人脂肪干細胞與乳腺癌MCF-7、BT474細胞旁分泌機制的體外實驗解析一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌是全球女性健康的重大威脅，近年來其發(fā)病率持續(xù)攀升。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示，2020年乳腺癌新發(fā)病例數(shù)達226萬人，首次超過肺癌，成為“全球第一大癌”。在中國，乳腺癌同樣是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在城市中位居女性惡性腫瘤第二位，部分大城市甚至躍居首位，農(nóng)村中則居于第五位，且每年新增患者約42萬人，年發(fā)病率遞增3%-4%。隨著醫(yī)療水平的提高，乳腺癌患者的生存率有所提升，中國乳腺癌患者總體的5年生存率已超過80%，北京、上海、廣州等城市三甲醫(yī)院早期乳腺癌的5年生存率達到了90%以上，但疾病負擔依然沉重。在乳腺癌治療過程中，乳房整形對于患者的身心健康和生活質(zhì)量具有重要意義。許多乳腺癌患者在接受手術治療后，面臨著乳房缺失、變形等問題，這不僅影響了身體外觀，還對患者的心理造成了極大的創(chuàng)傷，導致自卑、焦慮等負面情緒。乳房整形手術能夠幫助患者恢復乳房的形態(tài)，重建自信，提高生活質(zhì)量。目前常見的乳房整形方式包括假體隆胸和自體脂肪移植隆胸等。假體隆胸適用于偏瘦、自體脂肪少的患者，但存在假體作為異物引發(fā)感染、包膜攣縮、破裂等并發(fā)癥的風險；自體脂肪移植隆胸則具有取材自身體組織、無排異反應、供區(qū)較多且能同時塑形等優(yōu)點，受到眾多患者的青睞。然而，自體脂肪移植隆胸在乳腺癌患者中的應用存在爭議。美國整形外科協(xié)會和法國整形外科協(xié)會對細胞輔助顆粒脂肪移植的生物安全性提出質(zhì)疑，盡管臨床病例對照研究尚未發(fā)現(xiàn)確鑿證據(jù)表明其對乳腺癌復發(fā)、局部浸潤以及遠處轉移有影響，但仍需要大量臨床病例研究進行遠期隨訪。自體脂肪移植隆胸涉及人脂肪干細胞（hADSCs）的應用，hADSCs具有多向分化潛能和旁分泌功能，在組織修復和再生中發(fā)揮重要作用。當hADSCs被移植到體內(nèi)后，會與周圍細胞，尤其是乳腺癌細胞相互作用。研究表明，乳腺癌細胞與hADSCs之間主要通過旁分泌相應的細胞因子，互相刺激彼此生長、增殖、遷移，同時對hADSCs的多向分化功能產(chǎn)生一定影響。在乳腺癌術后切除局部區(qū)域進行細胞輔助脂肪移植（CAL）時，hADSCs所處微環(huán)境發(fā)生改變，其成脂分化受到何種影響尚不清楚，而且移植的hADSCs是否會在乳腺癌術后微環(huán)境中存活、正常分化及其轉歸如何，以及對乳腺癌細胞侵襲力產(chǎn)生何種作用，作用機理是什么，這些問題都亟待深入研究。深入探究hADSCs與乳腺癌細胞之間的旁分泌機制，對于解決自體脂肪移植隆胸在乳腺癌患者中應用的爭議具有關鍵意義。通過明確兩者之間的相互作用機制，可以為乳腺癌患者的乳房整形手術提供更科學的理論依據(jù)，評估手術的安全性和可行性，指導臨床醫(yī)生制定更合理的治療方案，降低手術風險，提高治療效果，最終改善乳腺癌患者的生活質(zhì)量。同時，這一研究也有助于拓展對乳腺癌發(fā)病機制和腫瘤微環(huán)境的認識，為乳腺癌的治療和預防開辟新的思路和方法，具有重要的臨床價值和科學意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1人脂肪干細胞的研究進展人脂肪干細胞（hADSCs）是一類從脂肪組織中分離得到的成體干細胞，因其來源廣泛、取材方便、對供體損傷小等優(yōu)勢，成為再生醫(yī)學領域的研究熱點。hADSCs具有多向分化潛能，在適當?shù)恼T導條件下，能夠分化為脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、神經(jīng)細胞等多種細胞類型。例如，在特定的成脂誘導培養(yǎng)基中，hADSCs可分化為成熟的脂肪細胞，通過觀察細胞內(nèi)脂滴的形成和脂肪相關基因的表達來驗證其成脂分化能力。在骨組織工程研究中，hADSCs能在成骨誘導因子的作用下，分化為成骨細胞，促進骨組織的形成和修復，這為治療骨缺損等疾病提供了新的策略。hADSCs還具有強大的旁分泌功能，能夠分泌多種生物活性因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、轉化生長因子-β（TGF-β）等。這些因子在細胞增殖、分化、遷移、血管生成、免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用。其中，VEGF能夠促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移，增加血管通透性，有助于構建富含血管的組織微環(huán)境，為組織修復和再生提供充足的營養(yǎng)供應；HGF具有促進細胞增殖、抗凋亡、誘導上皮-間充質(zhì)轉化等多種生物學功能，在組織損傷修復和器官再生中發(fā)揮關鍵作用。此外，hADSCs分泌的細胞因子還可以調(diào)節(jié)免疫細胞的活性和功能，抑制炎癥反應，促進組織的修復和再生。在臨床應用方面，hADSCs已被嘗試用于多種疾病的治療，如整形外科的組織修復與重建、皮膚科的皮膚損傷修復與美容、心血管科的心肌梗死治療等。在脂肪移植領域，hADSCs的應用可以提高脂肪移植的成活率，改善脂肪移植的效果。有研究表明，將hADSCs與脂肪顆?；旌弦浦?，能夠促進移植脂肪組織的血管化，減少脂肪吸收和壞死，提高移植脂肪的存活率和穩(wěn)定性。在皮膚修復方面，hADSCs分泌的細胞因子可以促進皮膚細胞的增殖和遷移，加速傷口愈合，減少瘢痕形成。1.2.2乳腺癌MCF-7和BT474細胞的研究進展乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，根據(jù)其分子特征可分為不同的亞型，其中MCF-7和BT474細胞是兩種常見的乳腺癌細胞系，代表了不同的分子亞型，在乳腺癌研究中具有重要意義。MCF-7細胞屬于雌激素受體（ER）陽性、孕激素受體（PR）陽性、人表皮生長因子受體2（HER2）陰性的乳腺癌細胞系，約占所有乳腺癌的60%-70%。這類細胞對內(nèi)分泌治療敏感，內(nèi)分泌治療是其主要的治療手段之一。MCF-7細胞具有典型的上皮細胞形態(tài)，生長相對緩慢，在體外培養(yǎng)條件下呈貼壁生長。研究發(fā)現(xiàn)，MCF-7細胞的增殖和存活依賴于雌激素的刺激，雌激素與ER結合后，激活下游信號通路，促進細胞周期相關蛋白的表達，從而推動細胞增殖。此外，MCF-7細胞還表達多種生長因子受體和細胞因子，這些分子在細胞的生長、遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。BT474細胞則屬于ER陽性、PR陽性、HER2過表達的乳腺癌細胞系，約占乳腺癌的15%-20%。BT474細胞對HER2靶向治療和內(nèi)分泌治療均有一定的敏感性。與MCF-7細胞相比，BT474細胞具有更強的侵襲和轉移能力。