藻類光生物學(xué)試驗(yàn)室新生培訓(xùn)手冊(cè)

歡迎各位新生來(lái)到藻類光生物學(xué)試驗(yàn)室，在這里你們將度過(guò)你們碩士生涯。為了

使你們立即融入試驗(yàn)室這個(gè)大家庭，為了使你們以后能夠愈加好進(jìn)行科學(xué)研究,

本試驗(yàn)室將對(duì)全部來(lái)到這里新生進(jìn)行為期2周培訓(xùn)，期望大家能夠主動(dòng)參與，

enjoyit!

【培訓(xùn)內(nèi)容】

?了解試驗(yàn)室規(guī)章制度及碩士須知

?掌握基礎(chǔ)試驗(yàn)技術(shù)

?培訓(xùn)總結(jié)

一了解試驗(yàn)室規(guī)章制度及碩士須知

為了使試驗(yàn)室能夠高效、有序運(yùn)轉(zhuǎn)，藻類光生物學(xué)試驗(yàn)室制訂了自己試驗(yàn)室

規(guī)章制度，每位在這個(gè)試驗(yàn)室學(xué)習(xí)工作人員全部必需遵守這些規(guī)章制度，同時(shí),

各位碩士還需要遵守碩士守則，以確保自己能夠順利畢業(yè)。

培訓(xùn)方法：譽(yù)錄并熟知相關(guān)規(guī)則。

培訓(xùn)時(shí)間：入學(xué)第一周第一天

二掌握基礎(chǔ)試驗(yàn)技術(shù)

為了能夠進(jìn)行科學(xué)研究，部分基礎(chǔ)試驗(yàn)技術(shù)掌握是必需，新生將在試驗(yàn)室技

術(shù)人員指導(dǎo)下對(duì)試驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行熟練操作、掌握。以下是藻類光生物學(xué)試驗(yàn)室必需

掌握試驗(yàn)技術(shù)，新生在進(jìn)行實(shí)際操作前，必需先對(duì)試驗(yàn)原理及步驟進(jìn)行預(yù)習(xí)。

培訓(xùn)時(shí)間：開學(xué)第一、二周

1.海水二氧化碳系統(tǒng)各分量計(jì)算：

氣態(tài)C02溶入海水后，首先服從亨利定律(在一定溫度下，氣體在液體中飽和濃

度和液面上該氣體平衡分壓成正比)：CO2(g)--CO2(aq),所以CO2平衡溶解

度［C02］和C02平衡分壓pCO2之間線性關(guān)系可表示為［CO2］(aq)=KH*pCO2,KH

是海水中二氧化碳溶解度系數(shù)和溫度、鹽度和壓力相關(guān);其次,C02還和水反應(yīng)生

成碳酸,CO2+H2O-H2CO3,然后，H2c03分兩步電離

H2c03-"-H++HCO3—K2?一CO32-+2H+

Ki'=aH+[HC03]/[H2co3](1)

,=2

K2aH+[CO3]/[HCO3](2)

KI'、K2'、分別是碳酸第1.第2表觀解離常數(shù)，

-2

其中[HC03]+2[CO3]=AC(3)

Ac為碳酸鹽總堿度，它跟海水總堿度(AT)有以下關(guān)系：Au=AT-2.206X10-5

XCl%0xKB'/(KB,+aH+)

=AT-B

Cl%。是海水氯度,KB'是硼酸解離常數(shù)

當(dāng)海水溫度、鹽度確定時(shí)，KH、Kl\K2'、B值全部可查表得到，這么經(jīng)過(guò)

測(cè)定海水pH和總堿度，按下列方程即可計(jì)算碳酸鹽體系各組分(HC03-、CO32-、

C02*、EC02)濃度和pC02。

由公式(1)(2)和(3)可得碳酸系統(tǒng)各組分計(jì)算公式：

[HCO3-]=AC/(1+2K2'/aH+)

2,

[CO3]=Acx(K2/aH+)/(l+2K27aH+)

[CO2*]=(AcXan^r)/(1+2Ka7aH+)

_-

ICO2=IHCO3J+[CO?]+[CO2*]

=Acx[(l+K:7aH++aH+/Ki')/(l+2K27an+)

pCO2=[CO2*]/KH

因?yàn)楹Ｋ蠧O2(aq)和H2CO3是無(wú)法區(qū)分，所以用(202*表示二者總和，

以上各參數(shù)計(jì)算在軟件CO.SY.完.(By：

Lewis.E..an.D.W.R.Wallace.l998.Progra.Develope.fo.CO.Syste.Calculations.ORNL/

CDlAC-l()5.Carbo.Dioxid.lnfonnatio.Analysi.Center.Oa.Ridg.Nationa.Laboratory.U.

S.Departmen.o.Energy.Oa.Ridge.Tennessee.)?

