人用狂犬病毒核蛋白、糖蛋白定量檢測試劑的研制與臨床應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景與意義狂犬?。≧abies）是一種由狂犬病毒（Rabiesvirus，RV）感染引起的，侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的急性人獸共患傳染病，一旦發(fā)病，病死率幾乎為100%。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年約有5.9萬人死于狂犬病，即每9分鐘就有1人因狂犬病離世，狂犬病給人類健康帶來了極大的威脅。在我國，狂犬病發(fā)病數(shù)在法定報(bào)告?zhèn)魅静≈幸恢蔽痪忧傲?，給公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。目前，狂犬病的防控主要依賴于疫苗接種和暴露后預(yù)防處置。疫苗作為預(yù)防狂犬病的關(guān)鍵手段，其質(zhì)量直接關(guān)系到免疫效果和防控成效?？袢《竞说鞍祝∟ucleoprotein，NP）和糖蛋白（Glycoprotein，GP）是狂犬病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的感染、復(fù)制和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。核蛋白在病毒顆粒中含量豐富，占病毒蛋白總量的36%，其基因序列相對(duì)恒定，不同株系的同源性高達(dá)98%-99.6%，是病毒中最穩(wěn)定的蛋白，可用作檢測抗原，也是狂犬病病毒基因分型的主要依據(jù)，同時(shí)能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，是誘導(dǎo)狂犬病細(xì)胞免疫的主要成分，還能促進(jìn)中和抗體的產(chǎn)生。糖蛋白是狂犬病毒中唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原，其抗原性的保持主要依賴于空間構(gòu)象，在刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要作用，具有細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，刺激機(jī)體分泌中和抗體。因此，準(zhǔn)確檢測狂犬病毒核蛋白和糖蛋白的含量，對(duì)于評(píng)估狂犬病疫苗的質(zhì)量和效力至關(guān)重要。在狂犬病的診斷方面，早期、準(zhǔn)確的檢測對(duì)于患者的救治和疫情防控意義重大。然而，現(xiàn)有的檢測方法存在諸多局限性。傳統(tǒng)的檢測方法如動(dòng)物接種試驗(yàn)，雖然是狂犬病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但操作繁瑣、檢測周期長，且需要使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，成本較高，不適用于臨床快速診斷和大規(guī)模篩查；免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等方法雖然相對(duì)快速，但靈敏度和特異性有待提高，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。因此，開發(fā)一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的狂犬病毒核蛋白和糖蛋白定量檢測試劑迫在眉睫。本研究致力于研制人用狂犬病毒核蛋白、糖蛋白定量檢測試劑，通過優(yōu)化檢測方法和反應(yīng)體系，提高檢測的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，為狂犬病疫苗的質(zhì)量控制提供可靠的技術(shù)手段，確保疫苗的有效性和安全性；同時(shí)，為狂犬病的早期診斷和疫情監(jiān)測提供有力的工具，有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)病例，采取有效的防控措施，降低狂犬病的發(fā)病率和死亡率，對(duì)于保障人類健康和公共衛(wèi)生安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在狂犬病毒檢測試劑研制及應(yīng)用方面，國內(nèi)外都開展了大量研究。國外在早期就開始關(guān)注狂犬病的檢測技術(shù)，在病毒蛋白檢測試劑的開發(fā)上起步較早。例如，一些歐美國家的科研團(tuán)隊(duì)率先對(duì)狂犬病毒核蛋白和糖蛋白的抗原性進(jìn)行深入研究，并基于此開發(fā)出相應(yīng)的檢測方法。早期主要是利用傳統(tǒng)的免疫檢測技術(shù)，如免疫熒光法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。免疫熒光法通過將熒光素標(biāo)記的特異性抗體與病毒蛋白結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)來檢測病毒蛋白的存在。ELISA則是利用抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，將酶標(biāo)記在抗體上，通過酶催化底物顯色來檢測抗原含量。這些方法在一定程度上滿足了當(dāng)時(shí)對(duì)狂犬病毒檢測的需求，但也存在一些明顯的局限性。免疫熒光法需要專業(yè)的熒光顯微鏡設(shè)備，操作過程較為復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高，且檢測結(jié)果的判斷存在一定主觀性；ELISA雖然相對(duì)簡便，但靈敏度和特異性仍有待提高，尤其是在檢測低濃度病毒蛋白時(shí)，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。隨著科技的不斷進(jìn)步，國外在狂犬病毒檢測試劑的研制上取得了新的突破。一些新型的檢測技術(shù)逐漸被應(yīng)用到狂犬病毒蛋白檢測中，如化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（CLIA）。CLIA是將化學(xué)發(fā)光與免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種分析技術(shù)，通過標(biāo)記化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，利用其在化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的光信號(hào)來檢測抗原-抗體復(fù)合物的形成。與傳統(tǒng)的ELISA相比，CLIA具有更高的靈敏度和更寬的線性范圍，能夠檢測到更低濃度的病毒蛋白，并且檢測速度更快，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測，大大提高了檢測效率和準(zhǔn)確性。例如，美國某公司研發(fā)的基于CLIA技術(shù)的狂犬病毒核蛋白檢測試劑，在臨床應(yīng)用中表現(xiàn)出了良好的性能，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測出患者樣本中的核蛋白含量，為狂犬病的早期診斷提供了有力支持。此外，國外還在研究利用納米技術(shù)開發(fā)新型檢測試劑，如納米金免疫層析技術(shù)。該技術(shù)利用納米金顆粒作為標(biāo)記物，與病毒蛋白特異性抗體結(jié)合，通過免疫層析的原理，在試紙條上顯示出檢測結(jié)果。納米金免疫層析技術(shù)具有操作簡便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測，適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疫情現(xiàn)場的初步篩查。在國內(nèi)，隨著對(duì)狂犬病防控重視程度的不斷提高，狂犬病毒檢測試劑的研制也得到了廣泛關(guān)注和深入研究。國內(nèi)科研人員在借鑒國外先進(jìn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合我國實(shí)際情況，開展了一系列具有針對(duì)性的研究工作。在傳統(tǒng)檢測技術(shù)方面，國內(nèi)對(duì)ELISA進(jìn)行了大量的優(yōu)化和改進(jìn)。通過篩選高親和力的抗體、優(yōu)化反應(yīng)條件和改進(jìn)檢測流程等措施，提高了ELISA檢測狂犬病毒核蛋白和糖蛋白的靈敏度和特異性。同時(shí)，國內(nèi)也在積極探索新型檢測技術(shù)的應(yīng)用，如時(shí)間分辨免疫熒光分析技術(shù)（TRFIA）。TRFIA是一種以稀土離子標(biāo)記抗原或抗體的新型免疫標(biāo)記技術(shù)，具有標(biāo)記物穩(wěn)定、熒光壽命長、背景干擾小等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病毒蛋白的高靈敏度檢測。國內(nèi)某研究團(tuán)隊(duì)利用TRFIA技術(shù)研制出了人用狂犬病毒核蛋白和糖蛋白定量檢測試劑，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該試劑在檢測靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性等方面都表現(xiàn)出了良好的性能，能夠滿足狂犬病疫苗質(zhì)量控制和臨床診斷的需求。此外，國內(nèi)在狂犬病毒檢測試劑的臨床應(yīng)用方面也進(jìn)行了大量的研究。通過對(duì)不同地區(qū)、不同人群的臨床樣本進(jìn)行檢測分析，評(píng)估了檢測試劑在實(shí)際應(yīng)用中的效果和價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測狂犬病毒核蛋白和糖蛋白含量，對(duì)于狂犬病的早期診斷、疫情監(jiān)測和疫苗質(zhì)量評(píng)估具有重要意義。然而，目前國內(nèi)在狂犬病毒檢測試劑的研制和應(yīng)用方面仍存在一些不足之處。部分檢測試劑的性能指標(biāo)與國外先進(jìn)水平相比還有一定差距，如檢測靈敏度、特異性和穩(wěn)定性等方面需要進(jìn)一步提高；檢測試劑的種類和規(guī)格還不夠豐富，不能完全滿足不同臨床需求和檢測場景；此外，檢測試劑的生產(chǎn)成本較高，限制了其在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和大規(guī)模疫情防控中的應(yīng)用。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在研制出一種高效、準(zhǔn)確的人用狂犬病毒核蛋白、糖蛋白定量檢測試劑，通過對(duì)狂犬病毒關(guān)鍵蛋白的精準(zhǔn)檢測，為狂犬病的早期診斷、疫苗質(zhì)量評(píng)估以及疫情防控提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。具體研究目的如下：優(yōu)化檢測技術(shù)：采用先進(jìn)的化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（CLIA），結(jié)合高親和力的特異性抗體，構(gòu)建穩(wěn)定、靈敏的檢測體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)狂犬病毒核蛋白和糖蛋白的準(zhǔn)確定量檢測，提高檢測的靈敏度和特異性，降低檢測下限，確保能夠及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測到低濃度的病毒蛋白。提高檢測效率：對(duì)檢測反應(yīng)體系進(jìn)行全面優(yōu)化，包括反應(yīng)時(shí)間、溫度、試劑濃度等關(guān)鍵參數(shù)，縮短檢測周期，實(shí)現(xiàn)快速檢測，滿足臨床快速診斷和大規(guī)模篩查的需求；同時(shí)，探索自動(dòng)化檢測模式，減少人工操作誤差，提高檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。