈壁上的血栓形成。局部組織缺氧所造成的酸中毒，可使血管壁發(fā)生病變，有助于血小板的粘附，形成血栓。動脈壁上形成血栓后，血流淤滯可使血小板進一步聚集，形成微血栓，從而進一步加重心肌缺血。(3)冠脈因血液供應(yīng)不足、組織缺氧可引起一系列癥狀，如原有冠狀動脈硬化，可發(fā)生心絞痛、心肌梗塞，后者又可使血流進一步礦慢，造成惡性循環(huán)。因此，采用恰當(dāng)?shù)姆乐未胧└纳蒲毫髯儗W(xué)的異常變化，對于改心肌缺血狀態(tài)、降低冠心病死亡率有十分重要的意義。沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第一章前言61.2心肌缺血與缺血再灌注損傷心肌缺血期間的一些變化已為再灌注損傷的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)，再灌注損傷是缺血損傷的延續(xù)、擴大和惡化?？梢姡募∪毖c再灌注損傷是彼此獨立又相互聯(lián)系的病理生理過程。再灌注損傷實質(zhì)上是將在缺血損傷期處于可逆損傷的心肌細胞經(jīng)恢復(fù)血流轉(zhuǎn)化為不可逆損傷[16。隨著冠狀動脈溶栓術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA),冠狀動脈內(nèi)擴張術(shù)，冠狀動脈旁路術(shù)等技術(shù)的建立和推廣17,使缺血心肌重新獲得血液供應(yīng)，明顯減輕了急性心肌梗死時心肌細胞的損傷。但許多動物實驗和臨床觀察發(fā)現(xiàn)，心肌組織缺血一定時間后恢復(fù)血液灌注，心臟功能反而會進一步減退，因而將這種再灌注后缺血性損傷進一步加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusioninjury,IRTI18,其表現(xiàn)形式有致死性再灌注損傷、心肌頓抑(Myocardialstunning)、再灌注性心律失常和能量代謝改變。心肌缺血再灌注損傷是一復(fù)雜的病理生理過程。研究表明，氧自由基(oxygenfreeradical,OFR)增加、鈣超載、能量代謝障礙和細胞凋亡等均可能參與再灌注損傷過程。氧自由基及其引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是造成心肌損傷的啟動因素；細胞內(nèi)鈣超載是造成心肌損傷的共同環(huán)節(jié)；能量耗竭、細胞內(nèi)酶的釋放、細胞膜結(jié)構(gòu)破壞及細胞凋亡，是造成心肌損傷的共同后果。目前，如何做到既保證盡早恢復(fù)缺血組織的血流，又減輕甚至解除再灌注損傷的發(fā)生已成為缺血性心臟病防治中亟需解決的又一重要課題?，F(xiàn)階段對缺血再灌注損傷防治的研究主要集中在減輕氧自由基損傷、阻止細胞內(nèi)鈣超載、消除能量代謝障礙、改善低灌流現(xiàn)象等方面[19,并取得了一些進展，但臨床上仍缺乏療效確切的藥物。1.3治療心肌缺血藥物的分類1.3.1亞硝酸脂和硝酸脂類藥物亞硝酸脂類是最早應(yīng)用的抗心肌缺血藥物。早在1867年，亞硝酸異戊脂被引入臨床，由于該藥副作用多，現(xiàn)己少用。現(xiàn)在臨床上主要使用的是硝酸甘油。有機硝酸脂類舒張所有的血管，對靜脈的作用強于動脈，舒張靜脈的結(jié)果使回心血量減少，降低前負荷、心室舒張末期壓力和心室壁肌張力；舒張動脈血管的結(jié)果是降低外周阻力，減輕后負荷。降低前、后負荷的結(jié)果是導(dǎo)致心肌的耗氧量明顯減少。此類藥物通過阻滯β受體興奮，減慢心率、減弱心肌收縮力、降低心肌耗氧量；增加缺血區(qū)供血，心內(nèi)膜/外膜供血比例上升，增加缺血區(qū)側(cè)枝循環(huán)；改善心肌代謝，使缺血區(qū)的乳酸產(chǎn)生減少或產(chǎn)生轉(zhuǎn)變?yōu)閿z取，減輕心肌因缺血所致的失K;保護缺17區(qū)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，維持缺血區(qū)ATP的供應(yīng)[20]。代表藥物有：普萘洛爾、吲哚洛爾、阿替洛爾、美托洛爾、醋丁洛爾、拉貝洛爾等。