ICS65.020.20CCSB16DB23黑龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB23/T2989—2021玉米線蟲矮化病病原長嶺發(fā)墊刃線蟲鑒定技術(shù)規(guī)程2021-10-07實(shí)施黑龍江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB23/T2989—2021前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本文件由黑龍江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件起草單位：中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所、先正達(dá)（中國）投資有限公司。本文件主要起草人：潘鳳娟、李峰、胡巖峰、劉聃、陸欣春、嚴(yán)君、鄒文秀。IDB23/T2989—2021玉米線蟲矮化病病原長嶺發(fā)墊刃線蟲鑒定技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了玉米長嶺發(fā)墊刃線蟲（Trichotylenchuschanglingensis）鑒定的取樣時期、取樣方法、儀器使用、線蟲分離、線蟲鑒定和管理檔案。本文件適用于玉米田的玉米線蟲性矮化病病原玉米長嶺發(fā)墊刃線蟲（T.changlingensis）的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29577—2013腐爛莖線蟲檢疫鑒定方法SN/T1141鱗球莖莖線蟲檢疫鑒定方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。屬于線蟲門（Nematoda）、側(cè)尾腺綱（Secernentea）、墊刃目（Tylenchida）、錐科由線蟲侵染玉米根部引起的一種玉米苗期病害。玉米4～5葉期癥狀明顯，沿著葉脈方向出現(xiàn)黃色或白色失綠條紋，莖基部組織縱向或橫向開裂、呈“蟲道”狀，大部分植株莖節(jié)縮短膨大，矮縮或叢生，不結(jié)果穗或果穗發(fā)育不良。4561DB23/T2989—2021正置顯微鏡、體式顯微鏡、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、高速離心機(jī)、制冰機(jī)、純水儀、-80℃冰箱、移液槍和水浴鍋。6.2用具500目土樣篩、挑針和玻片。7線蟲分離線蟲分離應(yīng)按照SN/T1141中的規(guī)定執(zhí)行。8線蟲鑒定8.1形態(tài)學(xué)鑒定8.1.1標(biāo)本制作按照SN/T1141中的附錄C的要求執(zhí)行。8.1.2線蟲形態(tài)觀察在顯微鏡下觀察，雌蟲蟲體較長，呈圓筒狀，固定后呈C狀；唇區(qū)高，縊縮明顯；口針細(xì)長，口針基部球略向后傾斜，側(cè)區(qū)3條側(cè)線，尾亞圓柱形，末端光滑無環(huán)紋。雄蟲蟲體略小于雌蟲，交合刺發(fā)達(dá)，略彎曲，引帶發(fā)達(dá)，交合傘起始于交合刺基部前，包至尾尖。對線蟲標(biāo)本的形態(tài)觀察，應(yīng)嚴(yán)格按照GB/T29577規(guī)定執(zhí)行。參見附錄B。Buffer（Mg）和6μg蛋白酶K]中，液氮冷凍2min，反復(fù)凍融2～3次，60℃水浴30min，2+95℃10min，12000r/min離心10min，取上清DNA提取液，-20℃保存?zhèn)溆?。采用線蟲通用引物D2A（5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3'）和D3B（D3B（5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'）擴(kuò)增線蟲的28SrDNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物約900bp。PCR反應(yīng)體系：44μLPCRMix，上游引物和下游引物各2μL，DNA模板約10ng。反應(yīng)條件95℃4min；一個循環(huán)包括94℃30s，55℃45s，72℃45s，共40個循環(huán)，最后72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收克隆后送生物公司測序。測序結(jié)果與NCBI上已知的結(jié)果進(jìn)行BLAST比對，與長嶺發(fā)墊刃線蟲（T.changlingensis）序列相似度應(yīng)在99%以上。參見附錄C。92DB23/T2989—2021附錄A（資料性）玉米線蟲矮化病病原田間取樣調(diào)查表A.1玉米線蟲矮化病病原田間取樣調(diào)查表參見表A.1。表A.1玉米線蟲矮化病病原田間取樣調(diào)查表玉米植株?duì)顩r（1矮化、時間樣品編號取樣地點(diǎn)備注2葉片失綠、3莖基部開裂）3DB23/T2989—2021附錄B（資料性）線蟲形態(tài)特征測計(jì)值B.1線蟲形態(tài)特征測計(jì)值參見表B.1。表B.1線蟲形態(tài)特征測計(jì)值測量指標(biāo)雌蟲雄蟲n1313L（μm）861.4～1032.933.2～38.15.7～6.9820.5～993.131.8～38.65.3～5.811.3～15.93.1～4.3abc13.1～16.22.9～3.5c'V43.5～58.226.1～28.92.0～4.9St（μm）DGO（μm）T（μm）R25.4～28.155.6～77.157.2～73.830～4024.1～31.09.0～16.14DB23/T2989—2021附錄C（資料性）長嶺發(fā)墊刃線