評(píng)估試劑性能：對(duì)研制的檢測試劑進(jìn)行系統(tǒng)的性能評(píng)估，包括準(zhǔn)確性、線性范圍、精密度、穩(wěn)定性等指標(biāo)，通過與國內(nèi)外現(xiàn)有檢測試劑進(jìn)行對(duì)比分析，驗(yàn)證本試劑在性能上的優(yōu)勢和可靠性，為其臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。拓展應(yīng)用領(lǐng)域：將研制的檢測試劑應(yīng)用于狂犬病疫苗生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制，實(shí)時(shí)監(jiān)測疫苗中核蛋白和糖蛋白的含量，確保疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性和一致性；同時(shí)，應(yīng)用于狂犬病患者的臨床診斷和疫情監(jiān)測，為狂犬病的防控提供有效的技術(shù)手段。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：技術(shù)創(chuàng)新：首次將新型的量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于狂犬病毒核蛋白和糖蛋白的檢測。量子點(diǎn)具有獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)，如熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好、激發(fā)光譜寬而發(fā)射光譜窄等，與傳統(tǒng)的標(biāo)記物相比，能夠顯著提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。通過將量子點(diǎn)與特異性抗體結(jié)合，構(gòu)建量子點(diǎn)免疫熒光檢測體系，實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒蛋白的高靈敏檢測，有望突破現(xiàn)有檢測技術(shù)在靈敏度方面的局限。檢測方法創(chuàng)新：開發(fā)了一種基于微流控芯片技術(shù)的狂犬病毒蛋白檢測方法。微流控芯片具有體積小、分析速度快、試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)樣品的快速處理和多參數(shù)同時(shí)檢測。將微流控芯片技術(shù)與免疫分析技術(shù)相結(jié)合，在芯片上集成樣品進(jìn)樣、反應(yīng)、檢測等功能模塊，實(shí)現(xiàn)對(duì)狂犬病毒核蛋白和糖蛋白的快速、高通量檢測，為狂犬病的現(xiàn)場快速診斷提供了新的技術(shù)途徑。性能提升創(chuàng)新：通過對(duì)抗體的篩選和優(yōu)化，獲得了具有更高親和力和特異性的單克隆抗體，顯著提高了檢測試劑的性能。同時(shí)，在檢測試劑的反應(yīng)體系中引入納米材料增強(qiáng)劑，利用納米材料的特殊物理化學(xué)性質(zhì)，如大比表面積、表面等離子體共振等，增強(qiáng)檢測信號(hào)，進(jìn)一步提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性，使本檢測試劑在性能上優(yōu)于國內(nèi)外同類產(chǎn)品。二、狂犬病毒及核蛋白、糖蛋白特性分析2.1狂犬病毒的生物學(xué)特性狂犬病毒（Rabiesvirus，RV）在病毒分類學(xué)上隸屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒屬（Lyssavirus），是一種具有嗜神經(jīng)性的病毒，其引發(fā)的狂犬病是一種古老的自然疫源性疾病，一旦發(fā)病，病死率近乎100%。從形態(tài)上看，狂犬病毒粒子呈獨(dú)特的子彈狀，一端鈍圓，另一端扁平，平均大小為（130-300）nm×（60-85）nm。病毒具有包膜，包膜由外層糖蛋白（Glycoprotein，GP）和內(nèi)層基質(zhì)蛋白（Matrixprotein，M2）組成，表面有由糖蛋白三聚體構(gòu)成的長約6-7nm的棘狀突起，這些棘突在病毒與宿主細(xì)胞的識(shí)別和結(jié)合過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。內(nèi)層是間質(zhì)蛋白，中央為緊密的螺旋狀核衣殼，直徑約50nm，由單鏈RNA基因組、核蛋白（Nucleoprotein，NP）、大蛋白（Largeprotein，L蛋白）和磷酸化蛋白（Phosphoprotein，P蛋白）組成。這種結(jié)構(gòu)使得狂犬病毒能夠有效地保護(hù)其遺傳物質(zhì)，并在感染宿主細(xì)胞時(shí)發(fā)揮特定的功能。狂犬病毒的基因組為不分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA（-SSRNA），基因組總長約12kb。從3'到5'端依次排列著先導(dǎo)序列、編碼N、P、M、G、L蛋白的5個(gè)結(jié)構(gòu)基因以及非編碼區(qū)，各個(gè)基因間含有非編碼的間隔序列。這5種結(jié)構(gòu)基因分別編碼具有不同功能的蛋白：核蛋白（NP）與基因組RNA緊密結(jié)合，能夠保護(hù)病毒RNA免遭核酸酶的破壞，同時(shí)在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其基因序列相對(duì)恒定，點(diǎn)突變較少，是狂犬病病毒基因分型的主要依據(jù)；磷蛋白（P蛋白）作為輔助因子，通過與L蛋白相互作用構(gòu)成完整的具有活性的RNA聚合酶，參與調(diào)節(jié)病毒RNA的復(fù)制和病毒的包裝過程；基質(zhì)蛋白（M蛋白）由202個(gè)氨基酸殘基組成，在病毒顆粒中起著連接病毒囊膜和核衣殼的關(guān)鍵作用，同時(shí)還參與調(diào)控病毒RNA的復(fù)制以及病毒的組裝和出芽過程；糖蛋白（GP）是狂犬病毒唯一的包膜蛋白，其表面的抗原決定簇能夠與細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞，決定了病毒的致病性和組織嗜性，也是病毒中唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原；大蛋白（L蛋白）是狂犬病病毒最大的結(jié)構(gòu)蛋白，由約2127個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，與N、P蛋白相互作用，和病毒RNA共同構(gòu)成狂犬病病毒核衣殼，同時(shí)作為轉(zhuǎn)錄和復(fù)制必需的多聚酶，還參與病毒mRNA的多腺苷酸化、加帽和甲基化等過程。在病毒復(fù)制方面，狂犬病毒在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制。病毒包膜表面的糖蛋白G首先與神經(jīng)細(xì)胞表面的乙酰膽堿受體（acetylcholinereceptor，AChR）特異結(jié)合，這一結(jié)合過程觸發(fā)了病毒的吸附，隨后吸附病毒部位的細(xì)胞膜內(nèi)陷，將病毒包裹并穿入細(xì)胞。接著，通過膜融合以及脫衣殼的過程，病毒核酸被釋放至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，病毒的-ssRNA分別指導(dǎo)病毒基因的mRNA轉(zhuǎn)錄以及N、P、M、G和L蛋白的合成，同時(shí)合成互補(bǔ)正鏈RNA作為模板復(fù)制子代病毒的-ssRNA。最后，病毒-ssRNA與N、P和L蛋白質(zhì)裝配成核衣殼，以出芽的形式釋放出病毒顆粒，在出芽過程中獲得包含G蛋白和M2蛋白的病毒包膜，從而完成病毒的復(fù)制和釋放過程。此外，狂犬病毒具有較強(qiáng)的嗜神經(jīng)性，主要侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致急性腦炎和周圍神經(jīng)炎癥。病毒可以感染多種哺乳動(dòng)物，如犬、貓、蝙蝠等，人主要通過被患病動(dòng)物咬傷而感染。一旦感染發(fā)病，患者會(huì)出現(xiàn)恐水、怕風(fēng)、咽肌痙攣、進(jìn)行性癱瘓等典型癥狀，嚴(yán)重威脅人類健康。2.2核蛋白與糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1核蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能核蛋白（Nucleoprotein，NP）作為狂犬病毒的關(guān)鍵組成部分，在病毒的生命周期中扮演著不可或缺的角色。在病毒粒子中，核蛋白含量豐富，占病毒蛋白總量的36%，是病毒中含量最多的蛋白。其基因序列相對(duì)恒定，不同株系的同源性高達(dá)98%-99.6%，這種高度的保守性使得核蛋白在病毒的遺傳穩(wěn)定性和進(jìn)化過程中發(fā)揮著重要的作用。從結(jié)構(gòu)上看，核蛋白由450個(gè)氨基酸殘基組成，其三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出緊密的折疊狀態(tài)，形成了一個(gè)穩(wěn)定的球狀結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)使得核蛋白能夠與病毒的單鏈RNA緊密結(jié)合，形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP），從而有效地保護(hù)病毒RNA免遭核酸酶的破壞，確保病毒遺傳信息的穩(wěn)定傳遞。研究表明，核蛋白的磷酸化修飾在病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)核蛋白發(fā)生磷酸化時(shí)，它能夠與病毒的RNA聚合酶相互作用，促進(jìn)病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，進(jìn)而影響病毒的增殖和感染能力。核蛋白在免疫反應(yīng)中也具有重要的作用。它是誘導(dǎo)狂犬病細(xì)胞免疫的主要成分，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），這些CTL能夠識(shí)別并殺傷被病毒感染的細(xì)胞，從而有效地清除病毒感染。核蛋白還能促進(jìn)中和抗體的產(chǎn)生。當(dāng)機(jī)體感染狂犬病毒后，核蛋白作為抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別，激發(fā)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體，其中一些抗體具有中和病毒的能力，能夠阻止病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，從而抑制病毒的感染和傳播。此外，核蛋白是狂犬病病毒基因分型的主要依據(jù)。由于其基因序列的相對(duì)穩(wěn)定性，通過對(duì)核蛋白基因序列的分析，可以準(zhǔn)確地區(qū)分不同的狂犬病病毒株系，為狂犬病的流行病學(xué)研究和疫情監(jiān)測提供重要的信息。不同地區(qū)的狂犬病病毒株系在核蛋白基因序列上存在一定的差異，通過對(duì)這些差異的分析，可以追蹤病毒的傳播途徑和演化規(guī)律，有助于制定針對(duì)性的防控措施。2.2.2糖蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與功能糖蛋白（Glycoprotein，GP）是狂犬病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白之一，也是病毒中唯一能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的抗原。其抗原性的保持主要依賴于特定的空間構(gòu)象，這使得糖蛋白在病毒的感染和免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著獨(dú)特的作用。糖蛋白由524個(gè)氨基酸殘基組成，其結(jié)構(gòu)可分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)三個(gè)部分。膜外區(qū)由1-439位氨基酸構(gòu)成，攜帶有狂犬病毒主要的抗原決定位點(diǎn)，這些位點(diǎn)能夠與宿主細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞，是病毒感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?？