計(jì)算題：當(dāng)溫度是10℃時(shí)，pH值為8.3海水總堿度為2.5X10-3moi/L,鹽度是

31%。，查表得B值為8X10-5mol/L,C02溶解系數(shù)為4.621X10-2moI/L/atm,

pK1J和pK2'分別是5.98和9.10,求海水中多種DIC組分含量。

2細(xì)胞色素定量

2.1葉綠素a(chla)^葉綠素c(chic)和類胡蘿卜素

【試驗(yàn)原理】

依據(jù)chia甲醇提取液在665nm處有最大吸收峰，利用分光光度計(jì)法測(cè)定chia

含量。

【試驗(yàn)步驟】

1)將藻體置于一定量甲醇中，放置于4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜處理。

2)1500g離心lOmin,取上清，用分光光度計(jì)測(cè)定其在750、665、6520D值。

3)根據(jù)Porra提供公式,[Chia](ug/ml)=16.29*(A665-A750)-8.54*

(A652-A750),計(jì)算其含量。

采取Jeffrey&Haxo公式計(jì)算chic含量：

chlc(pg/ml)=67.3xA635-14.1xA668

A635和A668代表波長(zhǎng)為635和668吸收值。

采取Strickland&Parsons公式計(jì)算類胡蘿卜素含量：

Carotenoids(pg/m1)=7.6*[(A480—A750)-1.49*(A5io—A750)]

2.2藻紅(PE)和藻藍(lán)蛋白(PC)

1)取約為0.2g藻體，在研缽內(nèi)加入一定量石英砂和少許磷酸緩沖液(pH

=6.8)將藻體研碎,

2)加約10ml磷酸緩沖液10000r/min離心10分鐘，取上清液，將沉淀物

繼續(xù)研磨，并反復(fù)上面步驟，

3)最終將溶液定容為25ml,然后用分光光度計(jì)測(cè)定A455、A564、分92>A618和

A645值。PE和PC含量按下列公式計(jì)算：

[PE]=[(A564-A592)-(A455-A592)*0.2]/0.12

[PC]=[(A618-A645)-(A592-A645)*0.5l]/0.15

注意事項(xiàng)：1.藻體研磨要盡可能充足，直至離心沉淀物基礎(chǔ)無(wú)顏色。

計(jì)算題：已知培養(yǎng)液中藻體濃度是105cells/ml,取10ml培養(yǎng)液，離心，用

5ml甲醇過(guò)夜處理后，離心取上清，測(cè)得其在750、665.652OD值分別是

0.001.0.0082.0.0026,求單位細(xì)胞藻體中葉綠素含量。

問(wèn)答題.1.為何在測(cè)定葉綠素定量或掃描吸收光譜時(shí)，通常需要測(cè)定750nm

吸光值？

2.色素定量公式較多，采取不一樣計(jì)算公式，驗(yàn)證差異大小。

3.色素提取，是定量關(guān)鍵.怎樣確定提取是完全.對(duì)于組織結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)藻體，

需將其研磨碎后提取.應(yīng)注意那些步驟？

3.光合作用速率測(cè)定

3.1C14測(cè)定方法

【試驗(yàn)原理】

浮游植物光合固碳速率（初級(jí)生產(chǎn)力）依據(jù)SteemanNielsen（1952）發(fā)明14C

同位素標(biāo)識(shí)法來(lái)進(jìn)行測(cè)定。浮游植物進(jìn)行光合作用需要固定海水中無(wú)機(jī)碳（D1C）,

海水中碳元素是以HCO3-、CO32-、CO2和H2c03等形式存在，它們之間存在

動(dòng)態(tài)平衡，能夠相互轉(zhuǎn)化，這么當(dāng)加入Hl4c03-時(shí)，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)以后，經(jīng)過(guò)液為計(jì)

數(shù)能夠計(jì)算浮游植物固定了多少14C,再乘以溶液中DIC和Hl4c03-百分比，能

夠推算浮游植物總共固定了多少DICo

【試驗(yàn)步驟】

1）進(jìn)行光合固碳速率測(cè)定時(shí)，將取得水樣用180|am孔徑篩絹濾去浮游動(dòng)物，分裝

到體積為20ml石英管中。

2）然后用連續(xù)加樣器（eppendorf）吸收一定體積14c液體，按每管1（）0"（放射

活度為5PCi）加樣置加入，蓋上塞子搖勻后到室外接收陽(yáng)光照射（或在太陽(yáng)模擬

器下）。

3）石英管蓋上或包裹上不一樣膜以接收不一樣陽(yáng)光輻射處理，膜類型因試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

不一樣而不一樣，培養(yǎng)過(guò)程中用流水水浴控溫（當(dāng)以模擬器為光源時(shí)，用空調(diào)控

溫），范圍為±2℃,培養(yǎng)時(shí)間通常最少4小時(shí)。

4）培養(yǎng)完成后將石英管拿回試驗(yàn)室內(nèi)，每個(gè)石英管中水樣過(guò)濾到一張GF/F直徑

為25mm玻璃纖維濾膜上，然后放入20ml液閃瓶中。

5）最終將液閃瓶連同濾膜一起放入到一個(gè)密閉塑料盒中，同時(shí)在盒中放一小瓶約

15ml濃鹽酸過(guò)夜，利用濃鹽酸形成酸霧將濾膜上未被浮游植物利用無(wú)機(jī)14C（即

NaH14CO3）轉(zhuǎn)化為氣體形式去除。

6）第二天將液閃瓶取出放入45c烘箱中烘干，儲(chǔ)存。

7）每個(gè)液閃瓶中加入閃爍液（OptiphaseHisafe3）3ml。

8）放置2-3h后,置于液體閃爍計(jì)數(shù)儀（ScintillationCounter,BeckmanCoulter,

LS6500）中測(cè)定。

浮游植物固碳量用下列公式計(jì)算：

|igC/L=[（CPML-CPMD）/Ce]xIfxDIC/A

CPML為接收陽(yáng)光輻射處理樣品中被固定放射性物質(zhì)放射量（每分鐘計(jì)數(shù)數(shù)目）；

CPMD為對(duì)照樣品（暗瓶）中被固定放射性物質(zhì)放射量；

Ce為計(jì)數(shù)效率，液閃計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)效率經(jīng)過(guò)測(cè)定14c標(biāo)準(zhǔn)樣品取得；