1.3.3鈣拮抗劑主要通過對Ca2+通道的阻滯作用擴張血管、抑制心肌收縮力、拮抗交感神經(jīng)活性、降低心肌耗氧量；通過擴張冠脈，促進側(cè)支循環(huán)開放，抑制血小板聚集和增加心肌的血液供應(yīng)；亦可通過減輕心肌缺血時細胞內(nèi)鈣超載，保護心肌細胞及心肌細胞內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)和功能。此外，鈣通道阻滯藥還有促進內(nèi)皮細胞產(chǎn)生及釋放內(nèi)源性NO作用?？蓡为殤?yīng)用，也可與硝酸酯類或β受體阻斷藥合用。這類藥物包括：維拉帕米、硝苯地平、地爾硫草、氨氯地平等。1.3.4抗血栓藥包括抗血小板藥、抗凝血藥及溶栓藥(又稱纖維蛋白溶解藥),如阿司匹林、噻氯匹啶、阿昔單抗、普通肝素、水蛙素、鏈激酶及尿激酶等20]。1.3.5血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)這類藥物有：卡托普利、伊那普利、賴諾普利、雷米普利等。1.3.6Na+/H交換抑制劑其主要是抑制心肌缺血細胞受損傷時過度的Na/H交換(sodium-hydrogenexchange)阻止細胞內(nèi)Ca2+超載，而達到抗心肌缺血的目的。這類藥物包括阿米洛利、HOE694和1.3.7鉀通道開放藥鉀通道開放藥(potassiumchannelopeners,PCOs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類具有新穎藥理作用的藥物，目前合成的PCOs都是作用于ATP敏感鉀通道(ATP-sensitiveK?channel,KATP),如吡那地爾和尼可地爾等。PCOs具有優(yōu)先擴張冠脈且能防止心肌頓抑、限制梗死面積、模擬缺血預(yù)處理等作用。1.3.8PKCε激活劑缺血預(yù)適應(yīng)時被激活，通過由胞漿向胞膜的轉(zhuǎn)位達到心肌保護作用，PKCε激活肽ψeRACK在離體和在體心肌缺血模型中均表現(xiàn)了明顯縮小心肌梗死面積和降低心肌三酶的作用23。PKCε激活劑將有可能被開發(fā)為新一代靶向抗心肌缺血藥物。1.3.9中草藥人參、川芎、黃芪、丹參、蒺藜、毛冬青、三七、葛根和四季青等中草藥，以及8這些中草藥中提取的有效成分也有一定的抗心肌缺血作用[24]。2.立題依據(jù)效的防治缺血性心臟病藥物，己成為醫(yī)藥學(xué)工作者的重要任務(wù)之一。黃芩苷(baicalin,C?1H??O11)是從唇形科植物黃芩(Scutellariabaicalens沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章實驗材料9(遼)2003-008二.藥物與試劑2.1黃芩苷衍生物(baicalinderivant):沈陽藥科大學(xué)天然藥化教研室提供(含量：63%)2.2鹽酸異丙腎上腺素注射液(Iso):上海禾豐制藥有限公司，批號：6E200042.4垂體后葉素注射液(Pit):上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號：0609012.50.9%氯化鈉(SodiumChloride,NaCl)沈陽志鷹制藥廠，批號：071024022.6肝素鈉注射液：上海第一生化藥業(yè)有2.8甲醛：沈陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)試劑廠，2.9pH7.4磷酸鹽緩沖液：自制2.10紅四氮唑：(TTC)天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心，批號：2008020172.11冰乙酸：南京建成生物工程研究所2.12無水乙醇：南京建成生物工程研究所，批號：2008030272.13谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、3.2RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)：成都儀器廠制造3.3YPJ01型壓力換能器：成都儀器廠3.4動物人工呼吸機DH-140:浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實驗廠3.5722S分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第二章實驗材料3.9HZS-H水浴振蕩器：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司3.10H-1型微型漩渦混合器：上海精科實業(yè)有限公司/第三章實驗方法取200-250g的Wistar大鼠70只，雄性，適性飼養(yǎng)兩天后，隨機分為7組。