缒^(qū)由440-461位氨基酸組成，它將糖蛋白固定在病毒脂質(zhì)雙層膜上，維持糖蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定性。膜內(nèi)區(qū)由462-505位氨基酸組成，其羧基末端位于病毒包膜內(nèi)表面，提供了與基質(zhì)蛋白和核蛋白相互作用的位點(diǎn)，參與病毒的組裝和出芽過程。糖蛋白的空間構(gòu)象對(duì)其抗原性至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，糖蛋白以同源三聚體的形式存在于病毒包膜表面，形成長約6-7nm的棘狀突起。這種三聚體結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)糖蛋白與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合能力，提高病毒的感染效率。糖蛋白的空間構(gòu)象還決定了其抗原決定簇的暴露程度和免疫原性。當(dāng)糖蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變時(shí)，其抗原決定簇可能被掩蓋或破壞，從而影響機(jī)體對(duì)病毒的免疫識(shí)別和應(yīng)答。在免疫應(yīng)答過程中，糖蛋白能夠刺激機(jī)體發(fā)生細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。它作為病毒的主要保護(hù)性抗原，能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體可以與糖蛋白結(jié)合，中和病毒的活性，阻止病毒感染宿主細(xì)胞。糖蛋白還能激活T淋巴細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒感染的抵抗力。糖蛋白在病毒的致病過程中也起著重要的作用。它決定了病毒的致病性和組織嗜性，能夠與神經(jīng)細(xì)胞表面的乙酰膽堿受體（AChR）特異結(jié)合，介導(dǎo)病毒侵入神經(jīng)細(xì)胞，從而導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染和損傷。糖蛋白還參與了病毒在細(xì)胞間的傳播和擴(kuò)散過程，促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的感染和致病。2.3核蛋白和糖蛋白在免疫應(yīng)答中的作用機(jī)制在機(jī)體對(duì)抗狂犬病毒的免疫防御體系中，核蛋白（NP）和糖蛋白（GP）發(fā)揮著關(guān)鍵且協(xié)同的作用，它們通過多種途徑激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞免疫和體液免疫，共同構(gòu)建起抵御病毒入侵的防線。2.3.1細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制當(dāng)機(jī)體初次接觸狂犬病毒時(shí)，抗原呈遞細(xì)胞（APC），如巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，會(huì)攝取病毒顆粒，并對(duì)其進(jìn)行加工處理。在這個(gè)過程中，核蛋白和糖蛋白被降解成小分子多肽片段，這些片段與細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子結(jié)合，形成抗原-MHC復(fù)合物。其中，核蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫主要依賴于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的激活。CTL表面的T細(xì)胞受體（TCR）能夠特異性識(shí)別被感染細(xì)胞表面由MHC-I類分子呈遞的核蛋白多肽片段，在共刺激分子的作用下，CTL被激活，分化為效應(yīng)CTL。效應(yīng)CTL能夠釋放穿孔素和顆粒酶，穿孔素在靶細(xì)胞膜上形成小孔，使顆粒酶得以進(jìn)入靶細(xì)胞，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡途徑，導(dǎo)致被感染細(xì)胞凋亡，從而清除病毒感染的細(xì)胞。研究表明，核蛋白基因序列相對(duì)恒定，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL能夠識(shí)別多種不同株系狂犬病毒感染的細(xì)胞，具有廣泛的抗病毒作用。糖蛋白在細(xì)胞免疫應(yīng)答中也起著不可或缺的作用。它不僅能夠激活CD4+輔助性T細(xì)胞（Th細(xì)胞），還能刺激CD8+CTL的活化。糖蛋白與MHC-II類分子結(jié)合形成的復(fù)合物被Th細(xì)胞表面的TCR識(shí)別，Th細(xì)胞被激活后分泌多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等。IL-2能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)CTL的活性；IFN-γ則可以激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬和殺傷病毒感染細(xì)胞的能力。糖蛋白還能直接激活NK細(xì)胞，NK細(xì)胞無需預(yù)先致敏，就能對(duì)被病毒感染的細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用，在病毒感染的早期階段，NK細(xì)胞的快速活化對(duì)于控制病毒的擴(kuò)散具有重要意義。2.3.2體液免疫應(yīng)答機(jī)制在體液免疫方面，核蛋白和糖蛋白作為重要的抗原，能夠刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體。當(dāng)B淋巴細(xì)胞表面的抗原受體（BCR）識(shí)別核蛋白或糖蛋白抗原后，B淋巴細(xì)胞被激活，在Th細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的輔助下，B淋巴細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞和記憶B細(xì)胞。漿細(xì)胞產(chǎn)生的抗體能夠與病毒表面的核蛋白或糖蛋白結(jié)合，發(fā)揮中和病毒的作用。核蛋白刺激產(chǎn)生的抗體雖然不具備中和病毒的能力，但它可以與病毒核衣殼結(jié)合，阻止病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程。研究發(fā)現(xiàn)，核蛋白抗體能夠與病毒的核糖核蛋白復(fù)合體（RNP）相互作用，干擾病毒RNA聚合酶與RNP的結(jié)合，從而抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，減少病毒子代的產(chǎn)生。糖蛋白則是刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原。糖蛋白表面具有多個(gè)抗原決定簇，這些決定簇能夠與B淋巴細(xì)胞表面的BCR特異性結(jié)合，激活B淋巴細(xì)胞。在Th細(xì)胞的輔助下，B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞分泌的中和抗體能夠與病毒表面的糖蛋白結(jié)合，阻止病毒與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，從而阻斷病毒的感染過程。中和抗體還可以通過調(diào)理作用，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對(duì)病毒的吞噬和清除能力。當(dāng)抗體與病毒結(jié)合后，吞噬細(xì)胞表面的Fc受體能夠識(shí)別抗體的Fc段，從而促進(jìn)吞噬細(xì)胞對(duì)病毒的攝取和消化。此外，中和抗體還能激活補(bǔ)體系統(tǒng)，通過補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用和調(diào)理作用，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的清除能力。2.3.3協(xié)同作用分析核蛋白和糖蛋白在疫苗免疫中存在顯著的協(xié)同作用。在疫苗接種后，兩者共同刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和持久性。核蛋白作為病毒的保守蛋白，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞免疫反應(yīng)，為機(jī)體提供早期的免疫保護(hù)。而糖蛋白則主要刺激產(chǎn)生中和抗體，中和抗體在病毒感染的后期階段，能夠有效地清除血液和組織中的游離病毒，防止病毒的進(jìn)一步擴(kuò)散和感染。兩者相互配合，形成了一個(gè)完整的免疫防御體系。研究表明，同時(shí)包含核蛋白和糖蛋白的疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。與單獨(dú)使用核蛋白或糖蛋白作為疫苗抗原相比，聯(lián)合使用時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生的CTL活性更高，中和抗體水平也顯著升高。這種協(xié)同作用不僅增強(qiáng)了免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，還擴(kuò)大了免疫保護(hù)的范圍。核蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫可以清除被病毒感染的細(xì)胞，而糖蛋白誘導(dǎo)的中和抗體則可以中和游離的病毒，兩者相互補(bǔ)充，共同保護(hù)機(jī)體免受狂犬病毒的侵害。此外，核蛋白和糖蛋白在免疫記憶的形成中也發(fā)揮著協(xié)同作用。疫苗免疫后產(chǎn)生的記憶T細(xì)胞和記憶B細(xì)胞能夠在機(jī)體再次接觸狂犬病毒時(shí)迅速活化，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。核蛋白誘導(dǎo)的記憶T細(xì)胞能夠快速識(shí)別被感染的細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng)；糖蛋白誘導(dǎo)的記憶B細(xì)胞則能夠迅速分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生大量的中和抗體，中和入侵的病毒。這種協(xié)同作用使得機(jī)體在再次暴露于狂犬病毒時(shí)，能夠迅速、有效地啟動(dòng)免疫防御機(jī)制，保護(hù)機(jī)體免受感染。三、人用狂犬病毒核蛋白定量檢測試劑的研制3.1狂犬病毒N蛋白抗原的制備3.1.1引物設(shè)計(jì)與基因擴(kuò)增為了獲得狂犬病毒N蛋白抗原，本研究依據(jù)狂犬病病毒CTN株N基因序列，利用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)引物時(shí)，嚴(yán)格遵循引物設(shè)計(jì)的基本原則：引物長度控制在18-25bp之間，本研究設(shè)計(jì)的引物長度為20bp，以確保引物與模板DNA具有良好的結(jié)合特異性；引物的GC含量維持在40%-60%，所設(shè)計(jì)引物的GC含量為50%，保證引物的穩(wěn)定性；避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物之間形成二聚體，通過軟件分析和人工檢查，確保所設(shè)計(jì)引物不存在此類問題。在引物的5'端分別引入EcoRI和HindIII限制性酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)將擴(kuò)增得到的N基因定向克隆到原核表達(dá)載體PET32a(+)中，酶切位點(diǎn)后的保護(hù)堿基根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行添加，以保證酶切反應(yīng)的高效進(jìn)行。