If為同位素差異因子，在C02固定過(guò)程中，細(xì)胞對(duì)14c和12c利用率存在差異，12C

和14c相比，其同化率快6%,故If為1.06；

DIC為培養(yǎng)液總?cè)芙鉄o(wú)機(jī)碳濃度；

6

A為所加14c每分鐘裂變數(shù)（DPM）（等于所加14c活度（PCi）X2.2X10）；

固碳速率（pgC（Mgchia）/h”由該固碳最除以葉綠素濃度及培養(yǎng)時(shí)間得到。

【注意事項(xiàng)】：

1）因?yàn)镹aHl4c03在溶液中是一個(gè)平衡體系，所以樣品盡可能保留在低溫下（4oC）

以預(yù)防溶液中C02氣體揮發(fā)，污染環(huán)境并影響測(cè)定結(jié)果。

2）使用C-14進(jìn)行試驗(yàn)操作時(shí)盡可能遠(yuǎn)離，盡可能少呆在有污染空間內(nèi)，并保持

操作空間通風(fēng)良好，以盡可能降低呼吸吸入造成內(nèi)輻射。

3）樣品處理是關(guān)鍵，不然會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，甚至看到試驗(yàn)現(xiàn)象為假象。得到樣品

酸化一定要充足（酸不能反復(fù)使用，通常2-3次就要更換；酸化時(shí)間足夠，通常酸化過(guò)

夜）；野外試驗(yàn)時(shí)，酸化后樣品通常要烘干（或-20oC）保留，烘干溫度不能超出

60oC（50-60oC）,烘干時(shí)間>6h。樣品帶回試驗(yàn)室測(cè)定時(shí)，加入閃爍液后最好放置2~3h

后測(cè)定，方便使樣品充足消化，然后再進(jìn)行計(jì)數(shù)。

4）加入CI4量和葉綠素濃度關(guān)系（參考數(shù)值）:

<0.1pgchla/L加lOgCi；

0.1?5pgchla/L加5pCi；

>5ggchla/L力口1pCi

5)14C(AmershambioscienceUKLimited),為NaH14CO3濃縮液(12.5ml,

總活度25mCi即2mCi，ml)，使用前稀釋到50|jCi/ml。具體操作為：先用一般濾

紙預(yù)先過(guò)濾一定體積海水，再用直徑50mm孔徑0.4714m微孔濾膜反復(fù)過(guò)濾，為

預(yù)防在接下來(lái)滅菌過(guò)程中海水發(fā)生結(jié)晶，加蒸儲(chǔ)水將其稀釋到80%,然后用此

80%海水將NaH14CO3濃縮液稀釋，115c下滅菌20分鐘，保留于4℃冰箱中備

用。

計(jì)算題：在20ml海水中加入5口CiC-14,培養(yǎng)6小時(shí)后，過(guò)濾、酸化、烘干、

加入液閃計(jì)數(shù)，到得數(shù)值是CPML是9754.4,CPMD是1034.8,已知液閃計(jì)數(shù)儀

計(jì)數(shù)效率為0.96,海水中葉綠素濃度為0.32ug/L,DIC濃度為2.2mM,求海水中

浮游植物固碳速率(|jgC(pgchia)-lh-l)o

3.2氧電極法(開放系統(tǒng)法，封閉系統(tǒng)法，原理和測(cè)CO2一樣，見下)

測(cè)定一段時(shí)間反應(yīng)槽中溶解氧濃度改變，依據(jù)溶解氧濃度改變、引發(fā)改變所需要

時(shí)間和反應(yīng)槽容積能夠計(jì)算光合作用速率。

【注意事項(xiàng)】

1)需要保持溫度恒定，并進(jìn)行攪拌。

通常測(cè)定是在封閉系統(tǒng)中完成，所以反應(yīng)容器中溶解氧濃度隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而

增大，考慮到氧氣對(duì)光合作用阻礙作用，需要按時(shí)用氮?dú)獬錃?，使得反?yīng)液中溶

解氧濃度不超出30%,反應(yīng)器中細(xì)胞濃度不能過(guò)高。

大型海藻光合作用應(yīng)該采取開放系統(tǒng)流水測(cè)定法，以消除“瓶效應(yīng)”。

3.2.1P-Ccurve測(cè)定

1)將細(xì)胞懸浮于無(wú)碳海水中后，取一定體積量注入反應(yīng)容器，在400umolm-2s-1

光強(qiáng)下，使細(xì)胞進(jìn)行光合作用

當(dāng)細(xì)胞體內(nèi)“CO2”耗竭(凈放氧速率為零)以后，添力口NaHCO3溶液，在多種

“C02”濃度下測(cè)定藻類光合作用速度。

Km(DIC或C02)依據(jù)Michaelis-Menten方程擬合求得:V=Vm*[S]/(Km+[S])

V:給定無(wú)機(jī)碳濃度下凈光合放氧速率

Vm:飽和無(wú)機(jī)碳濃度二凈光合放氧速率

[SJ:DIC或C02濃度

Km:達(dá)成最大光合速率（Vm）二分之一時(shí)無(wú)機(jī)碳（DIC或CO2）濃度

注意事項(xiàng)