各組分別用20%烏拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉、固定，與RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)連接，記錄正常的標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。靜脈注射給藥組分別給予黃芩苷衍生物180mg/kg、90mg/kg、45mg/kg,陽性對照組靜脈給予鹽酸維拉帕米注射液2mg/kg,正生物135mg/kg,給藥容積為10ml/kg。各組動物均連續(xù)給藥四天，于第四天靜脈注射給藥10min后、灌胃給藥40min后，20%烏拉坦麻醉后背位固定，與RM6240BD生理信號采集系統(tǒng)相連。正常對照組注射等容積0.9%生理鹽水，其余各組尾靜脈注射垂體后Pit前后T波幅度的變化。取200-250gWistar大鼠70只，雄性，適性飼養(yǎng)兩天后，隨機分為7組。各組分別用20%烏拉坦(1g/kg)腹腔注射麻醉、固定，并用針與RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)連接，記錄正常標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。給藥組分別尾靜脈注射黃芩苷衍生物180mg/kg、90mg/kg、45mg/kg,陽性對照組尾靜脈注射鹽酸維拉帕米注射液2mg/kg,藥四天。第三天給藥10min后，除正常對照組腹腔注射等容積0.9%生理鹽水外，其余各組腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素(Iso)2mg/kg。第四天給藥前，20%烏拉坦腹腔注射麻醉(1g/kg),背位固定，與RM6240BD生理信號采集系統(tǒng)相連，各物10min后，除正常對照組腹腔注射等容積0.9%生理鹽水外，均腹腔注射Iso2mg/kg。記錄給予Iso后2、5、10、15、20、30min的心電圖。(1)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖中ST段偏移量：以每組ST段偏移基線高度的總和(的∑ST=(2'時ST段毫伏數(shù)一0′時ST段毫伏數(shù))+(5'時ST段毫伏數(shù)—0'時ST段毫伏數(shù))+……十(30'時ST段毫伏數(shù)一0'ST段毫伏數(shù))(2)血清生化指標(biāo)：末次注射Iso后2h,腹主動脈取血，3000r/min,低溫離心15min制備血清分裝，一80℃保存。按試劑盒說明，測定血清中肌酸激酶(CK)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)活性。(3)心肌組織生化指標(biāo)：取血后迅速取出心臟，以冰生理鹽水洗去殘留血液，除去大血管及結(jié)締組織后用濾紙吸干水分，于-80℃保存。按試劑盒說明，測定心肌組織勻漿中Na-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及SOD的活性；蛋白(4)心肌病理組織學(xué)檢查：取出心臟，以冰生理鹽水洗去殘留血液，除去大血管及結(jié)締組織后，每組隨機取兩個標(biāo)本置10%甲醛溶液中固定，制作病理切片，HE染色，光3.1大鼠在體心肌缺血再灌注損傷模型制備導(dǎo)聯(lián)心電圖。手術(shù)部位備皮、消毒，頸前正中作縱行皮膚切口(長約2cm),用止血鉗鈍拇指固定心尖，方向朝上偏右，以左心耳與肺動脈圓錐之間的左冠狀靜脈主干為標(biāo)志，3.2動物分組及給藥沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章實驗方法給予等容積生理鹽水給予等容積生理鹽水3.3觀測指標(biāo)且導(dǎo)管再向里插入時明顯感到有阻力時，表示導(dǎo)管尖端已達主動脈瓣處。此時稍停離出右側(cè)股動脈后，插入自制的充滿肝素鈉(50μ/ml)生理鹽水的軟質(zhì)塑料導(dǎo)管(內(nèi)徑信號輸入到RM6240多道生理信號采集處理變化。