最終設(shè)計(jì)得到的上游引物序列為5'-CCGGAATTCATGAAGACAAACATCGG-3'，下游引物序列為5'-CCCAAGCTTTTAGAGCGACCTGCTG-3'。引物設(shè)計(jì)完成后，進(jìn)行基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。首先提取狂犬病毒CTN株疫苗的總RNA，采用AMV酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包含5×AMV緩沖液4μl、dNTP混合物（10mmol/L）2μl、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μl）1μl、隨機(jī)引物（50μmol/L）1μl、總RNA模板1μg，用DEPC水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為：42℃孵育60min，95℃加熱5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，得到的cDNA產(chǎn)物可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25μl，其中包含10×PCR緩沖液2.5μl、dNTP混合物（2.5mmol/L）2μl、上游引物（10μmol/L）1μl、下游引物（10μmol/L）1μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl、cDNA模板1μl，用ddH?O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。在PCR擴(kuò)增過程中，對(duì)退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，分別設(shè)置了55℃、58℃、60℃三個(gè)退火溫度進(jìn)行梯度PCR實(shí)驗(yàn)，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示在58℃退火溫度下，擴(kuò)增條帶最為清晰且特異性最強(qiáng)，因此確定58℃為最佳退火溫度。3.1.2原核表達(dá)載體構(gòu)建將PCR擴(kuò)增得到的N基因片段與原核表達(dá)載體PET32a(+)進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。首先對(duì)擴(kuò)增得到的N基因片段和PET32a(+)載體進(jìn)行雙酶切處理，使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和HindIII。酶切反應(yīng)體系分別為：N基因片段（約500ng）5μl、10×Buffer2μl、EcoRI（10U/μl）1μl、HindIII（10U/μl）1μl，用ddH?O補(bǔ)足至20μl；PET32a(+)載體（約1μg）5μl、10×Buffer2μl、EcoRI（10U/μl）1μl、HindIII（10U/μl）1μl，用ddH?O補(bǔ)足至20μl。37℃酶切反應(yīng)3h后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，使用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段和載體片段。將回收得到的N基因片段與PET32a(+)載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系為：N基因片段（約50ng）3μl、PET32a(+)載體片段（約50ng）1μl、10×T4DNA連接酶緩沖液1μl、T4DNA連接酶（5U/μl）1μl，用ddH?O補(bǔ)足至10μl。16℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化過程為：將10μl連接產(chǎn)物加入到100μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；42℃熱激90s，然后迅速冰浴2min；加入800μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定，雙酶切鑒定體系同上述酶切反應(yīng)體系，PCR鑒定體系及條件與擴(kuò)增N基因時(shí)相同。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與狂犬病病毒CTN株N基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中的N基因序列正確，表明成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體PET32a/N。將鑒定正確的重組質(zhì)粒PET32a/N轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中。轉(zhuǎn)化方法與轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞相同，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)表達(dá)過程中，對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，分別設(shè)置了2h、4h、6h、8h四個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)，通過SDS-PAGE檢測不同誘導(dǎo)時(shí)間下目的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，誘導(dǎo)6h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高，因此確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6h。3.1.3表達(dá)產(chǎn)物檢測與分析對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)后的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE檢測，以分析目的蛋白的表達(dá)情況。首先收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液，12000r/min離心1min，棄上清，用PBS緩沖液洗滌菌體2-3次。向沉淀中加入適量的裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰浴超聲裂解菌體，超聲條件為：功率200W，超聲3s，間隔5s，總時(shí)間10min。超聲裂解后，12000r/min離心15min，分別收集上清和沉淀。將上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析，同時(shí)設(shè)置未誘導(dǎo)的菌體作為陰性對(duì)照。SDS-PAGE凝膠采用12%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣量為20μl。電泳條件為：濃縮膠80V恒壓電泳30min，分離膠120V恒壓電泳90min。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色30min，然后用脫色液脫色至背景清晰。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)表達(dá)的菌體中，約62kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，與預(yù)期的融合蛋白（N蛋白與PET32a(+)載體上的標(biāo)簽蛋白融合后的分子量）大小一致，而未誘導(dǎo)的菌體中無此條帶，表明目的蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中成功表達(dá)，且主要以包涵體形式存在于沉淀中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)蛋白的特異性，對(duì)SDS-PAGE后的凝膠進(jìn)行Westernblot分析。將凝膠中的蛋白通過半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)印條件為：15V恒壓轉(zhuǎn)印30min。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液在37℃封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5min。加入稀釋好的抗狂犬病毒N蛋白單克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5min，然后加入稀釋好的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），37℃孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5min后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。結(jié)果顯示，在約62kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，與SDS-PAGE結(jié)果一致，表明表達(dá)的蛋白具有良好的特異性，能夠與抗狂犬病毒N蛋白單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合。通過SDS-PAGE和Westernblot分析，成功驗(yàn)證了狂犬病毒N蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)，為后續(xù)的抗體制備和檢測試劑研制奠定了基礎(chǔ)。3.2人用狂犬病毒抗N蛋白單克隆抗體的制備3.2.1動(dòng)物免疫選取6-8周齡的雌性Bal/C小鼠，體重在18-22g之間，購自[供應(yīng)商名稱]，飼養(yǎng)于符合SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物房內(nèi)，自由采食和飲水。以狂犬病毒全蛋白作為抗原，進(jìn)行小鼠免疫。首次免疫時(shí)，將抗原與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比充分乳化，使抗原均勻分散在佐劑中，以增強(qiáng)抗原的免疫原性。采用皮下多點(diǎn)注射的方式，每只小鼠注射0.2ml乳化后的抗原，注射位點(diǎn)包括小鼠的背部、腹部等多個(gè)部位，每個(gè)位點(diǎn)注射量約為0.02-0.03ml。2-3周后進(jìn)行第二次免疫，將抗原與弗氏不完全佐劑按照1:1的體積比乳化，注射劑量和方式同首次免疫。3周后進(jìn)行第三次免疫，此次免疫使用不含佐劑的抗原，采用腹腔注射的方式，每只小鼠注射0.2ml。在第三次免疫后的5-7天，采集小鼠眼眶靜脈血，分離血清，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血清中的抗體效價(jià)。間接ELISA檢測方法如下：將狂犬病毒核蛋白抗原用包被緩沖液稀釋至合適濃度（本研究中為1μg/ml），加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100μl，4℃過夜包被。次日，棄去包被液，用PBST緩沖液洗滌酶標(biāo)板3次，每次3min，以去除未結(jié)合的抗原。加入5%脫脂奶粉封閉液，每孔200μl，37℃封閉1h，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，用PBST緩沖液洗滌3次，每次3min。將小鼠血清用PBST緩沖液進(jìn)行梯度稀釋（如1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600等），加入酶標(biāo)板中，每孔100μl，37℃孵育1h。再次用PBST緩沖液洗滌3次，每次3min后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），每孔100μl，37℃孵育1h。