1）無(wú)C02緩沖液配制不妥或藻類材料清洗不完全，全部會(huì)使得藻類光合放

氧達(dá)成零所需時(shí)間拉長(zhǎng)。這種情況下，細(xì)胞在強(qiáng)元照和低CO2濃度下輕易受損

傷，造成光合作用活性降低;同時(shí)也會(huì)增加細(xì)胞對(duì)低CO2濃度適應(yīng)性，影響光合

作用對(duì)C02親和程度判定。使細(xì)胞內(nèi)“C02”耗竭所需時(shí)間通常不能超出30min。

假如超出30min,應(yīng)該重新配制無(wú)CO2緩沖液和試驗(yàn)材料。

2）測(cè)定條件確實(shí)定

除了CO2以外影響光合作用速度關(guān)鍵因子有光照強(qiáng)度、光質(zhì)、溫度、溶

解氧濃度及水流等。所以，在測(cè)定某種藻類光合作用和CO2濃度關(guān)系之前.首先

需要確定光合作用速度飽和時(shí)光照強(qiáng)度，然后在此光照條件下確定其最適溫度。

在測(cè)定過(guò)程中，必需俁持光照和溫度條件恒定，進(jìn)行攪拌，在短時(shí)間內(nèi)完成測(cè)

定。通常測(cè)定是在封閉系統(tǒng)中進(jìn)行，所以反應(yīng)容器中溶解氧濃度伴隨時(shí)間延長(zhǎng)而

增大。為了取得含有可反復(fù)性、可靠數(shù)據(jù)，考慮到氧氣對(duì)光合作用阻礙作用，需

要按時(shí)用氮?dú)獬錃?，使得反?yīng)液中溶解氧濃度不超出30%。大型藻類光合作用能

夠采取開放系統(tǒng)流水測(cè)定法川。用此方法進(jìn)行光合作用測(cè)定時(shí)，新鮮海水不停地

流過(guò)藻體，不易發(fā)生“瓶效應(yīng)”（封閉系統(tǒng)測(cè)定時(shí)氧濃度增高、無(wú)機(jī)碳濃度降低等

造成光合作用低下現(xiàn)象）。

3）無(wú)CO2緩沖液（反應(yīng)液）配制

通常將含有緩沖作用培養(yǎng)液作為光合作用測(cè)定時(shí)反應(yīng)液。假如測(cè)定能在短時(shí)間內(nèi)

完成話，只用緩沖液作為反應(yīng)液也能夠。無(wú)CO2（CO2-free）緩沖液在調(diào)配多種

CO2濃度反應(yīng)液時(shí)是必需。測(cè)定海產(chǎn)藻類時(shí)用低濃度鹽酸將海水處理到酸性

（pH<5）,將HCO3-和832-離子轉(zhuǎn)化為CO2后，再以N2充氣將CO2驅(qū)出水面。

充N2時(shí)間控制在10-20min就行，水量多時(shí)可合適延長(zhǎng)。將海水中CO2除掉以

后，邊充氮?dú)?，邊向海水中添加緩沖劑，再以NaOH溶液（將過(guò)飽和NaOH溶液用

帶密封蓋子離心管離心，離心后取上清液作為無(wú)CO2NaOH溶液）調(diào)整pH。喊性

溶液中通常溶解有很多CO32-,但在過(guò)飽和NaOH溶液中“CO2”在離心時(shí)沉淀

下去。測(cè)定淡水藻類可直接用N2向蒸播水充氣，驅(qū)逐蒸鐳水中少許“CO2”，然

后如上所述，邊充氣、宛拌邊添加緩沖劑，最終以NaOH溶液調(diào)整pH。因?yàn)檎{(diào)配

好緩沖液中還會(huì)有極少許CO2溶入，所以最好用吸氣器再進(jìn)行脫氣。

光合作用測(cè)定時(shí)反應(yīng)液，通常使用濃度為25-50mmol/L緩沖液(依據(jù)設(shè)定pH值

不一樣，選擇MES,HEPES,Bis-Tris-Propane,Triuine,PIPES等)。這些緩沖

液均不被細(xì)胞吸收，所以對(duì)細(xì)胞生理活性不產(chǎn)生影響。

3.2.2P-Icurve測(cè)定

經(jīng)過(guò)調(diào)整光源和反應(yīng)槽距離而取得不一樣水平光照強(qiáng)度(0,50,100,300,600,900

umol?m-2?s-1),光照強(qiáng)度用光量子計(jì)測(cè)定。

在P—I曲線中，最大凈光合速率(Pmax)、暗呼吸速率(Rd)從曲線中直接讀出，光

合效率(a)是P-I曲線初始斜率(即光合作用在光限制部分斜率)。光賠償點(diǎn)及光飽

和點(diǎn)計(jì)算公式為：1c=-Rd/a,Ik=(Pmax+Rd)/a(Henley1993)。

3.3紅外氣體分析法

開放系統(tǒng)法：用葉室分析儀開放氣路系統(tǒng)法測(cè)定大型海藻在空氣中CO2吸

收速率。測(cè)定時(shí)所采取溫度水平經(jīng)過(guò)調(diào)整空調(diào)房中溫度而控制(在分析儀上能夠

顯示葉室中藻體溫度)。測(cè)定呼吸速率時(shí)使葉室處于黑暗之中。依據(jù)光合儀上“△

C”值(氣路經(jīng)過(guò)葉室所造成CO2濃度差)及所用藻量(最終干重)和氣流量而計(jì)

