等電點(diǎn)沉淀法第三節(jié)第二章固相析出技術(shù)第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法一、

等電點(diǎn)沉淀法原理

等電點(diǎn)沉淀的定義：利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的特性，向含有目的藥物成分的混合液中加入酸或堿，調(diào)節(jié)其pH，是蛋白質(zhì)沉淀析出的方法，稱為等電點(diǎn)沉淀法。

等電點(diǎn)沉淀可以單獨(dú)使用，也可以和鹽析法、有機(jī)溶劑法以及其他沉淀法一起使用，提高沉淀的效果。

既可用于生化物質(zhì)的提取，也可用于去除雜蛋白二、等電點(diǎn)沉淀等電點(diǎn)(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零時(shí)介質(zhì)的pH值，溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時(shí)溶質(zhì)的溶解度最低。在等電點(diǎn)時(shí)，許多物理性質(zhì)如黏度、膨脹性、滲透壓都變小，有利于懸浮液的過濾。一、

等電點(diǎn)沉淀法原理第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法

等電點(diǎn)沉淀法的操作條件：

①低離子濃度的溶液；pH=pI；大部分蛋白質(zhì)等電點(diǎn)是在偏酸性范圍，所以操作中可以加入無機(jī)酸調(diào)節(jié)pH。②適用于疏水性強(qiáng)的蛋白質(zhì)；應(yīng)用實(shí)例工業(yè)生產(chǎn)胰島素（pH5.3）時(shí)，先調(diào)節(jié)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)節(jié)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)，同時(shí)配合其他沉淀技術(shù)以提高沉淀效果。二、等電點(diǎn)沉淀法操作③通常與鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法等聯(lián)合使用。5實(shí)例①從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì)(pI=3．O)。工業(yè)生產(chǎn)胰島素(pI＝5.3)時(shí)，先調(diào)pH至8.0除去堿性蛋白質(zhì)，再調(diào)pH至3.0除去酸性蛋白質(zhì)(同時(shí)加入一定濃度的有機(jī)溶劑以提高沉淀效果)。②堿性磷酸酯酶的pI沉淀提?。喊l(fā)酵液調(diào)pH4.0后出現(xiàn)含堿性磷酸酯酶的沉淀物，離心收集沉淀物。用pH9.0的0.1mol/LTris-HCl緩沖液重新溶解，加入20～40%飽和度的硫酸銨分級，離心收集的沉淀Tris-HCl緩沖液再次沉淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法不同蛋白質(zhì)具有不同等電點(diǎn)

目的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)比較高，可以先調(diào)至低于等電點(diǎn)的雜蛋白。比如：細(xì)胞色素C的等電點(diǎn)為10.7，調(diào)節(jié)pH=6.0除去酸性蛋白，再調(diào)pH為7.5-8.0除去酸性蛋白。2.同一種蛋白質(zhì)在不同條件下等電點(diǎn)不同由于無機(jī)離子的影響，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)通常會發(fā)生“漂移”。

陽-高，陰-低。三、等電點(diǎn)沉淀法的操作注意事項(xiàng)第三節(jié)等電點(diǎn)沉淀法3.目的藥物成分對pH的要求盡可能避免直接用強(qiáng)酸強(qiáng)堿；

盡量不引入新的物質(zhì)；4.考慮采用幾種方法結(jié)合來實(shí)現(xiàn)沉淀分離三、等電點(diǎn)沉淀法的操作注意事項(xiàng)應(yīng)用在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。等電點(diǎn)沉淀只適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)(pH=5.4)附近，難溶于水，能產(chǎn)生沉析；疏水性較大的蛋白質(zhì)（如酪蛋白）可以與其他沉淀方法結(jié)合使用應(yīng)用實(shí)例等電點(diǎn)沉淀法分離牛乳中的酪蛋白材料鮮牛奶醋酸鈉、優(yōu)級純醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸餾水、0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸鈉緩沖液等電點(diǎn)沉淀法分離牛乳中的酪蛋白將鮮牛奶30mL及醋酸-醋酸鈉緩沖液30mL分別水浴加熱40℃左右，并用8層紗布過濾牛奶量取加熱后的牛奶20ml，在攪拌下慢慢加入加熱后的醋酸-醋酸鈉緩沖液20ml，用酸度計(jì)調(diào)pH至4.7將上述混合液冷至室溫，離心（3500r/min）15min，棄去上清液，得酪蛋白粗制品用緩沖液洗沉淀3次，離心（3500r/min）10min，棄去上清液在沉淀中加入20ml乙