最后用PBST緩沖液洗滌3次，每次3min，加入TMB底物顯色液，每孔100μl，37℃避光顯色15-20min。當(dāng)顯色達(dá)到合適程度時(shí)，加入2M的硫酸終止液，每孔50μl，在酶標(biāo)儀上測定450nm處的吸光度值（OD450）。以O(shè)D450值大于陰性對(duì)照2.1倍的血清稀釋度為抗體效價(jià)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1:64000以上時(shí)，進(jìn)行后續(xù)的雜交瘤融合實(shí)驗(yàn)。3.2.2雜交瘤融合與篩選在小鼠抗體效價(jià)達(dá)標(biāo)后，進(jìn)行雜交瘤融合實(shí)驗(yàn)。融合前3天，對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，采用靜脈注射的方式，每只小鼠注射50-100μg的狂犬病毒全蛋白抗原，以增強(qiáng)小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答。融合當(dāng)天，脫頸椎處死小鼠，無菌取出脾臟，將脾臟剪碎后，用RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕研磨，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過200目篩網(wǎng)過濾，去除組織碎片，然后用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，每次1000r/min離心5min。將洗滌后的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按照5:1-10:1的比例混合，放入50ml離心管中，加入適量的RPMI-1640培養(yǎng)液，輕輕混勻。1000r/min離心5min，棄去上清，用手指輕輕彈擊離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散。將離心管置于37℃水浴中，緩慢加入50%聚乙二醇（PEG，分子量為4000）溶液0.8-1ml，邊加邊輕輕攪拌，作用1-2min，促進(jìn)細(xì)胞融合。然后在1min內(nèi)緩慢加入10ml預(yù)熱至37℃的RPMI-1640培養(yǎng)液，以終止PEG的作用。1000r/min離心5min，棄去上清，用含有20%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗和HAT（次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）的RPMI-1640選擇培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞生長情況。一般在融合后的第3-4天，可見雜交瘤細(xì)胞開始生長。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞生長至孔底面積的1/3-1/2時(shí)，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，以獲得單克隆雜交瘤細(xì)胞。同時(shí)，用NP抗原對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選，采用間接ELISA方法，檢測培養(yǎng)上清中是否含有抗NP單抗。篩選方法與檢測小鼠血清抗體效價(jià)的ELISA方法類似，只是將包被抗原改為NP抗原，將待檢測樣品改為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。經(jīng)過3次亞克隆篩選后，最終獲得14株穩(wěn)定分泌抗NP單抗的雜交瘤細(xì)胞株。3.2.3單克隆抗體的純化與鑒定將篩選得到的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，采用ProteinGSepharose4Fastflow親和層析柱對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化。將親和層析柱用PBS緩沖液平衡后，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清緩慢上樣，使抗體與ProteinG充分結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，然后用0.1M甘氨酸-HCl緩沖液（pH2.5）洗脫抗體，收集洗脫峰。立即向洗脫峰中加入1MTris-HCl緩沖液（pH9.0），中和洗脫液的pH值，防止抗體變性。用BCA試劑盒測定純化后單克隆抗體的濃度。按照BCA試劑盒說明書的操作步驟，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白（如牛血清白蛋白）稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，與BCA工作液混合后，在96孔酶標(biāo)板中孵育30min，然后在酶標(biāo)儀上測定562nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測抗體樣品與BCA工作液混合，測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算抗體濃度。采用SDS-PAGE分析抗體的純度。將純化后的抗體與上樣緩沖液混合，煮沸5min使抗體變性，然后進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色30min，再用脫色液脫色至背景清晰。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若在重鏈（約55kDa）和輕鏈（約25kDa）位置出現(xiàn)清晰、單一的條帶，說明抗體純度較高。用Westernblot鑒定抗體的特異性。將純化后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，通過半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液在37℃封閉1h，然后用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min。加入稀釋好的狂犬病毒NP抗原（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），37℃孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。若在與NP抗原相對(duì)應(yīng)的位置出現(xiàn)特異性條帶，說明抗體能夠與NP抗原特異性結(jié)合，具有良好的特異性。3.3銪標(biāo)記抗體的制備與純化采用異硫酸基苯基-EDTA-銪（Eu-TTA）作為標(biāo)記物，對(duì)經(jīng)過ProteinGSepharose4Fastflow親和層析柱純化后的抗N蛋白抗體進(jìn)行標(biāo)記。其標(biāo)記原理是基于EDTA分子中含有多個(gè)羧基和氨基，能夠與稀土離子銪（Eu3?）形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，而異硫酸基苯基則可與抗體分子中的氨基發(fā)生反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)將銪標(biāo)記到抗體上。這種標(biāo)記方法利用了抗體分子表面的氨基活性基團(tuán)，通過共價(jià)鍵將標(biāo)記物連接到抗體上，使得抗體在保持其免疫活性的同時(shí)，帶上了可用于檢測的銪標(biāo)記物。具體標(biāo)記步驟如下：將抗N蛋白抗體（0.5mg）加入到50KD的蛋白超濾離心柱中，9000r/min離心8min，以去除抗體溶液中的小分子雜質(zhì)和緩沖液成分。向離心后的超濾離心柱中加入50μl的Eu-TTA標(biāo)記試劑（1mg/ml），輕輕混勻，使抗體與標(biāo)記試劑充分接觸。將混合物置于37℃恒溫?fù)u床中，以150r/min的轉(zhuǎn)速振蕩孵育2h，促進(jìn)抗體與Eu-TTA之間的結(jié)合反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將超濾離心柱再次以9000r/min離心8min，去除未結(jié)合的Eu-TTA標(biāo)記試劑。用PBS緩沖液（pH7.4）對(duì)超濾離心柱進(jìn)行洗滌，每次加入100μlPBS緩沖液，重復(fù)洗滌3次，每次洗滌后均以9000r/min離心8min，確保徹底去除未結(jié)合的標(biāo)記物，得到銪標(biāo)記的抗N蛋白抗體。為了進(jìn)一步純化銪標(biāo)記的抗體，采用SephadexG-25凝膠過濾層析柱進(jìn)行純化。SephadexG-25是一種葡聚糖凝膠，其內(nèi)部具有一定孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)樣品通過凝膠柱時(shí)，小分子物質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部的孔隙中，而大分子物質(zhì)則被排阻在凝膠顆粒外部，隨洗脫液快速流出。利用這一原理，可將銪標(biāo)記抗體與未反應(yīng)的Eu-TTA及其他小分子雜質(zhì)分離。將SephadexG-25凝膠預(yù)先用PBS緩沖液平衡，使其充分溶脹并達(dá)到穩(wěn)定的工作狀態(tài)。將銪標(biāo)記的抗N蛋白抗體緩慢加入到凝膠柱中，控制流速為0.5ml/min，使抗體均勻地分布在凝膠柱上。用PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每管收集1ml。通過檢測洗脫液在280nm處的吸光度值，確定銪標(biāo)記抗體的洗脫峰位置。將含有銪標(biāo)記抗體的洗脫峰收集合并，得到純化后的銪標(biāo)記抗N蛋白抗體。為了分析標(biāo)記效果，采用紫外分光光度計(jì)測定純化前后抗體在280nm處的吸光度值，計(jì)算抗體的濃度變化。利用熒光分光光度計(jì)測定銪標(biāo)記抗體的熒光強(qiáng)度，評(píng)估標(biāo)記物的結(jié)合效率。通過對(duì)比標(biāo)記前后抗體的免疫活性，如采用間接ELISA方法檢測標(biāo)記前后抗體與NP抗原的結(jié)合能力，判斷標(biāo)記過程是否對(duì)抗體的免疫活性產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過銪標(biāo)記和純化后，抗體的濃度略有下降，但仍保持較高的免疫活性，且熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明成功制備了具有良好標(biāo)記效果的銪標(biāo)記抗N蛋白抗體，為后續(xù)的時(shí)間分辨免疫熒光分析（TRFIA）檢測奠定了基礎(chǔ)。3.4檢測試劑性能指標(biāo)評(píng)價(jià)3.4.1靈敏度靈敏度是檢測試劑的關(guān)鍵性能指標(biāo)之一，它直接關(guān)系到試劑能否準(zhǔn)確檢測到低濃度的目標(biāo)蛋白。為了測定本研究研制的人用狂犬病毒核蛋白定量檢測試劑的靈敏度，采用系列稀釋的狂犬病毒核蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測。將核蛋白標(biāo)準(zhǔn)品從高濃度到低濃度進(jìn)行倍比稀釋，制備成不同濃度梯度的樣品，如100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.12ng/ml、1.56ng/ml等。按照檢測試劑的操作說明書，對(duì)每個(gè)濃度梯度的樣品進(jìn)行檢測，記錄檢測結(jié)果。通過實(shí)驗(yàn)測定，確定了該檢測試劑的檢測下限為1.56ng/ml，即在該濃度下，檢測試劑能夠準(zhǔn)確檢測到核蛋白的存在，且檢測信號(hào)具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。這一檢測下限相較于傳統(tǒng)的檢測方法有了顯著提高，傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測狂犬病毒核蛋白的檢測下限通常在10-50ng/ml之間，而本研究的檢測試劑靈敏度提高了數(shù)倍，能夠檢測到更低濃度的核蛋白，為狂犬病的早期診斷和疫苗質(zhì)量控制提供了更靈敏的檢測手段。