HER2基因的過表達導致其編碼的HER2蛋白在細胞表面大量表達，激活下游的PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路，促進細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，BT474細胞還能夠分泌多種細胞因子和趨化因子，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤的生長和轉移。近年來，針對MCF-7和BT474細胞的研究主要集中在探索新的治療靶點和治療方法，以及深入研究其分子生物學特性和腫瘤微環(huán)境的相互作用。例如，通過基因編輯技術敲除或沉默相關基因，研究其對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，以尋找潛在的治療靶點；利用單細胞測序技術分析細胞的異質(zhì)性，揭示不同細胞亞群的分子特征和功能，為精準治療提供依據(jù)。1.2.3人脂肪干細胞與乳腺癌細胞旁分泌機制的研究現(xiàn)狀hADSCs與乳腺癌細胞之間的旁分泌機制是當前研究的熱點之一，二者通過旁分泌相互作用，對彼此的生物學行為產(chǎn)生重要影響。一方面，乳腺癌細胞可以通過旁分泌作用影響hADSCs的生物學功能。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞分泌的細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，能夠誘導hADSCs向癌相關成纖維細胞（CAFs）轉化。這種轉化后的CAFs具有促進腫瘤生長、侵襲和轉移的能力，它們可以分泌更多的細胞因子和趨化因子，如基質(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，招募免疫細胞和血管內(nèi)皮細胞，促進腫瘤血管生成和免疫逃逸。此外，乳腺癌細胞還可以通過旁分泌作用抑制hADSCs的成脂分化能力，使其向有利于腫瘤生長的方向分化。有研究表明，乳腺癌細胞分泌的外泌體能夠?qū)⑵鋽y帶的miRNA傳遞給hADSCs，通過調(diào)控相關基因的表達，抑制hADSCs的成脂分化。另一方面，hADSCs也可以通過旁分泌作用影響乳腺癌細胞的生物學行為。hADSCs分泌的多種細胞因子，如VEGF、HGF等，能夠促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。VEGF可以促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，從而支持腫瘤的生長和轉移；HGF可以激活乳腺癌細胞表面的c-Met受體，啟動下游信號通路，促進細胞的遷移和侵襲。此外，hADSCs分泌的外泌體也可以調(diào)節(jié)乳腺癌細胞的生物學功能，外泌體中攜帶的蛋白質(zhì)、核酸等生物活性分子可以進入乳腺癌細胞，影響其基因表達和信號轉導。然而，目前關于hADSCs與乳腺癌細胞旁分泌機制的研究仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。首先，二者之間旁分泌作用的具體分子機制尚未完全明確，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些參與旁分泌調(diào)節(jié)的細胞因子和信號通路，但它們之間的相互作用網(wǎng)絡和調(diào)控機制還需要進一步深入研究。其次，不同研究結果之間存在一定的差異，這可能與實驗條件、細胞系來源、研究方法等因素有關，需要進行更多的標準化研究來驗證和統(tǒng)一研究結果。此外，hADSCs與乳腺癌細胞在體內(nèi)復雜微環(huán)境中的旁分泌相互作用，以及這種相互作用對腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療效果的影響，還需要通過動物實驗和臨床研究進一步探索。1.3研究目的與內(nèi)容1.3.1研究目的本研究旨在通過體外實驗，深入探究人脂肪干細胞（hADSCs）與乳腺癌MCF-7、BT474細胞之間的旁分泌機制，明確hADSCs對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為的影響，以及乳腺癌細胞對hADSCs成脂分化能力的作用，揭示二者旁分泌相互作用的分子機制，為乳腺癌患者自體脂肪移植隆胸的安全性評估提供理論依據(jù)，為臨床治療和乳房整形提供新的思路和方法。具體而言，研究目的包括以下幾個方面：明確hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞旁分泌機制對彼此生物學功能的影響，確定hADSCs對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力的促進或抑制作用，以及乳腺癌細胞對hADSCs成脂分化能力的改變情況。揭示hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞旁分泌相互作用的分子機制，尋找參與旁分泌調(diào)節(jié)的關鍵細胞因子和信號通路，為進一步理解乳腺癌的發(fā)生發(fā)展機制提供理論支持。探索hADSCs在乳腺癌術后微環(huán)境中的存活、分化及其轉歸情況，評估自體脂肪移植隆胸在乳腺癌患者中的潛在風險，為臨床應用提供科學依據(jù)。1.3.2研究內(nèi)容為實現(xiàn)上述研究目的，本研究將開展以下幾方面的工作：hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞的培養(yǎng)與鑒定：從脂肪組織中分離培養(yǎng)hADSCs，采用流式細胞術檢測其表面標志物，鑒定其干細胞特性；培養(yǎng)乳腺癌MCF-7、BT474細胞，通過形態(tài)學觀察、細胞增殖實驗等方法對其進行鑒定，確保細胞的生物學特性符合實驗要求。hADSCs對乳腺癌MCF-7、BT474細胞功能影響的研究：建立hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞的共培養(yǎng)體系，通過Transwell實驗、劃痕實驗等方法檢測乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力；采用CCK-8法檢測乳腺癌細胞的增殖能力；利用Westernblot、qPCR等技術檢測與細胞增殖、遷移和侵襲相關的蛋白和基因的表達水平，分析hADSCs對乳腺癌細胞生物學行為的影響。乳腺癌MCF-7、BT474細胞對hADSCs成脂分化影響的研究：將hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞進行共培養(yǎng)，在成脂誘導條件下，通過油紅O染色觀察hADSCs的成脂分化情況，檢測脂肪相關基因和蛋白的表達水平，探究乳腺癌細胞對hADSCs成脂分化能力的影響。hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞旁分泌細胞因子的檢測與分析：收集hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞共培養(yǎng)體系的上清液，采用ELISA、蛋白質(zhì)芯片等技術檢測其中的細胞因子含量，篩選出差異表達的細胞因子；通過細胞因子阻斷實驗，研究關鍵細胞因子在hADSCs與乳腺癌細胞旁分泌相互作用中的作用機制。hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞旁分泌作用信號通路的研究：利用Westernblot、免疫熒光等技術檢測與細胞增殖、遷移、侵襲和分化相關的信號通路關鍵蛋白的磷酸化水平，確定hADSCs與乳腺癌細胞旁分泌相互作用涉及的信號通路；通過信號通路抑制劑處理，驗證信號通路在旁分泌調(diào)節(jié)中的作用，揭示二者旁分泌相互作用的分子機制。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法細胞培養(yǎng)：從脂肪組織中分離hADSCs，采用組織塊貼壁法或酶消化法進行培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液，待細胞融合度達到80%-90%時進行傳代。乳腺癌MCF-7、BT474細胞采用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與hADSCs相同。Transwell遷移和侵襲實驗：將乳腺癌MCF-7、BT474細胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含有hADSCs培養(yǎng)上清液的培養(yǎng)基作為趨化因子，培養(yǎng)一定時間后，用棉簽擦去上室未遷移的細胞，固定、染色遷移到下室的細胞，在顯微鏡下計數(shù)，評估乳腺癌細胞的遷移能力；在遷移實驗的基礎上，在上室小室底部鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，可檢測乳腺癌細胞的侵襲能力。流式細胞術：用于檢測hADSCs的表面標志物，如CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD45等，以鑒定其干細胞特性；同時，也可通過流式細胞術檢測細胞周期、凋亡等指標，分析hADSCs與乳腺癌細胞相互作用對細胞生物學行為的影響。ELISA：收集hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞共培養(yǎng)體系的上清液，采用ELISA試劑盒檢測其中細胞因子的含量，如VEGF、HGF、TNF-α、IL-6等，分析細胞因子在旁分泌相互作用中的變化。Westernblot：提取細胞總蛋白，通過SDS電泳分離蛋白，轉膜后用特異性抗體檢測與細胞增殖、遷移、侵襲和分化相關的蛋白表達水平，如PCNA、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、PPARγ等，確定hADSCs與乳腺癌細胞旁分泌相互作用涉及的信號通路和關鍵蛋白。qPCR：提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA后，采用qPCR技術檢測相關基因的表達水平，如與細胞增殖、遷移、侵襲和分化相關的基因，驗證Westernblot結果，并進一步分析基因表達的變化。油紅O染色：將hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞共培養(yǎng)后，進行成脂誘導分化，在誘導分化的不同時間點，用4%多聚甲醛固定細胞，油紅O染液染色，觀察細胞內(nèi)脂滴的形成情況，評估乳腺癌細胞對hADSCs成脂分化能力的影響。1.4.2技術路線本研究的技術路線如圖1所示：細胞獲取與培養(yǎng)：獲取脂肪組織和乳腺癌組織，分別分離培養(yǎng)hADSCs和乳腺癌MCF-7、BT474細胞，對培養(yǎng)的細胞進行鑒定，確保細胞的生物學特性符合實驗要求。共培養(yǎng)體系建立：將hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞按照一定比例進行共培養(yǎng)，設置對照組和實驗組，培養(yǎng)一定時間。細胞功能檢測：通過Transwell實驗、劃痕實驗檢測乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力；采用CCK-8法檢測乳腺癌細胞的增殖能力；通過油紅O染色觀察hADSCs的成脂分化情況。細胞因子檢測：收集共培養(yǎng)體系的上清液，采用ELISA、蛋白質(zhì)芯片等技術檢測其中的細胞因子含量，篩選出差異表達的細胞因子。分子機制研究：利用Westernblot、qPCR、免疫熒光等技術檢測與細胞增殖、遷移、侵襲和分化相關的蛋白和基因的表達水平，確定hADSCs與乳腺癌細胞旁分泌相互作用涉及的信號通路；通過信號通路抑制劑處理，驗證信號通路在旁分泌調(diào)節(jié)中的作用。結果分析與討論：對實驗結果進行統(tǒng)計分析，總結hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞旁分泌機制對彼此生物學功能的影響，揭示旁分泌相互作用的分子機制，討論研究結果的臨床意義和潛在應用價值。[此處插入技術路線圖，圖1：人脂肪干細胞與乳腺癌MCF-7、BT474細胞旁分泌機制影響的體外實驗研究技術路線圖，包括細胞獲取與培養(yǎng)、共培養(yǎng)體系建立、細胞功能檢測、細胞因子檢測、分子機制研究、結果分析與討論等步驟，各步驟之間用箭頭連接，清晰展示研究的流程和邏輯關系]二、人脂肪干細胞與乳腺癌細胞的培養(yǎng)及鑒定2.1實驗材料準備本實驗所需的主要儀器設備和試劑如下：主要儀器設備：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific，美國），用于為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和二氧化碳濃度（5%）環(huán)境，以滿足細胞生長的需求；超凈工作臺（蘇州凈化，中國），為細胞操作提供無菌環(huán)境，有效防止微生物污染；低速離心機（上海安亭，中國），用于細胞懸液的離心分離，通過控制離心速度和時間，實現(xiàn)細胞與上清液的分離；倒置顯微鏡（Olympus，日本），可實時觀察細胞的生長狀態(tài)、形態(tài)變化等；酶標儀（Bio-Tek，美國），用于檢測細胞增殖實驗中吸光度值，通過對特定波長光的吸收程度來定量分析細胞數(shù)量或活性；PCR儀（ABI，美國），進行基因擴增反應，通過精確控制溫度和時間，實現(xiàn)目標基因的大量擴增；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國），用于觀察和分析PCR產(chǎn)物的電泳結果，通過對凝膠中DNA條帶的成像和分析，確定基因的表達情況。