觀察指標(biāo)包括：動脈收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP),平均動脈壓(MAP)、心率(HR)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左心(2)方法33:實驗結(jié)束后將大鼠心臟迅速取下，以4℃生理鹽水沖洗殘留血液，用濾吸去水分，剔除血管和脂肪等非心肌組織后稱全心濕重。然后，剪去心房和右心室游壁，留左心室稱重，于-20℃冷凍20min。沿房室溝從心尖至心基底部平行將心室均勻沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三章實驗方法染色后立即沖洗多余染料，置于10%的甲醛溶液中固定24h。將梗塞4.統(tǒng)計方法：實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)的形式表示，多組間比較采用單因素方差分析(onewayANOVA),兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)1.1黃芩苷衍生物對急性心肌缺血大鼠心電圖T波高度變化的影響實驗結(jié)果如表1所示：與正常對照組相比，模型組大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖T波于15s、30s時顯著抬高；與模型組相比，靜脈給予90mg/kg、180mg/kg及維拉帕米均可顯著抑制15s、30s時T波幅度抬高，黃芩苷衍生物灌胃組大鼠T波抬高幅度未見明顯Table1EffectofBaiderivantonchangesofTwav0.12±0.06###20.06±0.02”##P<0.01,###P<0.001vs.controlgroup;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vs.mo實驗結(jié)果如表2所示：與正常對照組相比，模型組大鼠標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段顯著偏移；與模型組相比，黃芩苷衍生物90mg/kg、180mg/kg及維拉帕米可顯著降低IsoTab2EffectofBaiderivantonZ-STsegmentchangeinmyoc20.22±0.15”#P<0.001vs.controlgroup;"P<0.01,"P<0.001vs.mode2.2黃芩苷衍生物對急性心肌缺血大鼠血清中心肌酶的影響實驗結(jié)果如圖1、2、3所示：與正常對照組相比，模型組大鼠血清中LDH、CK、及AST活性顯著升高；與模型組相比，黃芩苷衍生物可劑量依賴性地降低大鼠血清中LDH和CK活性。同時，黃芩苷衍生物180mg/kg劑量組大鼠血清中AST活性與模型Fig.1.TheeffectofBaiderivanton###P<0.001vs.controlgroup;*P<0.05,P<0.01,"P<0.001vs.model*02工Fig.2.TheeffectofBaiderivantontheactivitychangesofCKintheserumofP<0.001vs.controlgroup;"P<0.05,"P<0.01,*P<0.001vs.modelT0Fig.3.TheeffectofBaiderivantonthe##2P<0.001vs.controlgroup;"P<0.01,P<0.001vs.modelgroup2.3黃芩苷衍生物對急性心肌缺血大鼠心肌組織中MDA和SOD的影響2.3.1黃芩苷衍生物對急性心肌缺血大鼠心肌組織中MDA含量的影響實驗結(jié)果如圖4所示：與正常對照組相比，模型組大鼠心肌組織中MDA含量顯著增高；與模型組相比，黃芩苷衍生物90mg/kg、180mg/kg組及維拉帕米組大鼠心肌組織中MDA含量顯著降低。