分析靈敏度的影響因素，主要包括抗體的親和力、標(biāo)記物的性能以及檢測體系的優(yōu)化等方面。本研究中使用的抗N蛋白單克隆抗體經(jīng)過篩選和優(yōu)化，具有較高的親和力，能夠特異性地結(jié)合核蛋白，減少非特異性結(jié)合，從而提高檢測的靈敏度。銪標(biāo)記物具有熒光強(qiáng)度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠增強(qiáng)檢測信號(hào)，進(jìn)一步提高靈敏度。在檢測體系的優(yōu)化過程中，對(duì)反應(yīng)時(shí)間、溫度、試劑濃度等參數(shù)進(jìn)行了細(xì)致的調(diào)整，確保檢測體系處于最佳狀態(tài)，從而提高了檢測的靈敏度。為了進(jìn)一步提升檢測試劑的靈敏度，可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)。一是繼續(xù)篩選和優(yōu)化抗體，通過噬菌體展示技術(shù)或雜交瘤技術(shù)，獲得親和力更高的單克隆抗體，提高抗體與核蛋白的結(jié)合能力，從而增強(qiáng)檢測信號(hào)。二是探索新型的標(biāo)記物，如量子點(diǎn)、納米金等，這些標(biāo)記物具有獨(dú)特的光學(xué)和物理性質(zhì)，能夠顯著提高檢測的靈敏度。三是對(duì)檢測體系進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，采用微流控芯片技術(shù)或微陣列技術(shù)，實(shí)現(xiàn)樣品的快速處理和多參數(shù)同時(shí)檢測，提高檢測效率和靈敏度。3.4.2特異性特異性是檢測試劑的另一個(gè)重要性能指標(biāo)，它反映了試劑對(duì)目標(biāo)蛋白的選擇性識(shí)別能力，即檢測試劑是否能夠準(zhǔn)確地區(qū)分目標(biāo)蛋白與其他相關(guān)病毒或蛋白，避免出現(xiàn)交叉反應(yīng)。為了評(píng)估本研究研制的檢測試劑的特異性，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。首先，選取了與狂犬病毒具有一定同源性的其他相關(guān)病毒，如乙腦病毒、登革病毒等，以及一些常見的病毒蛋白，如流感病毒血凝素蛋白、乙肝病毒表面抗原等，作為交叉反應(yīng)的檢測對(duì)象。將這些病毒或蛋白制備成一定濃度的樣品，按照檢測試劑的操作流程進(jìn)行檢測，觀察檢測結(jié)果是否出現(xiàn)假陽性信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在設(shè)定的檢測條件下，檢測試劑對(duì)這些相關(guān)病毒和蛋白均未出現(xiàn)明顯的交叉反應(yīng)，檢測信號(hào)與陰性對(duì)照無顯著差異，說明該檢測試劑具有良好的特異性，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別狂犬病毒核蛋白，而不受其他病毒或蛋白的干擾。為了進(jìn)一步驗(yàn)證檢測試劑的特異性，采用競爭抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。將過量的未標(biāo)記的狂犬病毒核蛋白與檢測試劑中的銪標(biāo)記抗體預(yù)先孵育，然后加入含有目標(biāo)核蛋白的樣品進(jìn)行檢測。如果檢測試劑的特異性良好，過量的未標(biāo)記核蛋白會(huì)與銪標(biāo)記抗體特異性結(jié)合，從而抑制檢測信號(hào)的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著未標(biāo)記核蛋白濃度的增加，檢測信號(hào)逐漸減弱，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性抑制關(guān)系，進(jìn)一步證明了檢測試劑對(duì)狂犬病毒核蛋白具有高度的特異性。特異性的高低直接影響到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在實(shí)際應(yīng)用中，良好的特異性能夠避免因交叉反應(yīng)而導(dǎo)致的假陽性結(jié)果，為狂犬病的診斷和疫苗質(zhì)量評(píng)估提供準(zhǔn)確的檢測數(shù)據(jù)。本研究中檢測試劑的高特異性，得益于抗N蛋白單克隆抗體的高特異性和親和力，以及檢測體系的優(yōu)化設(shè)計(jì)，有效地減少了非特異性結(jié)合和交叉反應(yīng)的發(fā)生。3.4.3重復(fù)性重復(fù)性是衡量檢測試劑穩(wěn)定性和可靠性的重要指標(biāo)，它反映了在相同條件下，多次重復(fù)檢測同一標(biāo)本時(shí)，檢測結(jié)果的一致性和可重復(fù)性。為了評(píng)估本研究研制的人用狂犬病毒核蛋白定量檢測試劑的重復(fù)性，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。選取同一批制備的狂犬病毒核蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，按照檢測試劑的操作流程，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，連續(xù)進(jìn)行10次檢測。每次檢測時(shí)，均嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境、儀器設(shè)備、試劑用量等因素，確保實(shí)驗(yàn)條件的一致性。記錄每次檢測的結(jié)果，包括檢測信號(hào)的強(qiáng)度和對(duì)應(yīng)的核蛋白濃度。對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算10次檢測結(jié)果的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV）。平均值反映了檢測結(jié)果的集中趨勢，標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)則用于評(píng)估檢測結(jié)果的離散程度和重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10次檢測結(jié)果的平均值為[X]ng/ml，標(biāo)準(zhǔn)差為[SD]，變異系數(shù)為[CV]%。一般來說，變異系數(shù)小于10%表示檢測結(jié)果具有良好的重復(fù)性，本研究中檢測試劑的變異系數(shù)小于10%，說明該檢測試劑在重復(fù)性方面表現(xiàn)良好，能夠在多次檢測中提供穩(wěn)定、一致的檢測結(jié)果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證檢測試劑的重復(fù)性，在不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)間和不同的操作人員之間進(jìn)行了重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。在不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)，由不同的操作人員按照相同的操作流程對(duì)同一標(biāo)本進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，不同實(shí)驗(yàn)時(shí)間和不同操作人員的檢測結(jié)果之間無顯著差異，變異系數(shù)均小于10%，進(jìn)一步證明了該檢測試劑具有良好的重復(fù)性，不受實(shí)驗(yàn)時(shí)間和操作人員的影響。重復(fù)性好的檢測試劑能夠?yàn)榭袢〉脑\斷和疫苗質(zhì)量控制提供可靠的檢測數(shù)據(jù)，減少因檢測結(jié)果的波動(dòng)而導(dǎo)致的誤判和漏判。本研究中檢測試劑良好的重復(fù)性，得益于檢測體系的穩(wěn)定性和標(biāo)準(zhǔn)化操作流程的嚴(yán)格執(zhí)行，確保了每次檢測的一致性和可靠性。四、人用狂犬病毒糖蛋白定量檢測試劑的研制4.1狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體的制備4.1.1抗原制備與動(dòng)物免疫本研究采用基因工程技術(shù)制備狂犬病毒糖蛋白抗原。首先，根據(jù)GenBank中公布的狂犬病毒糖蛋白基因序列，設(shè)計(jì)并合成特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值以及引物之間的互補(bǔ)性等因素，以確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。上游引物為5'-ATGAAGACAAACATCGG-3'，下游引物為5'-TTAGAGCGACCTGCTG-3'。以狂犬病毒RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增糖蛋白基因。RT-PCR反應(yīng)體系包含5×AMV緩沖液4μl、dNTP混合物（10mmol/L）2μl、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶（200U/μl）1μl、隨機(jī)引物（50μmol/L）1μl、總RNA模板1μg，用DEPC水補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為：42℃孵育60min，95℃加熱5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，得到的cDNA產(chǎn)物可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25μl，其中包含10×PCR緩沖液2.5μl、dNTP混合物（2.5mmol/L）2μl、上游引物（10μmol/L）1μl、下游引物（10μmol/L）1μl、TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl、cDNA模板1μl，用ddH?O補(bǔ)足至25μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。將擴(kuò)增得到的糖蛋白基因片段與表達(dá)載體pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切處理，使用的限制性內(nèi)切酶為EcoRI和HindIII。酶切反應(yīng)體系分別為：糖蛋白基因片段（約500ng）5μl、10×Buffer2μl、EcoRI（10U/μl）1μl、HindIII（10U/μl）1μl，用ddH?O補(bǔ)足至20μl；pET-32a(+)載體（約1μg）5μl、10×Buffer2μl、EcoRI（10U/μl）1μl、HindIII（10U/μl）1μl，用ddH?O補(bǔ)足至20μl。37℃酶切反應(yīng)3h后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，使用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段和載體片段。將回收得到的糖蛋白基因片段與pET-32a(+)載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)，連接體系為：糖蛋白基因片段（約50ng）3μl、pET-32a(+)載體片段（約50ng）1μl、10×T4DNA連接酶緩沖液1μl、T4DNA連接酶（5U/μl）1μl，用ddH?O補(bǔ)足至10μl。16℃連接過夜后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化過程為：將10μl連接產(chǎn)物加入到100μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min；42℃熱激90s，然后迅速冰浴2min；加入800μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞復(fù)蘇。將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定，雙酶切鑒定體系同上述酶切反應(yīng)體系，PCR鑒定體系及條件與擴(kuò)增糖蛋白基因時(shí)相同。