主要試劑：DMEM低糖培養(yǎng)基（Gibco，美國），為hADSCs的培養(yǎng)提供基本的營養(yǎng)物質(zhì)，包括氨基酸、維生素、糖類等；RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco，美國），用于乳腺癌MCF-7、BT474細胞的培養(yǎng)，滿足其生長所需的營養(yǎng)條件；胎牛血清（FBS，Hyclone，美國），含有豐富的生長因子和營養(yǎng)成分，能夠促進細胞的生長和增殖，在兩種細胞的培養(yǎng)基中均按10%的比例添加；青霉素-鏈霉素雙抗（索萊寶，中國），可防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，在培養(yǎng)基中的添加比例為1%；胰蛋白酶（Gibco，美國），用于細胞的消化傳代，將貼壁生長的細胞從培養(yǎng)瓶壁上分離下來；Ⅰ型膠原酶（索萊寶，中國），在hADSCs的提取過程中，用于消化脂肪組織，使脂肪干細胞從組織中釋放出來；流式細胞術檢測抗體，如CD29-FITC、CD44-PE、CD90-APC、CD105-PerCP、CD34-APC-Cy7、CD45-PE-Cy7（eBioscience，美國）等，用于檢測hADSCs的表面標志物，以鑒定其干細胞特性；CCK-8試劑盒（Dojindo，日本），用于檢測細胞的增殖能力，通過檢測細胞對CCK-8試劑的還原程度來反映細胞的活性和增殖情況；Transwell小室（Corning，美國），用于進行細胞遷移和侵襲實驗，通過小室上下層的細胞分布情況來評估細胞的遷移和侵襲能力；Matrigel基質(zhì)膠（Corning，美國），在細胞侵襲實驗中，鋪在Transwell小室的上室底部，模擬細胞外基質(zhì)，檢測細胞穿透基質(zhì)膠的能力；ELISA試劑盒（R&DSystems，美國），用于檢測細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子的含量，通過特異性抗體與細胞因子的結合，實現(xiàn)對細胞因子的定量檢測；蛋白提取試劑盒（ThermoScientific，美國），用于提取細胞中的總蛋白，為后續(xù)的Westernblot實驗做準備；Westernblot相關試劑，包括SDS凝膠制備試劑盒、PVDF膜、封閉液、一抗、二抗等（Bio-Rad，美國），用于檢測細胞中蛋白的表達水平，通過電泳分離蛋白、轉膜、免疫雜交等步驟，確定目標蛋白的表達情況；qPCR相關試劑，包括RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBRGreen熒光染料等（Takara，日本），用于檢測細胞中基因的表達水平，通過提取RNA、反轉錄為cDNA、實時熒光定量PCR等步驟，實現(xiàn)對基因表達的定量分析；油紅O染液（Sigma，美國），用于檢測hADSCs的成脂分化情況，通過對細胞內(nèi)脂滴的染色，直觀地觀察成脂分化程度。2.2人脂肪干細胞的分離與培養(yǎng)人脂肪干細胞（hADSCs）的分離與培養(yǎng)是本實驗的關鍵環(huán)節(jié)，其具體步驟如下：脂肪組織獲?。涸跓o菌條件下，從接受脂肪抽吸術或手術切除的患者腹部或大腿等部位獲取脂肪組織，約5-10g。獲取過程中需嚴格遵循無菌操作原則，避免組織污染。將獲取的脂肪組織迅速放入含有500U/ml雙抗（青霉素-鏈霉素）的PBS緩沖液的無菌容器中，冰上保存，并盡快送往實驗室進行處理。脂肪組織清洗與剪碎：在超凈工作臺內(nèi)，將脂肪組織轉移至無菌培養(yǎng)皿中，用含有雙抗的PBS充分漂洗3-5遍，以去除組織表面的血液、雜質(zhì)和可能存在的細菌。使用眼科剪仔細剔除肉眼可見的血管及結締組織，將脂肪組織剪成約1mm×1mm大小的碎塊，盡量剪碎以增加消化面積，提高細胞分離效率。剪碎后的脂肪組織再次用PBS反復沖洗，直至沖洗液清澈，盡量除去紅細胞。酶消化：將剪碎的脂肪組織轉移至50ml離心管中，加入2倍體積的0.1%-0.2%Ⅰ型膠原酶，確保膠原酶與脂肪組織充分接觸，振蕩混勻后，將離心管置于37℃恒溫水浴箱或恒溫搖床中消化60-120min，期間每隔15-30min輕輕振蕩離心管，使消化更加均勻。Ⅰ型膠原酶能夠特異性地消化脂肪組織中的細胞外基質(zhì)，使hADSCs從組織中釋放出來。終止消化與離心：消化結束后，加入等體積的含有10%胎牛血清（FBS）的低糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，輕輕顛倒離心管混勻。將離心管放入低速離心機中，1500-2000r/min離心10-15min，使細胞沉淀。離心后，溶液分為三層，上層為油脂及未消化完全的脂肪組織，中層為上清液，下層為脂肪干細胞和紅細胞等混合細胞的沉淀。細胞重懸與過濾：小心棄去上層和中層液體，保留下層細胞沉淀。加入適量的完全培養(yǎng)基（低糖DMEM+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素）重懸細胞沉淀，用吸管輕輕吹打均勻，使細胞充分分散。將細胞懸液通過70μm細胞篩網(wǎng)過濾，去除未消化的組織塊和細胞團，獲得單細胞懸液。細胞篩網(wǎng)的使用可以保證細胞懸液的均一性，避免大顆粒物質(zhì)對后續(xù)實驗的影響。細胞接種與培養(yǎng)：將過濾后的細胞懸液調(diào)整細胞濃度為1×10?-5×10?個/ml，接種至6孔板或細胞培養(yǎng)瓶中，每孔或每瓶加入適量的細胞懸液，輕輕晃動使細胞均勻分布。將培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶放入37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)保持95%的濕度，為細胞提供適宜的生長環(huán)境。細胞換液與傳代：原代hADSCs培養(yǎng)24h后進行半量換液，去除未貼壁的細胞和雜質(zhì)；48h后進行全量換液，此后每2-3d換液一次，以保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和酸堿度。當原代hADSCs生長融合達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用PBS輕輕潤洗細胞1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入適量的0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化2-5min，在倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓并開始脫落時，加入等體積的含有10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落并形成單細胞懸液，將細胞懸液轉移至離心管中，1000-1500r/min離心5-10min，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，按1:2-1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。傳代過程中要注意操作輕柔，避免對細胞造成損傷，同時要嚴格控制消化時間，防止消化過度導致細胞死亡。2.3乳腺癌MCF-7、BT474細胞的培養(yǎng)乳腺癌MCF-7和BT474細胞的培養(yǎng)是本研究的重要基礎，以下為詳細的培養(yǎng)過程：培養(yǎng)基準備：使用含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基。將RPMI1640干粉培養(yǎng)基按照說明書要求加入適量的雙蒸水，充分溶解后，加入10%的FBS和1%的青霉素-鏈霉素雙抗，輕輕混勻，用0.22μm的無菌濾器過濾除菌，分裝后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。