Fig.4.TheeffectofBaiderivantonthecontentofMhomogenatofmyocardialischemiaratsinducedbyIso(X±SD,n=10)#P<0.05vs.controlgroup;"P<0.05vs.modelgroup實驗結(jié)果如圖5所示：與正常對照組相比，模型組大鼠心肌組織中SOD活性顯著降低；與模型組相比，黃芩苷衍生物180mg/kg劑量組大鼠心肌組織中SOD活性顯著Fig.5.TheeffectofBaiderivantontheactivitychangesofSODinthemyocardialhomogenateofmyocardialischemiaratsinducedbyIso(X±SD,n=10)#P<0.05vs.controlgroup;"P<0.05vs.modelgr2.4黃芩苷衍生物對急性心肌缺血大鼠心肌組織中ATP酶活性的影響及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性顯著降低；與模型組相比，黃芩苷衍生物180mg/kg組及維Fig.6.TheeffectofBaiderivantontheactivitychangesofNa-K*-ATPaseinthemyocardialhomogenateofmyocardialischemiarat(X±SD,n=10)#P<0.01vs.controlgroup;'P<0.05vs.modelgroupFig.7.TheeffectofBaiderivantontheactivitychangesofCa2+-Mg2+-ATPaseinthemyocardialhomogenateofmyocardialischemiaratsinducedbyIso(X±SD,n=10)#P<0.01vs.controlgroup;'P<0.05vs.model2.5Iso致急性心肌缺血大鼠的心肌病理組織學(xué)觀察在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌病理組織學(xué)切片，結(jié)果如圖8所示：(1)正常對照組：心肌纖維排列整齊，未見異常改變。(2)模型組：可見大片心肌細胞變性壞死，肌纖維腫脹，斷裂，間質(zhì)內(nèi)有大量炎性細胞浸潤，并有出血。(3)維拉帕米0.5mg/kg劑量組：僅見散在心肌細胞變性壞死及肌纖維斷裂。(4)黃芩苷衍生物45mg/kg劑量組：片狀心肌細胞變性壞死，肌纖維腫脹，斷裂。(5)黃芩苷衍生物90mg/kg劑量組：偶見心肌纖維局灶性斷裂。(6)黃芩苷衍生物180mg/kg劑量組：心肌纖維排列比較整齊，未見斷裂。Fig.8.Histopathologicexaminationofmyocardiuminmyocardial3.1黃芩苷衍生物對缺血再灌注損傷大鼠血流動力學(xué)的影響實驗結(jié)果如表3-9所示：各組大鼠血流動力學(xué)指標(biāo)于缺血前均無顯著差異。缺血30min及再灌注30、60、90、120min時，與Sham組相比，I/R組大鼠各項血流動力學(xué)沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文行性減慢。與I/R組相比，黃芩苷衍生物可劑量依賴性地抑制各時間點的LVSP、±dp/dtmax的降低。缺血30min時，黃芩苷衍生物各組對血壓無影響，再灌期間其可顯著抑制SBP、DBP、MAP的下降。缺血30min至再灌注60min期間，黃芩苷衍生物對心率無顯著影響，再灌注90min及120min時，其180mg/kg可顯著抑制心率減慢。與同(Beforeischemia,BI;Ischemia,I;Reperfusion,R)(X±SD,n=10)###P<0.001vs.shamgroup;"P<0.05,"P<0.01,"P<0.001vs.I/RgroupTab4TheeffectofBaiderivantonmaximalrateofriseofventricularpressure(+dp/dtmax,Kpa-s')inratswithmyocareperfusioninjury(Beforeischemia,BI;Ischemia,I;Reperfusion,R)(X±SD,n=10)450±79#####P<0.01.###P<0.001vs.shamgroup;P<0.05,"P<0.01,"P<0.001vs.I/Tab5TheeffectofBaiderivantonmaximalrateofdeclineofventricularpressure(-dp/dtmax,Kpa·s')inratswithmyocardialischemiaandreperfusioninjury(Beforeischemia,BI;Ischemi 779.5±84.4541.7±48.4###413.1±74.9###361.7±68.4###324.9±68*##287.2±47.4####P<0.001vs.shamgroup;P<0.05,"P<0.01,"P<0.001vs.I/RgroupTab6TheeffectofBaiderivantwithmyocardialIschemia,I;Reperfusion,R)( ##P<0.01.