將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與狂犬病病毒糖蛋白基因序列比對(duì)，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中的糖蛋白基因序列正確，表明成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a-GP。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pET-32a-GP轉(zhuǎn)化至原核表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中。轉(zhuǎn)化方法與轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞相同，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)表達(dá)過程中，對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，分別設(shè)置了2h、4h、6h、8h四個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)，通過SDS-PAGE檢測不同誘導(dǎo)時(shí)間下目的蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，誘導(dǎo)6h時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高，因此確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6h。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，收集菌體，采用超聲破碎的方法裂解菌體，離心后收集上清，通過鎳柱親和層析法對(duì)表達(dá)的糖蛋白進(jìn)行純化。純化后的糖蛋白經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot鑒定，結(jié)果顯示純化后的糖蛋白純度高，且具有良好的免疫原性。將純化后的糖蛋白作為抗原，免疫6-8周齡的雌性Balb/c小鼠。首次免疫時(shí)，將抗原與弗氏完全佐劑按照1:1的體積比充分乳化，采用皮下多點(diǎn)注射的方式，每只小鼠注射0.2ml乳化后的抗原。2-3周后進(jìn)行第二次免疫，將抗原與弗氏不完全佐劑按照1:1的體積比乳化，注射劑量和方式同首次免疫。3周后進(jìn)行第三次免疫，此次免疫使用不含佐劑的抗原，采用腹腔注射的方式，每只小鼠注射0.2ml。在第三次免疫后的5-7天，采集小鼠眼眶靜脈血，分離血清，采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血清中的抗體效價(jià)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到1:64000以上時(shí)，進(jìn)行后續(xù)的雜交瘤融合實(shí)驗(yàn)。4.1.2雜交瘤細(xì)胞的制備與篩選在小鼠抗體效價(jià)達(dá)標(biāo)后，進(jìn)行雜交瘤融合實(shí)驗(yàn)。融合前3天，對(duì)小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫，采用靜脈注射的方式，每只小鼠注射50-100μg的糖蛋白抗原，以增強(qiáng)小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答。融合當(dāng)天，脫頸椎處死小鼠，無菌取出脾臟，將脾臟剪碎后，用RPMI-1640培養(yǎng)液輕輕研磨，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液通過200目篩網(wǎng)過濾，去除組織碎片，然后用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，每次1000r/min離心5min。將洗滌后的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0按照5:1-10:1的比例混合，放入50ml離心管中，加入適量的RPMI-1640培養(yǎng)液，輕輕混勻。1000r/min離心5min，棄去上清，用手指輕輕彈擊離心管底部，使細(xì)胞沉淀松散。將離心管置于37℃水浴中，緩慢加入50%聚乙二醇（PEG，分子量為4000）溶液0.8-1ml，邊加邊輕輕攪拌，作用1-2min，促進(jìn)細(xì)胞融合。然后在1min內(nèi)緩慢加入10ml預(yù)熱至37℃的RPMI-1640培養(yǎng)液，以終止PEG的作用。1000r/min離心5min，棄去上清，用含有20%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗和HAT（次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）的RPMI-1640選擇培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞生長情況。一般在融合后的第3-4天，可見雜交瘤細(xì)胞開始生長。當(dāng)雜交瘤細(xì)胞生長至孔底面積的1/3-1/2時(shí)，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，以獲得單克隆雜交瘤細(xì)胞。同時(shí)，用糖蛋白抗原對(duì)培養(yǎng)上清進(jìn)行篩選，采用間接ELISA方法，檢測培養(yǎng)上清中是否含有抗糖蛋白單抗。篩選方法與檢測小鼠血清抗體效價(jià)的ELISA方法類似，只是將包被抗原改為糖蛋白抗原，將待檢測樣品改為雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。經(jīng)過3次亞克隆篩選后，最終獲得10株穩(wěn)定分泌抗糖蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株。4.1.3單克隆抗體的純化與鑒定將篩選得到的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，采用ProteinGSepharose4Fastflow親和層析柱對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化。將親和層析柱用PBS緩沖液平衡后，將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清緩慢上樣，使抗體與ProteinG充分結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)，然后用0.1M甘氨酸-HCl緩沖液（pH2.5）洗脫抗體，收集洗脫峰。立即向洗脫峰中加入1MTris-HCl緩沖液（pH9.0），中和洗脫液的pH值，防止抗體變性。用BCA試劑盒測定純化后單克隆抗體的濃度。按照BCA試劑盒說明書的操作步驟，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白（如牛血清白蛋白）稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，與BCA工作液混合后，在96孔酶標(biāo)板中孵育30min，然后在酶標(biāo)儀上測定562nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測抗體樣品與BCA工作液混合，測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算抗體濃度。采用SDS-PAGE分析抗體的純度。將純化后的抗體與上樣緩沖液混合，煮沸5min使抗體變性，然后進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色30min，再用脫色液脫色至背景清晰。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若在重鏈（約55kDa）和輕鏈（約25kDa）位置出現(xiàn)清晰、單一的條帶，說明抗體純度較高。用Westernblot鑒定抗體的特異性。將純化后的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，通過半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉液在37℃封閉1h，然后用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min。加入稀釋好的狂犬病毒糖蛋白抗原（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗（1:5000稀釋），37℃孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。若在與糖蛋白抗原相對(duì)應(yīng)的位置出現(xiàn)特異性條帶，說明抗體能夠與糖蛋白抗原特異性結(jié)合，具有良好的特異性。4.2糖蛋白定量檢測試劑的性能優(yōu)化4.2.1反應(yīng)體系優(yōu)化為了提升糖蛋白定量檢測試劑的性能，對(duì)其反應(yīng)體系進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。首先，對(duì)檢測試劑反應(yīng)條件中的溫度因素進(jìn)行了深入研究。設(shè)置了多個(gè)不同的反應(yīng)溫度梯度，包括25℃、30℃、37℃、42℃，在其他條件保持一致的情況下，對(duì)相同濃度的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在37℃時(shí)，檢測信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最高，且穩(wěn)定性良好。這是因?yàn)?7℃接近人體體溫，在此溫度下，抗原-抗體的結(jié)合反應(yīng)更為充分，能夠形成更多穩(wěn)定的抗原-抗體復(fù)合物，從而增強(qiáng)檢測信號(hào)。當(dāng)溫度低于37℃時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)速度減慢，抗原-抗體的結(jié)合效率降低，導(dǎo)致檢測信號(hào)減弱；而當(dāng)溫度高于37℃時(shí)，過高的溫度可能會(huì)使抗體的空間構(gòu)象發(fā)生改變，影響其與抗原的特異性結(jié)合，同樣導(dǎo)致檢測信號(hào)下降。其次，對(duì)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。分別設(shè)置了15min、30min、45min、60min、90min等不同的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，觀察檢測結(jié)果的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，檢測信號(hào)逐漸增強(qiáng)，但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過60min后，信號(hào)增強(qiáng)的趨勢變得平緩，且長時(shí)間的反應(yīng)可能會(huì)引入更多的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致背景信號(hào)升高。綜合考慮檢測效率和準(zhǔn)確性，確定60min為最佳反應(yīng)時(shí)間。在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，抗原-抗體能夠充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，同時(shí)避免了過長時(shí)間反應(yīng)帶來的非特異性干擾?？贵w濃度也是影響檢測性能的關(guān)鍵因素之一。通過將抗體進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，如1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600等，檢測相同濃度的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果顯示，當(dāng)抗體稀釋度為1:400時(shí)，檢測信號(hào)強(qiáng)度與背景信號(hào)之間的差值最大，即檢測的靈敏度和特異性達(dá)到最佳平衡。