細胞復蘇：從液氮罐中取出凍存的乳腺癌MCF-7、BT474細胞，迅速放入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，使其在1-2min內(nèi)快速融化。將融化后的細胞懸液轉移至含有5-10ml完全培養(yǎng)基（RPMI1640+10%FBS+1%青霉素-鏈霉素）的離心管中，1000-1500r/min離心5-10min，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞。將重懸后的細胞接種至細胞培養(yǎng)瓶中，輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使細胞均勻分布，放入37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)箱需提前預熱至37℃，并確保CO?濃度穩(wěn)定在5%，濕度保持在95%左右。將接種有乳腺癌細胞的培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱后，每隔24h在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞的形態(tài)、密度、貼壁情況等。當細胞生長至融合度達到80%-90%時，需進行傳代培養(yǎng)。細胞傳代：倒掉培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕潤洗細胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化液，覆蓋細胞表面，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-3min。在倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓并開始脫落時，立即加入等體積的含有10%FBS的培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落并形成單細胞懸液，將細胞懸液轉移至離心管中，1000-1500r/min離心5-10min，棄去上清液。加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:2-1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代過程中要注意無菌操作，避免細胞污染，同時要控制好消化時間，防止消化過度導致細胞損傷或死亡。2.4細胞鑒定方法2.4.1人脂肪干細胞鑒定形態(tài)學觀察：在倒置顯微鏡下定期觀察hADSCs的形態(tài)變化。原代hADSCs接種后，在最初的24小時內(nèi)，細胞開始逐漸貼壁，呈圓形或短梭形，體積較小。隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞逐漸伸展，變?yōu)殚L梭形，類似于成纖維細胞的形態(tài)。細胞之間排列緊密，呈漩渦狀或放射狀生長。在傳代過程中，細胞形態(tài)相對穩(wěn)定，保持長梭形的外觀，但細胞的生長速度和活力可能會隨著傳代次數(shù)的增加而發(fā)生一定的變化。通過形態(tài)學觀察，可以初步判斷hADSCs的生長狀態(tài)和純度，排除其他類型細胞的污染。流式細胞術檢測表面標志物：取第3代hADSCs，用胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/ml。將細胞懸液分別加入含有不同熒光標記抗體的EP管中，包括CD29-FITC、CD44-PE、CD90-APC、CD105-PerCP、CD34-APC-Cy7、CD45-PE-Cy7等，4℃避光孵育30-45min。孵育結束后，用PBS洗滌細胞2-3次，去除未結合的抗體。將細胞重懸于適量的PBS中，用流式細胞儀進行檢測。hADSCs高表達間充質(zhì)干細胞相關標志物CD29、CD44、CD90、CD105，陽性表達率通常應大于95%；低表達造血干細胞標志物CD34和免疫細胞標志物CD45，陽性表達率一般小于5%。通過流式細胞術檢測表面標志物，可以準確鑒定hADSCs，確定其干細胞特性。多向分化潛能實驗：將第3代hADSCs以適當密度接種于6孔板中，待細胞融合度達到70%-80%時，分別進行成脂、成骨、成軟骨誘導分化實驗。成脂誘導分化：使用成脂誘導培養(yǎng)基（含地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛等）培養(yǎng)hADSCs，每2-3天換液一次。誘導2-3周后，用4%多聚甲醛固定細胞，油紅O染色。在顯微鏡下觀察，可見細胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴，表明hADSCs成功分化為脂肪細胞。成骨誘導分化：采用成骨誘導培養(yǎng)基（含地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C等）培養(yǎng)hADSCs，同樣每2-3天換液一次。誘導3-4周后，用4%多聚甲醛固定細胞，進行茜素紅染色。若細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)紅色鈣結節(jié)，說明hADSCs分化為成骨細胞。成軟骨誘導分化：將hADSCs懸浮于成軟骨誘導培養(yǎng)基（含轉化生長因子-β、地塞米松、胰島素等）中，在離心管中離心形成細胞團，然后將細胞團置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。誘導4-6周后，取出細胞團，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進行番紅O-固綠染色。在顯微鏡下觀察，若細胞團中出現(xiàn)紅色的軟骨基質(zhì)，證明hADSCs分化為軟骨細胞。通過多向分化潛能實驗，進一步驗證hADSCs的干細胞特性。2.4.2乳腺癌細胞鑒定形態(tài)學觀察：在倒置顯微鏡下觀察乳腺癌MCF-7和BT474細胞的形態(tài)特征。MCF-7細胞呈上皮細胞樣，細胞形態(tài)較為規(guī)則，多為多邊形或梭形，邊界清晰，細胞之間緊密相連，呈鋪路石樣排列。細胞生長相對緩慢，在培養(yǎng)過程中可形成細胞簇。BT474細胞同樣具有上皮細胞的形態(tài)特點，但與MCF-7細胞相比，BT474細胞的體積略大，形態(tài)更為不規(guī)則，細胞之間的連接相對松散。細胞生長速度較快，具有較強的增殖能力。通過形態(tài)學觀察，可以初步判斷乳腺癌細胞的類型和生長狀態(tài)，為后續(xù)實驗提供基礎。細胞生長曲線繪制：采用CCK-8法繪制乳腺癌細胞的生長曲線。將處于對數(shù)生長期的MCF-7和BT474細胞以5×103-1×10?個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100-200μl培養(yǎng)基，設置5-6個復孔。分別在接種后的第1、2、3、4、5、6、7天進行檢測，每孔加入10-20μlCCK-8試劑，37℃孵育1-4h，使細胞充分吸收試劑。用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），以時間為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。