算光合(或呼吸)速率。其計(jì)算公式為：Pn=ACXFX60X273/[(273+T)X22.4X

DWJ,其中F表示氣體流速(Lmin-1);T為光合反應(yīng)溫度(oC);DW為藻樣干重

(g)o

計(jì)算題：從海水中取一片藻體，吸干其表面水分稱得其重量是o.7g,放入葉

室分析儀測(cè)其光合作用速率，維持環(huán)境溫度為25oC,在一定光強(qiáng)條件下，其恒

定AC為40ppM,氣體流速為0.2L/min,求該藻體光合作用速率(PmoleC

g-l(d.w.)h-l),已知該海藻干濕比為1:7o

4微藻常見培養(yǎng)法

4.1分批培養(yǎng)(batchculture)

在一個(gè)相對(duì)獨(dú)立密閉系統(tǒng)中，一次性投入培養(yǎng)基對(duì)微生物進(jìn)行接種培養(yǎng)方法通常稱

為分批培養(yǎng)(batchculture)o因?yàn)樗囵B(yǎng)系統(tǒng)相對(duì)密閉性，故分批培養(yǎng)也叫密閉培

養(yǎng)(closedculture)。

分批培養(yǎng)特點(diǎn)：

1)操作簡(jiǎn)單。培養(yǎng)系統(tǒng)屬丁封閉式，培養(yǎng)過(guò)程中除了控制溫度和光強(qiáng)外，不進(jìn)行其

它任何控制。

2)直觀反應(yīng)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝過(guò)程。分批培養(yǎng)中，細(xì)胞生長(zhǎng)分為4個(gè)階段：遲緩期，對(duì)數(shù)

期、穩(wěn)定時(shí)及衰亡期。

3)培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變風(fēng)險(xiǎn)小。

4.2半連續(xù)式培養(yǎng)(semi-continuousculture)

半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為反復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，在細(xì)胞增加和產(chǎn)物形成過(guò)程中,

每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新培養(yǎng)液補(bǔ)充，使維持細(xì)胞濃度恒定

或培養(yǎng)液總體積不變。

半連續(xù)培養(yǎng)特點(diǎn)：

1)細(xì)胞可連續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高濃度水平，培養(yǎng)過(guò)程可延續(xù)

到很長(zhǎng)時(shí)間。

2)可進(jìn)行數(shù)次收獲。

5常見培養(yǎng)基配置

5.1f/2Medium

f/2Medium

(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)

向950mLCompoundStockSolutionMolarConcentration

過(guò)濾海水inFinalMedium

中加入下

列物質(zhì)：

Quantity

8.83x104M

1mLNaNOa75g/LdH2O

3.63xIO5M

1mLNaH2Po4-H2O5g/LdH2O

1.07x104M*

1mL*Na2SiO3?9H2O*30g/LCIH2O*

1mLf/2tracemetal(seerecipebelow)-

solution

0.5mLf/2vitamin(seerecipebelow)-

solution

加過(guò)淀海水直到最終體積為1L,高壓滅菌。

注意：高壓滅菌事會(huì)產(chǎn)生大量硅沉淀，所以，當(dāng)藻類不需要硅時(shí)能夠不添加硅元

素0

f/2TraceMetalSolution

(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)

向950mL蒸儲(chǔ)水中加入下列物質(zhì):

QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentration

inFinalMedium

3.15gFeCh?6H2O-1x10-5M

1xIO"

4.36gNa2EDTA?2H2O-M

4xIO。

1mLCUSO4-5H2O9.8g/LdH:OM

1mLNa2Mo04?2H2O6.3g/LCIH2O3xIO*M

8x1()8M

1mLZnSO4-7H2O22.0g/LdH2O

5xIO*M

1mLCOCI26H2O10.0g/LdH2O

9xIO：M

1mLMnCh-4H2O180.()g/LdH2O

加蒸饋水至最終體積為1L,高壓滅菌。

f/2VitaminSolution

(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)

向950CompoundStockSolutionMolar

mL蒸饋Concentrationin

水中加FinalMedium

入下列

物質(zhì)：

Quantity

1mLVitaminB121.0g/LdH2O1x10/°M

(cyanocobalamin)

9

10mLBiotin0.1g/LdH2O2xIO-M

200mgThiamine-HC1-3xIO,M

加蒸館水至最終體積為1L,4℃保留。

注意：因?yàn)榫S生素B12和生物素是以結(jié)晶形式存在，所以在配制母液時(shí)候，Img

維生素B12只需加0.89mLdH20,Img生物素只需加9.6mLdH2Oo

5.2KMedium

.Mediu.

(Kelle.e.al.1987)

向950CompoundStockSolutionMolarConcentration

mL過(guò)濾inFinalMedium

海水中

加入下

列物質(zhì)：

Quantity

4

1mLNaNCh75g/LdH2O8.83x10-M

1mLNIUCl2.68g/LdlkO3.63x10-5M

1x10-5

1mLbeta-glycerophosphate2.16g/LdH2OM

4

1mL*Na2SiO3?9H2O.3()g/LdHzO”1.07xIOM*

1mLHoSeOs1.29mg/LdH2O1x108M

1X1()-3M

1mLTris-base(pH7.2)121.1g/LdH2O

1mLKtracemetalsolution(seerecipebelow)-

0.5mLf/2vitaminsolution(secrecipebelow)-

加過(guò)濾海水直到最終體積為1L、高壓滅菌。

.Trac.Meta.Solution

(Kelle.e.al.1987)