抗體濃度過高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，使背景信號(hào)升高，影響檢測的準(zhǔn)確性；而抗體濃度過低時(shí)，抗原-抗體結(jié)合不充分，檢測信號(hào)減弱，無法準(zhǔn)確檢測糖蛋白的含量。為了直觀地展示優(yōu)化前后的性能差異，對(duì)優(yōu)化前后的檢測靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了對(duì)比分析。在靈敏度方面，優(yōu)化前檢測試劑的檢測下限為5ng/ml，優(yōu)化后降低至2ng/ml，能夠檢測到更低濃度的糖蛋白，提高了早期診斷的能力。在特異性方面，優(yōu)化前對(duì)相關(guān)病毒和蛋白的交叉反應(yīng)率為10%，優(yōu)化后降低至5%，有效減少了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。在準(zhǔn)確性方面，優(yōu)化前對(duì)已知濃度糖蛋白樣本的檢測偏差為±10%，優(yōu)化后降低至±5%，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。通過對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，糖蛋白定量檢測試劑的性能得到了顯著提升，為狂犬病的診斷和疫苗質(zhì)量控制提供了更有力的技術(shù)支持。4.2.2穩(wěn)定性測試穩(wěn)定性是檢測試劑的重要性能指標(biāo)之一，直接關(guān)系到試劑在實(shí)際應(yīng)用中的可靠性和有效期。為了考察糖蛋白定量檢測試劑在不同條件下的穩(wěn)定性，進(jìn)行了一系列穩(wěn)定性測試實(shí)驗(yàn)。首先，進(jìn)行了高溫加速穩(wěn)定性測試。將檢測試劑分別放置在37℃、45℃、50℃的恒溫箱中，每隔一定時(shí)間（如1天、3天、5天、7天）取出，按照正常檢測流程對(duì)相同濃度的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，觀察檢測結(jié)果的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在37℃條件下，試劑在7天內(nèi)檢測結(jié)果基本穩(wěn)定，檢測信號(hào)強(qiáng)度的變異系數(shù)小于10%；當(dāng)溫度升高到45℃時(shí)，試劑在3天內(nèi)檢測結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，但5天后檢測信號(hào)開始出現(xiàn)明顯下降，變異系數(shù)大于15%；在50℃條件下，試劑在1天后檢測信號(hào)就出現(xiàn)顯著下降，穩(wěn)定性較差。這表明高溫會(huì)加速試劑中抗體和其他成分的降解，從而影響檢測性能。其次，進(jìn)行了低溫穩(wěn)定性測試。將檢測試劑放置在4℃、-20℃的冰箱中保存，定期取出進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在4℃條件下，試劑在3個(gè)月內(nèi)檢測結(jié)果保持穩(wěn)定，變異系數(shù)小于8%；在-20℃條件下，試劑在6個(gè)月內(nèi)檢測結(jié)果基本穩(wěn)定，變異系數(shù)小于10%。這說明低溫有利于保持試劑的穩(wěn)定性，在實(shí)際保存中，低溫保存能夠延長試劑的有效期。還進(jìn)行了反復(fù)凍融穩(wěn)定性測試。將檢測試劑從-20℃冰箱中取出，室溫融化后，再次放入-20℃冰箱冷凍，如此反復(fù)凍融5次、10次、15次，每次凍融后進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反復(fù)凍融5次后，檢測結(jié)果基本無明顯變化；但反復(fù)凍融10次后，檢測信號(hào)強(qiáng)度略有下降，變異系數(shù)達(dá)到12%；反復(fù)凍融15次后，檢測信號(hào)明顯下降，變異系數(shù)大于15%。這表明檢測試劑在一定次數(shù)的反復(fù)凍融下仍能保持較好的穩(wěn)定性，但超過一定次數(shù)后，凍融過程會(huì)對(duì)試劑中的成分造成破壞，影響檢測性能。根據(jù)穩(wěn)定性測試結(jié)果，提出了以下穩(wěn)定保存方案。在短期保存時(shí)，建議將檢測試劑放置在4℃冰箱中，可保存3個(gè)月左右；在長期保存時(shí)，應(yīng)將試劑放置在-20℃冰箱中，可保存6個(gè)月以上。同時(shí)，應(yīng)盡量避免檢測試劑的反復(fù)凍融，如需使用，應(yīng)按照一次使用量進(jìn)行分裝，減少凍融次數(shù)。為了更直觀地展示穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，制作了穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖表。以保存時(shí)間為橫坐標(biāo)，檢測信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制不同溫度和凍融次數(shù)條件下的檢測信號(hào)變化曲線。從圖表中可以清晰地看出，在不同保存條件下，檢測試劑的穩(wěn)定性變化趨勢。例如，在37℃高溫條件下，隨著保存時(shí)間的延長，檢測信號(hào)強(qiáng)度迅速下降；而在-20℃低溫條件下，檢測信號(hào)強(qiáng)度在較長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定。這些數(shù)據(jù)為檢測試劑的保存和使用提供了科學(xué)依據(jù)，有助于確保檢測試劑在實(shí)際應(yīng)用中的性能穩(wěn)定性和可靠性。4.3糖蛋白定量檢測試劑性能指標(biāo)評(píng)價(jià)4.3.1準(zhǔn)確性為了驗(yàn)證糖蛋白定量檢測試劑的準(zhǔn)確性，選取了一系列已知濃度的糖蛋白樣本，涵蓋了從低濃度到高濃度的不同水平。這些樣本的濃度經(jīng)過嚴(yán)格的標(biāo)定，確保其準(zhǔn)確性和可靠性。按照檢測試劑的操作流程，對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測，每次檢測時(shí)均嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，包括溫度、反應(yīng)時(shí)間、試劑用量等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和可靠性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于低濃度（如5ng/ml）的糖蛋白樣本，檢測結(jié)果的平均值為5.2ng/ml，與已知濃度的偏差在可接受范圍內(nèi)，偏差率為4%。對(duì)于中濃度（如20ng/ml）的糖蛋白樣本，檢測結(jié)果的平均值為19.8ng/ml，偏差率為1%。對(duì)于高濃度（如50ng/ml）的糖蛋白樣本，檢測結(jié)果的平均值為49.5ng/ml，偏差率為1%。通過對(duì)不同濃度樣本的檢測結(jié)果分析，表明該檢測試劑在不同濃度范圍內(nèi)都具有較高的準(zhǔn)確性，能夠準(zhǔn)確地檢測出糖蛋白的含量。分析檢測結(jié)果的誤差來源，主要包括以下幾個(gè)方面。一是抗體與糖蛋白的結(jié)合反應(yīng)可能存在一定的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致檢測信號(hào)的干擾，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然在試劑的制備過程中，通過篩選高特異性的單克隆抗體和優(yōu)化反應(yīng)條件，盡量減少了非特異性結(jié)合的發(fā)生，但仍難以完全避免。二是檢測儀器的精度和穩(wěn)定性也會(huì)對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。例如，酶標(biāo)儀的讀數(shù)誤差、熒光檢測儀的靈敏度波動(dòng)等，都可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的偏差。實(shí)驗(yàn)操作過程中的誤差也是不可忽視的因素，如移液器的準(zhǔn)確性、樣本的混勻程度等，都可能影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。針對(duì)這些誤差來源，提出了相應(yīng)的改進(jìn)措施。對(duì)于非特異性結(jié)合問題，可以進(jìn)一步優(yōu)化抗體的篩選和純化工藝，提高抗體的特異性和親和力，減少非特異性結(jié)合的干擾。同時(shí)，在檢測過程中，可以增加洗滌步驟的次數(shù)和強(qiáng)度，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)和非特異性結(jié)合的物質(zhì)。對(duì)于檢測儀器的問題，定期對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，確保儀器的精度和穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)操作方面，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)人員的培訓(xùn)，提高操作技能和熟練度，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，減少操作誤差的產(chǎn)生。通過這些改進(jìn)措施的實(shí)施，有望進(jìn)一步提高糖蛋白定量檢測試劑的準(zhǔn)確性，為狂犬病的診斷和疫苗質(zhì)量控制提供更可靠的檢測數(shù)據(jù)。4.3.2線性范圍線性范圍是檢測試劑的重要性能指標(biāo)之一，它反映了檢測試劑在一定濃度范圍內(nèi)能夠準(zhǔn)確檢測目標(biāo)物質(zhì)的能力。為了確定糖蛋白定量檢測試劑的線性范圍，采用系列稀釋的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測。將糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品從高濃度到低濃度進(jìn)行梯度稀釋，制備成不同濃度的樣本，如100ng/ml、80ng/ml、60ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml等。按照檢測試劑的操作流程，對(duì)每個(gè)濃度的樣本進(jìn)行檢測，記錄檢測信號(hào)的強(qiáng)度。以糖蛋白的濃度為橫坐標(biāo)，檢測信號(hào)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析，確定該檢測試劑的線性范圍為5-80ng/ml。在這個(gè)線性范圍內(nèi)，檢測信號(hào)強(qiáng)度與糖蛋白濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.995以上。當(dāng)糖蛋白濃度低于5ng/ml時(shí)，檢測信號(hào)強(qiáng)度較弱，且檢測結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性有所下降；當(dāng)糖蛋白濃度高于80ng/ml時(shí)，檢測信號(hào)強(qiáng)度趨于飽和，無法準(zhǔn)確反映糖蛋白的濃度變化。線性范圍的確定對(duì)于檢測試劑的應(yīng)用具有重要意義。在狂犬病疫苗的質(zhì)量控制中，需要準(zhǔn)確檢測疫苗中糖蛋白的含量，以確保疫苗的質(zhì)量和效力。如果檢測試劑的線性范圍過窄，可能無法準(zhǔn)確檢測疫苗中糖蛋白的濃度，從而影響疫苗的質(zhì)量評(píng)估。在臨床診斷中，線性范圍的確定也有助于醫(yī)生準(zhǔn)確判斷患者體內(nèi)糖蛋白的含量，為疾病的診斷和治療提供依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)樣品中糖蛋白的大致含量，選擇合適的檢測方法