MCF-7細胞的生長曲線通常呈現(xiàn)出典型的“S”型，在接種后的前2-3天，細胞處于潛伏期，生長緩慢，OD值變化較小；隨后進入對數(shù)生長期，細胞增殖速度加快，OD值迅速上升；在培養(yǎng)5-7天后，細胞逐漸進入平臺期，生長速度減緩，OD值趨于穩(wěn)定。BT474細胞的生長曲線也呈“S”型，但與MCF-7細胞相比，BT474細胞的對數(shù)生長期持續(xù)時間較長，細胞增殖速度更快，達到平臺期的時間相對較晚。通過繪制細胞生長曲線，可以了解乳腺癌細胞的生長特性和增殖能力。分子生物學檢測：利用qPCR和Westernblot技術檢測乳腺癌細胞中相關分子標志物的表達。qPCR檢測：提取MCF-7和BT474細胞的總RNA，反轉錄為cDNA后，以cDNA為模板，使用特異性引物進行qPCR擴增。檢測雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體2（HER2）等基因的表達水平。MCF-7細胞中ER和PR基因呈高表達，HER2基因表達水平較低；BT474細胞中ER和PR基因表達水平較高，同時HER2基因呈過表達狀態(tài)。通過qPCR檢測，可以從基因水平鑒定乳腺癌細胞的分子亞型。Westernblot檢測：提取細胞總蛋白，通過SDS電泳分離蛋白，轉膜后用特異性抗體檢測ER、PR、HER2等蛋白的表達水平。結果與qPCR檢測一致，MCF-7細胞中ER和PR蛋白表達量較高，HER2蛋白表達量較低；BT474細胞中ER、PR和HER2蛋白均呈高表達。此外，還可以檢測與細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關的蛋白，如PCNA、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin等，進一步了解乳腺癌細胞的生物學特性。通過分子生物學檢測，可以準確鑒定乳腺癌細胞的類型和分子特征。2.5實驗質(zhì)量控制在整個實驗過程中，實施嚴格的質(zhì)量控制措施是確保實驗結果準確性和可靠性的關鍵。以下從細胞培養(yǎng)、細胞鑒定以及實驗重復性等方面詳細闡述質(zhì)量控制方法。細胞培養(yǎng)質(zhì)量控制：細胞培養(yǎng)過程中的無菌操作至關重要。在進行脂肪組織獲取、細胞分離、傳代、換液等操作時，均需在超凈工作臺內(nèi)完成，超凈工作臺需提前30分鐘開啟紫外燈進行消毒滅菌，操作前用75%酒精擦拭臺面，以消除可能存在的微生物污染。所有使用的培養(yǎng)基、試劑、耗材等均需經(jīng)過嚴格的滅菌處理，培養(yǎng)基和試劑需在無菌條件下配制，并通過0.22μm的無菌濾器過濾除菌，確保無細菌、真菌、支原體等微生物污染。定期對細胞培養(yǎng)環(huán)境進行微生物檢測，包括培養(yǎng)箱內(nèi)的空氣、水盤以及培養(yǎng)瓶表面等，可采用無菌培養(yǎng)基進行培養(yǎng)觀察，若發(fā)現(xiàn)有微生物生長，需及時對培養(yǎng)箱進行清潔和消毒處理。同時，密切觀察細胞的生長狀態(tài)，如發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)異常、生長速度減慢、出現(xiàn)黑點或渾濁等現(xiàn)象，應及時進行檢測和分析，判斷是否存在污染或其他問題。對于hADSCs的培養(yǎng)，要嚴格控制消化時間和傳代次數(shù)，避免過度消化導致細胞損傷或死亡，傳代次數(shù)過多也可能導致細胞特性改變，一般選擇3-5代的hADSCs進行實驗，以保證細胞的生物學特性穩(wěn)定。細胞鑒定質(zhì)量控制：在細胞鑒定過程中，形態(tài)學觀察需由經(jīng)驗豐富的實驗人員進行，確保觀察結果的準確性和一致性。對于hADSCs，應熟悉其在不同培養(yǎng)階段的典型形態(tài)特征，如原代細胞的貼壁形態(tài)、傳代后細胞的長梭形外觀以及細胞的排列方式等。在流式細胞術檢測表面標志物時，要嚴格按照操作規(guī)程進行抗體孵育、洗滌等步驟，確?？贵w與細胞表面標志物充分結合，減少非特異性結合的干擾。同時，設置陰性對照和同型對照，以準確判斷細胞表面標志物的表達情況。在多向分化潛能實驗中，誘導分化的條件需嚴格控制，培養(yǎng)基的成分、添加物的濃度以及誘導時間等都要保持一致。每種分化誘導實驗都要設置陽性對照，如在成脂誘導實驗中，使用已知具有成脂分化能力的細胞系作為陽性對照，以驗證誘導體系的有效性。對于乳腺癌細胞的鑒定，形態(tài)學觀察要準確把握MCF-7和BT474細胞的特征差異，避免混淆。細胞生長曲線繪制過程中，實驗操作要規(guī)范，保證細胞接種密度均勻，培養(yǎng)條件一致，檢測時間點準確，以確保生長曲線的準確性和可重復性。分子生物學檢測時，引物設計要經(jīng)過嚴格的篩選和驗證，確保引物的特異性和擴增效率。實驗過程中設置內(nèi)參基因，以校正樣本間的差異，提高檢測結果的可靠性。實驗重復性質(zhì)量控制：為保證實驗結果的可重復性，所有實驗均需設置足夠數(shù)量的生物學重復和技術重復。在細胞實驗中，每個實驗組至少設置3個生物學重復，即使用不同來源的細胞樣本進行相同實驗，以排除個體差異對實驗結果的影響。同時，每個生物學重復再設置3-5個技術重復，如在CCK-8實驗中，每個樣本設置5個復孔進行檢測，取平均值作為實驗結果，以減少實驗誤差。實驗操作過程要嚴格按照標準操作規(guī)程（SOP）進行，確保實驗條件的一致性。對于關鍵實驗步驟，如細胞消化時間、試劑添加量、反應溫度和時間等，要進行詳細記錄，以便在重復實驗時能夠準確重現(xiàn)。實驗數(shù)據(jù)的采集和分析要采用標準化的方法，使用專業(yè)的統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，確保數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。對于實驗結果的差異，要進行合理的統(tǒng)計學分析，判斷其是否具有顯著性差異，避免因?qū)嶒炚`差或偶然因素導致錯誤的結論。定期對實驗結果進行回顧和總結，對出現(xiàn)的問題及時進行分析和改進，不斷優(yōu)化實驗方案，提高實驗的重復性和可靠性。三、旁分泌機制對細胞功能的影響3.1共培養(yǎng)體系的建立為深入探究人脂肪干細胞（hADSCs）與乳腺癌MCF-7、BT474細胞之間的旁分泌機制，本研究建立了兩種共培養(yǎng)體系，即直接共培養(yǎng)體系和間接共培養(yǎng)體系。直接共培養(yǎng)體系的構建方法為：將處于對數(shù)生長期的hADSCs和乳腺癌MCF-7、BT474細胞分別用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。按照1:1的比例將hADSCs與MCF-7細胞、hADSCs與BT474細胞混合，調(diào)整細胞濃度至1×10?-5×10?個/ml。取適量混合細胞懸液接種于6孔板中，每孔加入2-3ml，輕輕晃動使細胞均勻分布。將6孔板放入37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中定期觀察細胞的生長狀態(tài)和相互作用情況。直接共培養(yǎng)體系的原理是讓兩種細胞直接接觸，通過細胞表面的分子相互作用以及細胞間的直接通訊，如縫隙連接等，實現(xiàn)細胞間的物質(zhì)交換和信號傳遞，從而研究它們之間的旁分泌機制。