向900mL蒸儲(chǔ)水中加入下列物質(zhì):

QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationin

FinalMedium

-4

41.6gNa2EDTA?2H2O1xIOM

3.15gFeCh-6H2O-1xIO"M

1mLNa2MoCU2H2O6.3g/LCIH2O1x10*M

1mLZnSO4-7H2O22.()g/LdH2O1x1()-9M

1mLCOCI26H2O10.0g/LCIH2O1X10-9M

1mLMnCh-4H2O180.0g/LdH2O1x1()-8M

1mLCUSO4-5H2O9.8g/LCIH2O1x108M

加蒸儲(chǔ)水至最終體積為1L,高壓滅菌。

f/2VitaminSolution

(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)

向950CompoundStockMolar

mL蒸儲(chǔ)SolutionConcentrationin

水中加FinalMedium

入下列

物質(zhì)：

Quantity

1mLVitaminB121g/LdHoO1x10-10M

|(cyanocobalamin)

_______________________

10mLBiotin().1g/LdthO1x10-9M

200mgThiamine-HC1-11x10"M

加蒸儲(chǔ)水至最終體積為1L,過(guò)濾消毒到塑料瓶中、4℃保留。

注意：因?yàn)榫S生素B12和生物素是以結(jié)晶形式存在，所以在配制母液時(shí)候，Img

維生素B12只需加0.89mLdH2O,Img生物素只需加9.6mLdH2O。

三培訓(xùn)總結(jié)

經(jīng)過(guò)座談或書面方法，總結(jié)這次培訓(xùn)所得及感受，歡迎對(duì)培訓(xùn)提出建設(shè)性意

見。

時(shí)間：開學(xué)第二周最終一天

6.葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)

葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)（chlorophyllfluorescencedynamics）技術(shù)被稱為研究植物光合

功效快速、無(wú)損傷探針。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)技術(shù)在測(cè)定植物光合作用過(guò)程中光系

統(tǒng)對(duì)光能吸收、傳輸、耗散、分配等方面含有獨(dú)特作用，和“表觀性”氣體交換

指標(biāo)相比，葉綠素?zé)晒鈪?shù)更含有反應(yīng)“內(nèi)在性”特點(diǎn)。

葉綠素?zé)晒夥治龊杏^察手續(xù)簡(jiǎn)便，取得結(jié)果快速，反應(yīng)靈敏，能夠定量，對(duì)植

物無(wú)破壞，少干擾等特點(diǎn)。它既能夠用于葉綠體、葉片和藻類，也能夠遙感用于

群體、群落。它既是室內(nèi)光合作用基礎(chǔ)研究?jī)?yōu)異工具，更是室外自然條件下診療

植物體內(nèi)光合機(jī)構(gòu)運(yùn)轉(zhuǎn)情況、分析植物對(duì)逆境響應(yīng)機(jī)理關(guān)鍵方法。

葉綠素?zé)晒夂凸夂献饔媚芰哭D(zhuǎn)換效率之間有著清楚定量關(guān)系，而且這種關(guān)系并

不復(fù)雜，基礎(chǔ)法則很簡(jiǎn)單，符合能量守恒定律和愛(ài)因斯坦能量方程。當(dāng)光被葉綠

素分子吸收后，葉綠素分子由基態(tài)（低能態(tài)）躍遷到激發(fā)態(tài)（高能態(tài)）。激發(fā)態(tài)

很不穩(wěn)定，會(huì)釋放能量回到基態(tài)。激發(fā)態(tài)分子釋放能量方法有3種：進(jìn)行光合作

用(光化學(xué)反應(yīng))、發(fā)出熒光和以熱形式耗散掉°依據(jù)能量守恒定律，三者有以

下關(guān)系：

熒光+光化學(xué)+熱=1

qI.WALZ

ALAL

光化學(xué)淬滅可以被一種短飽和脈沖光(0.2-18)暫時(shí)完全抑制,

剩余的熒光淬滅就是非光化學(xué)淬滅

F0:初始熒光，也稱基礎(chǔ)熒光，是在暗適應(yīng)狀態(tài)下當(dāng)PS1I全部反應(yīng)中心處于完全

開放狀態(tài)(qp=l)而且全部非光化學(xué)過(guò)程處于最小時(shí)(qn=0)時(shí)熒光產(chǎn)量。

Fm:最大熒光，是在暗適應(yīng)狀態(tài)下當(dāng)PSII全部反應(yīng)中心處于關(guān)閉狀態(tài)(qp=0)

而且全部非光化學(xué)過(guò)程處于最小時(shí)(qn=0)時(shí)熒光產(chǎn)量。

Fv：暗適應(yīng)狀態(tài)下當(dāng)全部非光化學(xué)過(guò)程處于最小時(shí)最大可變熒光,Fv=Fm-Fo

Fm'在光適應(yīng)狀態(tài)下當(dāng)PSH全部反應(yīng)中心處于關(guān)閉狀態(tài)(qp=0)而且全部非光

化學(xué)過(guò)程處于最優(yōu)時(shí)(qn>0)時(shí)熒光產(chǎn)量。

Fo'在光適應(yīng)狀態(tài)下當(dāng)PSI1全部反應(yīng)中心處于開放狀態(tài)（qp=l）而且全部非光

化學(xué)過(guò)程處于最優(yōu)時(shí)（qn>0）時(shí)熒光產(chǎn)量。

Fv/Fm是PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，又叫原初光化學(xué)最大產(chǎn)量、PSII光化學(xué)反應(yīng)