###P<0.001vs.shamgroup;P<0.05,P<0.01,vs.I/Tab7TheeffectofBaiderivantonBI;Ischemia,I;Reperfusion,R)(X###P<0.001vs.shamgroup;P<0.01,P<0.001vs.I/RgroupTab8TheeffectofBaiderivantondiastolicblBI;Ischemia,I;Reperfusion,R)(X8.76±0.93###""P<0.01,"""P<0.001vs.shamgroup;P<0.05,"P<0.01,"P<0.001vs.I/RgroupTab9TheeffectofBaiderivantonmeanarterialpressure(MAP,Kpa)inratswithmyocardialBI;Ischemia,I;Reperfusion,R)(X10.80±1.40###4.64±2.12*##P<0.01,#P<0.001vs.shamgroup;P<0.01,P<0.001vs.I/Rgroup沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文3.2黃芩苷衍生物對缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死范圍的影響實驗結(jié)果如表10及圖9、10所示：與IR組相比，黃芩苷衍生物可劑量依賴性地縮小心肌梗死范圍。Tab10TheeffectofBaiderivantonpercentageofinfarctedarea(%)inratswithmyocardialP<0.05,"P<0.01,"P<0.001vs.I/RgFig.9.TheeffectofBaiderivantonpercentageofinfarctedarea(%)inratswithmyocardialischemiaandreperfusioninjurweight/heartweight(%);righthistograms:Infarctedareaweight/leftventricleweight(%)(X±SD,n=10)*P<0.05,"P<0.01,"*P<0.001vs.I/Rgr沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第四章實驗結(jié)果Fig.10.TheeffectofBaiderivantonpercentageofinfarctedarea(%)inr第五章討論研究心肌缺血病理生理機制，篩選高效安全的抗心肌缺血藥物要求穩(wěn)定適宜的模(1)誘發(fā)冠狀動脈痙攣法：如垂體后葉素致急性心肌缺血模型。193己證實，應(yīng)用大劑量Iso導(dǎo)致的大鼠心肌損傷，其心電圖演變、心肌代謝改變及組織病100多年前，Langendorff描述了使用灌流方式使離體貓心存活的方法。此后這一方法一直被不斷改進。這一方法是以恒壓或恒流的方式，從主動脈根部逆向用含氧鹽溶沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第五章討論再灌注者，可剪斷結(jié)扎線。也可用含有垂體后葉素40U的灌流液灌流、氮的無氧灌流液缺氧；另一種為冠狀動脈阻塞法：結(jié)扎大鼠冠脈30min后，恢復(fù)血供再灌注120min,2.1黃芩苷衍生物對Pit致大鼠急性心肌缺血的保護作用早在1910年，Osler就提出冠狀動脈痙攣是導(dǎo)致心絞痛的原因之一42]。冠脈不但可致變異型心絞痛，還可導(dǎo)致勞力型、不穩(wěn)定性心絞痛和急性心肌梗死，甚至猝死[43。因此，冠狀動脈痙攣導(dǎo)致的缺血性心臟病，近年來受血性T波抬高是由于心內(nèi)膜下肌層缺血區(qū)與正常心肌復(fù)極化時相不一致時復(fù)極化向量沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第五章討論病因素之一。