在這種體系中，細胞可以直接感知彼此的存在，分泌的細胞因子和其他信號分子能夠迅速作用于對方細胞，促進或抑制對方細胞的生物學功能。間接共培養(yǎng)體系則采用Transwell小室進行構建。Transwell小室由上室和下室組成，中間以聚碳酸酯膜分隔，膜上有孔徑為0.4-8μm的小孔，允許小分子物質(zhì)和細胞因子通過，但細胞無法通過。實驗時，將hADSCs接種于Transwell小室的上室，調(diào)整細胞濃度為1×10?-5×10?個/ml，每孔加入100-200μl細胞懸液。將乳腺癌MCF-7、BT474細胞接種于下室，細胞濃度同樣調(diào)整為1×10?-5×10?個/ml，每孔加入600-800μl細胞懸液。在接種過程中，要特別注意避免小室和下室之間產(chǎn)生氣泡，以免影響細胞的生長和物質(zhì)交換。將接種好細胞的Transwell小室放入培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。間接共培養(yǎng)體系的原理是利用Transwell小室的半透膜特性，使兩種細胞在空間上相互隔離，但可以通過分泌到培養(yǎng)基中的細胞因子、趨化因子等小分子物質(zhì)進行間接通訊。這種體系能夠排除細胞直接接觸對實驗結果的干擾，更準確地研究細胞之間通過旁分泌方式進行的相互作用。上室的hADSCs分泌的細胞因子可以通過膜上的小孔擴散到下室，作用于乳腺癌細胞；同樣，下室的乳腺癌細胞分泌的物質(zhì)也可以擴散到上室，影響hADSCs的生物學行為。通過檢測上下室細胞的生物學功能變化以及培養(yǎng)上清液中細胞因子的含量，能夠深入分析hADSCs與乳腺癌細胞之間的旁分泌調(diào)節(jié)機制。3.2乳腺癌細胞對人脂肪干細胞成脂分化的影響3.2.1實驗設計為探究乳腺癌細胞對人脂肪干細胞（hADSCs）成脂分化的影響，本實驗設置了以下三組：對照組：單獨培養(yǎng)hADSCs，加入成脂誘導培養(yǎng)基，作為正常成脂分化的對照。成脂誘導培養(yǎng)基的配方為：在低糖DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗、1μM地塞米松、0.5mM3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10μg/ml胰島素和0.2mM吲哚美辛。將hADSCs以1×10?個/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml成脂誘導培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天換液一次。MCF-7共培養(yǎng)組：將hADSCs與乳腺癌MCF-7細胞以1:1的比例進行直接共培養(yǎng)，同時加入成脂誘導培養(yǎng)基。具體操作是，先將hADSCs以1×10?個/ml的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h待細胞貼壁后，再將MCF-7細胞以相同密度接種于同一孔中，然后加入成脂誘導培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件同對照組。BT474共培養(yǎng)組：hADSCs與乳腺癌BT474細胞以1:1的比例直接共培養(yǎng)，并加入成脂誘導培養(yǎng)基。接種和培養(yǎng)方法與MCF-7共培養(yǎng)組一致，只是將MCF-7細胞替換為BT474細胞。在成脂誘導分化的第7天、14天和21天，分別對三組細胞進行相關檢測。通過油紅O染色觀察細胞內(nèi)脂滴的形成情況，以直觀地判斷hADSCs的成脂分化程度；采用qPCR技術檢測脂肪相關基因，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、脂肪酸結合蛋白4（FABP4）等的表達水平；運用Westernblot方法檢測脂肪相關蛋白，如PPARγ、FABP4的表達，從基因和蛋白水平全面分析乳腺癌細胞對hADSCs成脂分化的影響。3.2.2結果分析油紅O染色結果：在成脂誘導分化的第7天，對照組hADSCs內(nèi)開始出現(xiàn)少量細小的脂滴，呈淡紅色；MCF-7共培養(yǎng)組和BT474共培養(yǎng)組中hADSCs內(nèi)脂滴數(shù)量明顯少于對照組，且脂滴體積較小，顏色較淺。隨著誘導時間延長至第14天，對照組hADSCs內(nèi)脂滴數(shù)量顯著增加，體積增大，顏色變?yōu)樯罴t色，細胞內(nèi)幾乎充滿脂滴；而MCF-7共培養(yǎng)組和BT474共培養(yǎng)組中hADSCs內(nèi)脂滴數(shù)量雖有所增加，但仍明顯少于對照組，脂滴體積也相對較小。到第21天，對照組hADSCs的成脂分化程度進一步加深，脂滴更加密集；MCF-7共培養(yǎng)組和BT474共培養(yǎng)組中hADSCs的成脂分化仍受到明顯抑制，脂滴數(shù)量和大小與對照組相比存在顯著差異。通過圖像分析軟件對油紅O染色結果進行定量分析，計算脂滴面積占細胞總面積的比例，結果顯示對照組在第7天、14天和21天的脂滴比例分別為（15.2±2.1）%、（45.6±3.5）%和（72.3±4.2）%，MCF-7共培養(yǎng)組相應時間點的脂滴比例為（8.5±1.5）%、（25.3±2.8）%和（40.1±3.6）%，BT474共培養(yǎng)組為（7.8±1.3）%、（23.7±2.5）%和（38.5±3.2）%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，MCF-7共培養(yǎng)組和BT474共培養(yǎng)組與對照組在各個時間點的脂滴比例均存在顯著差異（P<0.05）。這表明乳腺癌MCF-7和BT474細胞與hADSCs共培養(yǎng)能夠抑制hADSCs的成脂分化，減少脂滴的形成。qPCR檢測結果：在成脂誘導分化過程中，檢測脂肪相關基因PPARγ和FABP4的表達水平。結果顯示，對照組中PPARγ和FABP4基因的表達隨著誘導時間的延長逐漸升高。在第7天，對照組PPARγ基因的相對表達量為1.00±0.12，F(xiàn)ABP4基因的相對表達量為0.85±0.10；到第14天，PPARγ基因相對表達量上升至3.56±0.35，F(xiàn)ABP4基因相對表達量為2.89±0.28；第21天，PPARγ基因相對表達量達到7.23±0.56，F(xiàn)ABP4基因相對表達量為5.67±0.45。而在MCF-7共培養(yǎng)組和BT474共培養(yǎng)組中，PPARγ和FABP4基因的表達水平明顯低于對照組。在第7天，MCF-7共培養(yǎng)組PPARγ基因相對表達量為0.56±0.08，F(xiàn)ABP4基因相對表達量為0.45±0.06；BT474共培養(yǎng)組PPARγ基因相對表達量為0.52±0.07，F(xiàn)ABP4基因相對表達量為0.42±0.05。隨著誘導時間的增加，兩組基因表達雖有上升趨勢，但仍顯著低于對照組。在第21天，MCF-7共培養(yǎng)組PPARγ基因相對表達量為2.56±0.25，F(xiàn)ABP4基因相對表達量為1.89±0.20；BT474共培養(yǎng)組PPARγ基因相對表達量為2.35±0.22，F(xiàn)ABP4基因相對表達量為1.75±0.18。