潛在產(chǎn)量、psn潛在最大量子產(chǎn)量等，它反應(yīng)是當(dāng)全部psil反應(yīng)中心均處于開放

狀態(tài)時(shí)量子產(chǎn)量。當(dāng)藻類或植物受到脅迫時(shí),Fv/Fm顯著下降。所以,Fv/Fm是研

究光抑制或多種環(huán)境脅迫對(duì)光合作用影響關(guān)鍵指標(biāo)。

Fv'/Fm'是PSII光化學(xué)有效量子產(chǎn)量，代表激發(fā)能被開放反應(yīng)中心捕捉效率，它

定量了因?yàn)闊岷纳⒏?jìng)爭(zhēng)作用而造成PSII光化學(xué)被限制程度。因?yàn)樵诠膺m應(yīng)狀態(tài)

下非光化學(xué)過(guò)程到活化，所以Fv'/Fm'往往小于Fv/Fm

任何使熒光從其最大值下降過(guò)程均可稱之為熒光淬滅，熒光淬滅程度通常見淬

滅系數(shù)q（0〈q〈l）來(lái)表示。葉綠素?zé)晒獯銣缤ǔ７譃楣饣瘜W(xué)淬滅（qn）和非

光化學(xué)淬滅（qn或NPQ）

6.1Xe-PAM操作步驟：

1.在電腦上雙擊Wincont軟件進(jìn)入操作界面；

2.將樣品加入樣品池，放入樣品槽，依據(jù)Ft值（300-500）設(shè)置

PAM-gain,取出樣品池（或樣品池中加入?yún)⒈纫海缗囵B(yǎng)基濾液等）

點(diǎn)擊Auto-zero,試驗(yàn)過(guò)程中不管改動(dòng)什么參數(shù)，測(cè)量前全部需自動(dòng)

調(diào)零，依據(jù)需要在設(shè)置窗內(nèi)設(shè)置對(duì)應(yīng)參數(shù)（能夠保留方便下次使用）;

3.暗適應(yīng)樣品要想取得Fv/Fm,需關(guān)鍵點(diǎn)擊界面右側(cè)參數(shù)區(qū)Fm按鈕,

然后點(diǎn)擊SAT-Pulse按鈕取得對(duì)應(yīng)Yield值；

4.一樣在Lightcurve,Inducedcurve界面取得對(duì)應(yīng)曲線。

6.2GFS?3000F操作步驟：

1)使用前需對(duì)分析器進(jìn)行校準(zhǔn)：需聯(lián)機(jī)對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，參閱說(shuō)明書。當(dāng)

|dCO2|>2ppm時(shí)需對(duì)CO2進(jìn)行校對(duì)零點(diǎn)；當(dāng)|dH2O|>20()ppm時(shí)需對(duì)H2O進(jìn)行

零點(diǎn)校對(duì)。假如使用頻率較多話，通常每隔1-2周需進(jìn)行零點(diǎn)校準(zhǔn)，可每隔3-5

個(gè)月進(jìn)行C02和H20span(最大值)校準(zhǔn)。

2)連接儀器。連接葉室和主機(jī)，連接時(shí)注意Bun和To管連接。連接進(jìn)氣管和

電源。

3)關(guān)閉葉室，開機(jī)。在菜單系統(tǒng)(System)下選擇打開測(cè)量模式(Measuremode

on),然后選擇標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量頭(Standardhead)或熒光附件(LED-Arry/PAM-

Module3()55-FL)。在測(cè)量模式(Measuremode)下預(yù)熱30?6()分鐘。

4)在菜單設(shè)置下進(jìn)行文件名和參數(shù)設(shè)定。首先設(shè)定文件名(Filename)。然后

設(shè)定流速(Flow),流速范圍600—900,氣體交換強(qiáng)度較小時(shí)流速值可設(shè)定低部

分，標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為750。設(shè)定流速以后，可設(shè)定CO2和H2O濃度。若利用環(huán)境大氣,

不需控制CO2濃度，則無(wú)須設(shè)定，而且須將CO2吸收管換為空管；控制CO2濃

度需先將CO2吸收管換上，同時(shí)安裝好CO2注入系統(tǒng)(小鋼瓶)；取消CO2設(shè)

定操作：選擇CO2,選OFF即可，未設(shè)定前顯示未CO2off。設(shè)定葉室風(fēng)扇速度，通

常設(shè)為5即可。以后能夠設(shè)定葉室溫度和光強(qiáng)。設(shè)定光強(qiáng)模式(LightMode),有

三種選擇：外界光強(qiáng)PARamb,葉片上部PARtop,葉片下部PARbottom,通常選

擇PARtop,然后按lighi設(shè)定光強(qiáng)。選擇葉室溫度控制模式(Tempmode):有三種

選擇：葉片溫度Tleaf,葉室溫度Tcuv,跟隨外界溫度FollowambientTemp,選擇

時(shí)輸入各模式前數(shù)字即可并接著設(shè)定對(duì)應(yīng)溫度。按>>翻頁(yè)，設(shè)定熒光參數(shù)，夾上

無(wú)熒光薄片進(jìn)行調(diào)零Z—offset;夾上暗適應(yīng)后葉片后調(diào)整測(cè)量光強(qiáng)度ML—Ampl

及Gain使得瞬時(shí)熒光值Ft在200—300之間；其它參數(shù)為默認(rèn)設(shè)定值即可。不

測(cè)定初始熒光Fo和Fm時(shí)無(wú)需設(shè)定。

5)將葉室關(guān)閉嚴(yán)實(shí)，觀察主機(jī)前面樣品室和參比室氣流指示器顯示流量是否相

等，在確定葉室已密閉但兩個(gè)指示器流量仍不相等，則需使用電腦聯(lián)機(jī)校準(zhǔn)氣流

直至流量相等(參考)。按窗口下部測(cè)量模式ModeMP即選為調(diào)零模式ModeZP,

在此模式卜進(jìn)行調(diào)零，約30min,選Windows中2charts,查看查看(1CO2ZP和

dH20ZP絕對(duì)值是否穩(wěn)定（均應(yīng)靠近直線）并趨近于零，調(diào)零結(jié)束后儲(chǔ)存調(diào)零結(jié)