異丙腎上腺素(Iso)屬于兒茶酚胺類物質(zhì)，可興奮β受體，使心肌收縮力流量減少和氧張力降低密切相關(guān)，而且ST段偏移可反映早期的缺血程度，梗死范圍和移總幅度，從而提示其能有效對抗Iso導(dǎo)致的心肌缺血放進入血液，如血清中肌酸激酶(CK)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、乳酸脫氫酶(LDH)的酶廣泛分布在心肌、紅細胞、骨骼肌和肝臟中，它在細胞液中的含量非常豐富47,因而過程加強，有氧氧化過程受抑制，能量供應(yīng)障礙。本實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活黃嘌呤氧化酶，該酶利用ATP分解產(chǎn)生的次黃嘌呤和黃嘌呤，SOD是機體清除OFR的重要酶，它具有清除超氧陰離子，組織的損傷。因此，在一定程度上，清除OFR或抑制OFR的產(chǎn)生，可對缺血心肌起到SOD活性明顯下降，表明OFR生成與清除之間出現(xiàn)嚴(yán)重失衡，進一步證實了損傷與OFR相關(guān)。與模型組比較，黃芩苷衍生物能明顯提高心肌組織中SOD的活性，減少MDA的生成量，提示黃芩苷衍生物可增強內(nèi)源性氧OFR清除系統(tǒng)功能，抑制脂沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第五章討論重要機制之一。2.2.4黃芩苷衍生物對急性心肌缺血大鼠心肌能量代謝的影響ATPase是存在于細胞和細胞器膜上的一種蛋白質(zhì)，在物質(zhì)轉(zhuǎn)運、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞等方面有重要作用。機體組織在缺氧缺血及一些疾病狀態(tài)下，該酶的活性會明顯降低52]。心肌缺血期間產(chǎn)生的自由基引發(fā)生物膜脂質(zhì)過氧化損傷，是造成細胞膜上的ATP失活、離子轉(zhuǎn)運障礙的主要原因之一。Na+-K-ATPase鑲嵌于線粒體內(nèi)膜，在維持細胞生理活動、體溫及正常代謝、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外離子平衡中發(fā)揮重要生理作用，是維持正常線粒體膜流動的關(guān)鍵酶。Hackenbrock和Slater的實驗研究表明，呼吸鏈上電子傳遞過程和氧化磷酸化的偶聯(lián)過程均依賴呼吸鏈活性成分在內(nèi)膜中的側(cè)向擴散和碰撞，即膜流動性。膜流動性越大，則電子傳遞越快[53-54]。線粒體鈉泵功水腫，膜流動性下降；膜流動性的降低則導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化功能障礙，ATP合成不足；而ATP合成不足，又直接降低Na-K+-ATPase的活性，兩者互為因果，造成惡性循環(huán)。近年的研究表明，心肌肌膜Na-K*-ATPase的活性和Na?-Ca2+交換活性對維持細胞內(nèi)鈣濃度恒定也有重要的意義。Ca2+-Mg2+-ATPase是維持細胞內(nèi)的Ca2+-Mg2+平衡的重要物質(zhì)。正常細胞內(nèi)的鈣能維持在較低水平。Ca2+-Mg2+-ATPase活性下降時可導(dǎo)致細胞內(nèi)外Ca2+、細胞Ca2+內(nèi)超載而導(dǎo)致心肌細胞受損，甚至死亡。Ca2+-Mg2+-ATPase的活性下降，表明線粒體的功能受損，ATP合成不足。黃芩苷衍生物180mg/kg使心肌組織中Na-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase的活性明顯升高，提示其可能是通過維持細胞膜電位及離子穩(wěn)態(tài)、改善心肌細胞能量代謝障礙去實現(xiàn)保護受損心肌的作用。2.2.5黃芩苷衍生物對急性心肌缺血大鼠心肌組織病理學(xué)的影響心肌缺血缺氧，可引起心肌細胞功能與代謝異常，進而導(dǎo)致心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)的損害。Iso可引起心內(nèi)膜損傷，造成多處片狀心肌細胞壞死、心肌纖維斷裂、間質(zhì)內(nèi)大量淋巴細胞、巨噬細胞彌漫性浸潤等病理改變。