果（實(shí)施StoreZPirga；假如一開始未設(shè)文件名儀器會(huì)提醒，需在settings卜.設(shè)文

件名）（注：WALZ企業(yè)提議每隔lh對(duì)儀器進(jìn)行一次調(diào)零以確保測(cè)得數(shù)據(jù)正

確）

6）按ModeZP選ModeMP,進(jìn)入測(cè)量模式，開始測(cè)定光合；在ModeMP狀態(tài)下,

在Wind5Vs中選sellings,下部常見多個(gè)操作選擇中將出現(xiàn)儲(chǔ)存葉室調(diào)零slure

ZPcuVo測(cè)定前需先選擇storeZPcuv進(jìn)行葉室調(diào)零（注：尤其是測(cè)定氣體交換量

很小時(shí)此操作需在每次加入下一個(gè)葉片前進(jìn)行一次），此時(shí)在不加葉片時(shí)，窗口

顯示光合值A(chǔ)/氣孔導(dǎo)度GH20應(yīng)靠近0。

7）設(shè)定樣品編號(hào)Object,將葉片夾入葉室中。若葉面積可充滿8cm葉室則不需更

改Area,不然全部需要重新輸入葉片實(shí)際面積，當(dāng)然也能夠測(cè)完后再確定了葉面

積并根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算。待各參數(shù)如凈光合A,氣孔導(dǎo)度GH2O等相對(duì)穩(wěn)定時(shí)就

能夠按開始儲(chǔ)存Startsloring進(jìn)行儲(chǔ)存數(shù)據(jù)了。在儲(chǔ)存之前可根據(jù)需要設(shè)定儲(chǔ)存時(shí)

間間隔Interval選擇。同時(shí)測(cè)定熒光參數(shù)時(shí)可按窗口下方常見操作中儲(chǔ)存測(cè)量值

及最大熒光效率StoreMP+Fv/Fm（需先暗適應(yīng)并俁持葉室黑暗），儲(chǔ)存測(cè)量值和

量子產(chǎn)額sioreMP+Yield.

8）更換葉片測(cè)量，關(guān)閉葉室后需觀察一下樣品室氣流流速指示位置是否和參比

室相平。

9）數(shù)據(jù)管理。經(jīng)過(guò)USB線聯(lián)機(jī)電腦，從系統(tǒng)菜單（System）下選擇文件傳輸File

transfer,然后選擇從GFS3000中輸出文件transferfilesfromGFS300,以后根據(jù)

提醒操作即可將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到電腦中。經(jīng)過(guò)操作菜單1（option］）下數(shù)據(jù)管理子菜

單（data-management）能夠刪除儲(chǔ)存卡中數(shù)據(jù)文件.

ZealquestWALZ

氣體交換概述

可控的參數(shù):I

20i

6HjO+6CO2

(0-100%rH)

C02濃度(0-3000ppm)

流速(0-1500umol/s)

通風(fēng)速度

可計(jì)算的參數(shù)：

同化速率

蒸騰速率

C02響應(yīng)曲線

光響應(yīng)曲線

氣孔導(dǎo)度

胞間C02j濃度9J

植物7K分利用效率葉片在測(cè)量芥室內(nèi)的分解圖

CFS.aooo⑺

ZealquestWALZ

GF$3000氣路簡(jiǎn)圖

Po

Xr-Flow

普1

C

法O

。HOCO

一MeasuringGas22

>-=.SampleSample

3P

.ReferenceReference

6I

UReferenceGas

UTAbsoluteAnalyzers

I

H7或?

第一步：

_€0^^-|€02control-開機(jī)，進(jìn)行設(shè)置。

-激活調(diào)零模式，等待002和H20值穩(wěn)定

-存儲(chǔ)氣路系統(tǒng)的調(diào)零值

圖示為調(diào)零模式：

?測(cè)?氣被排出

?參比氣體分成兩股，分別流經(jīng)裝有IRGA的參比室和樣品室,

Zealquest

GFS?3000氣路簡(jiǎn)圖片

H2OCO2

SampleSample

ReferenceReference2

GasAnalyzers

切換到測(cè)置模式（可選項(xiàng)：ZPcuv）

CO.ACO2control

在MP模式下，葉室內(nèi)為空

保存ZPcuv（葉室為空下的零點(diǎn)）

叩模式表明：

,測(cè)■氣體通過(guò)氣體分析器（IRGA）的樣品室

?參比氣體通過(guò)氣體分析器（IRGA）的參比室

,但因葉室內(nèi)無(wú)葉片，所以兩股氣體應(yīng)相同（選擇ZPcuv）

GFS?3000(14》

Zealquest

GF&3000氣路簡(jiǎn)圖