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌組織的病理改變與上述表現(xiàn)一致，而黃芩苷衍生物90mg/kg、180mg/kg劑量組及維拉帕米組大鼠心肌組織的缺血損傷程度明顯輕于模型組，提示其對Iso誘導(dǎo)的大鼠心肌缺血損傷有一貸的保護作用。2.2.6黃芩苷衍生物對缺血再灌注損傷大鼠血流動力學(xué)的影響沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第五章討論心肌頓抑(myocardialstunning)是(1)能量產(chǎn)生不足和利用障礙，從而減弱心肌的舒縮功能。(2)氧自由基增多，破壞心肌纖維蛋白結(jié)構(gòu)中巰基，使心肌纖維蛋白變性，引起心肌(3)心肌缺血再灌注引起鈣超載，促發(fā)興奮一收縮藕聯(lián)機制的障礙。+dp/dtmax指等容收縮期左室內(nèi)壓上升最變化速度，從而反映了心肌纖維收縮成分的收縮速度。新近不少研究表明+dp/dt心室舒張末期壓和平均動脈以及心率的影響較小，而受心肌收縮性能改變的影響頗為顯張期左室內(nèi)壓下降最大速率，反映左室的舒張功能壓(LVSP)是間接反映心肌收縮時射血效能的指標(biāo)，LVSP的升高和左室做加心肌耗氧，不利于缺血缺氧性心臟病，但心肌收縮功能嚴(yán)重減弱，LVSP過低，左室及左室作功的增加，心輸出量增加，使心臟的“泵”功能得以改作用與維拉帕米相當(dāng)，明顯改善了心肌的舒縮功能，并對血壓用。提示黃芩苷衍生物能顯著改善心肌缺血再灌注損傷時的可直接客觀地反映藥物對缺血心肌的保護作用。在本實驗支30min、再灌注120min后，采用TTC染色法及稱重法對心肌梗死范圍進行了評價。沈陽藥科大學(xué)碩士學(xué)位論文第五章討論缺血再灌注損傷心肌有明顯的保護作用。綜上所述，黃芩苷衍生物對心肌缺血具有保護作用，其機制可能與清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化、穩(wěn)定細胞膜、改善心肌細胞能量代謝障礙、改善血流動力學(xué)指標(biāo)等有關(guān)。第六章結(jié)論1.黃芩苷衍生物可顯著改善垂體后葉素及異丙腎上腺素引起的大鼠心電圖異常改變。2.黃芩苷衍生物可顯著降低急性心肌缺血大鼠血清中CK、LDH、AST的活性。3.黃芩苷衍生物可顯著降低急性心肌缺血大鼠心肌組織中MDA的含量，同時能顯著提高SOD的活性，從而減少自由基的生成、抑制心肌細胞膜的脂質(zhì)過氧化，減輕心肌細胞膜結(jié)構(gòu)的損害。Ca2+-Mg2+-ATPase的活性，從而改善了缺血心肌細胞的能量代謝性障礙。5.黃芩苷衍生物可減輕缺血損傷導(dǎo)致的心肌組織變性壞死及心肌纖維斷裂等病理改變。6.黃芩苷衍生物可顯著改善心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌的舒縮功能，并可縮小心肌梗死范圍。參考文獻[1]Hatoriln,HuangXL,CheQM.6-hydroxykaePferolpetals[J].Phytochem,1992,31(11):4001～40[2]吳鐳.藥學(xué)科學(xué)前沿與發(fā)展方向.中國醫(yī)藥科技出版社，2000,25.[3]楊世杰.藥理學(xué).人民衛(wèi)生出版社，2005,324～325.[4]YoshikiSawa,ajimeIchikawa,KojiKagisaki,etal.Interleukinpromotesneutrophil-mediatedreperfusioninjuryinmyocardiumJ.Thorac.Cardiovasc.Surg,1998,116~[5]LauraCalvillo,RobertoLatini,JanKajstura,etal.Recombinanthummyocardiumfromischemia-reperfusioninjuryandpromote~4806.[6]JeffreyM.Pearl,DavidP.Nelson,ConnieJ.Wagner,etal.DuffyEndothelinreceptorblockadereducesventriculardysfunctionandinjuryafterreoxygenati[7]徐冬梅，劉正湘.鈣與心肌缺血再灌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