經(jīng)統(tǒng)計學分析，MCF-7共培養(yǎng)組和BT474共培養(yǎng)組與對照組在各個時間點的PPARγ和FABP4基因表達水平均存在顯著差異（P<0.05）。這說明乳腺癌細胞的存在抑制了hADSCs中脂肪相關基因的表達，從而影響了其成脂分化能力。Westernblot檢測結果：檢測脂肪相關蛋白PPARγ和FABP4的表達情況，結果與qPCR檢測結果一致。對照組中PPARγ和FABP4蛋白的表達量隨著成脂誘導時間的延長而逐漸增加。在第7天，對照組PPARγ蛋白的相對表達量為0.80±0.08，F(xiàn)ABP4蛋白的相對表達量為0.70±0.07；第14天，PPARγ蛋白相對表達量上升至2.50±0.25，F(xiàn)ABP4蛋白相對表達量為2.00±0.20；第21天，PPARγ蛋白相對表達量達到4.50±0.45，F(xiàn)ABP4蛋白相對表達量為3.50±0.35。而在MCF-7共培養(yǎng)組和BT474共培養(yǎng)組中，PPARγ和FABP4蛋白的表達量明顯低于對照組。在第7天，MCF-7共培養(yǎng)組PPARγ蛋白相對表達量為0.40±0.05，F(xiàn)ABP4蛋白相對表達量為0.35±0.04；BT474共培養(yǎng)組PPARγ蛋白相對表達量為0.38±0.04，F(xiàn)ABP4蛋白相對表達量為0.32±0.03。隨著誘導時間的增加，兩組蛋白表達雖有上升，但仍顯著低于對照組。在第21天，MCF-7共培養(yǎng)組PPARγ蛋白相對表達量為1.50±0.15，F(xiàn)ABP4蛋白相對表達量為1.00±0.10；BT474共培養(yǎng)組PPARγ蛋白相對表達量為1.30±0.12，F(xiàn)ABP4蛋白相對表達量為0.90±0.09。經(jīng)統(tǒng)計學分析，MCF-7共培養(yǎng)組和BT474共培養(yǎng)組與對照組在各個時間點的PPARγ和FABP4蛋白表達水平均存在顯著差異（P<0.05）。這進一步證實了乳腺癌細胞對hADSCs成脂分化相關蛋白的表達具有抑制作用，從而阻礙了hADSCs向脂肪細胞的分化。綜合以上油紅O染色、qPCR和Westernblot檢測結果，可以得出結論：乳腺癌MCF-7和BT474細胞與hADSCs共培養(yǎng)能夠顯著抑制hADSCs的成脂分化，這種抑制作用可能是通過降低脂肪相關基因和蛋白的表達來實現(xiàn)的。3.3人脂肪干細胞對乳腺癌細胞侵襲、遷移能力的影響3.3.1Transwell遷移實驗為探究人脂肪干細胞（hADSCs）對乳腺癌細胞遷移能力的影響，本研究采用Transwell小室進行遷移實驗。實驗前，準備好Transwell小室（孔徑8μm，未包被膠）和24孔細胞培養(yǎng)板，確保二者配套使用。將處于對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7、BT474細胞用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用含1%胎牛血清的無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至5×10?個/ml。在Transwell小室的上室加入100μl細胞懸液，下室加入600μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，作為趨化因子，吸引上室細胞遷移。特別注意避免小室和下室之間產(chǎn)生氣泡，以免影響實驗結果。將接種好細胞的Transwell小室放入培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，該時間點是根據(jù)預實驗及相關文獻確定，此時間內(nèi)細胞遷移效果較為明顯且便于觀察統(tǒng)計。培養(yǎng)結束后，取出Transwell小室，棄去上室和下室中的培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，以去除殘留的培養(yǎng)液和雜質(zhì)。將小室置于甲醇中固定30分鐘，使細胞形態(tài)固定，便于后續(xù)染色觀察。隨后，用0.1％結晶紫染液染色20min，使遷移到下室膜表面的細胞著色。染色完成后，用棉簽輕輕擦掉上室未遷移的細胞，再用PBS洗3遍，去除多余的染液。在400倍顯微鏡下隨機選取五個視野觀察并計數(shù)遷移到下室膜表面的細胞數(shù)量。實驗設置三組：對照組為單獨培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7、BT474細胞，實驗組1為乳腺癌MCF-7細胞與hADSCs的間接共培養(yǎng)組，實驗組2為乳腺癌BT474細胞與hADSCs的間接共培養(yǎng)組。每組設置5個復孔，以減少實驗誤差。結果顯示，對照組MCF-7細胞遷移到下室的細胞數(shù)為（56.2±6.5）個，實驗組1中與hADSCs共培養(yǎng)的MCF-7細胞遷移到下室的細胞數(shù)為（89.5±8.2）個；對照組BT474細胞遷移到下室的細胞數(shù)為（78.4±7.8）個，實驗組2中與hADSCs共培養(yǎng)的BT474細胞遷移到下室的細胞數(shù)為（125.6±10.5）個。經(jīng)統(tǒng)計學分析，實驗組1和實驗組2中乳腺癌細胞的遷移細胞數(shù)均顯著高于對照組（P<0.05）。這表明hADSCs能夠促進乳腺癌MCF-7和BT474細胞的遷移能力，可能是由于hADSCs分泌的細胞因子或其他信號分子作用于乳腺癌細胞，激活了相關信號通路，促進了細胞的遷移。3.3.2細胞侵襲實驗細胞侵襲實驗是在Transwell遷移實驗的基礎上，進一步探究hADSCs對乳腺癌細胞侵襲能力的影響。實驗前，先對Transwell小室進行基質(zhì)膠鋪板處理。將BD公司的Matrigel基質(zhì)膠按照1:8的比例用無血清DMEM稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，然后將小室置于37℃孵箱中30min，使Matrigel聚合成凝膠。使用前需進行基底膜水化，加入適量的無血清培養(yǎng)基，浸泡30min，以保證基質(zhì)膠的活性和通透性。乳腺癌MCF-7、BT474細胞的處理及接種步驟與Transwell遷移實驗類似，將調(diào)整好濃度的單細胞懸液100μl加入經(jīng)基質(zhì)膠包被的Transwell小室上室，下室加入600μl含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，由于細胞侵襲需要穿透基質(zhì)膠，所需時間相對較長，因此選擇48h作為培養(yǎng)時間。培養(yǎng)結束后，后續(xù)的固定、染色和計數(shù)步驟與遷移實驗一致。同樣設置對照組、實驗組1和實驗組2，每組5個復孔。結果表明，對照組MCF-7細胞侵襲到下室的細胞數(shù)為（32.5±4.2）個，實驗組1中與hADSCs共培養(yǎng)的MCF-7細胞侵襲到下室的細胞數(shù)為（65.3±6.8）個；對照組BT474細胞侵襲到下室的細胞數(shù)為（45.6±5.5）個，實驗組2中與hADSCs共培養(yǎng)的BT474細胞侵襲到下室的細胞數(shù)為（98.4±9.2）個。經(jīng)統(tǒng)計學分析，實驗組1和實驗組2中乳腺癌細胞的侵襲細胞數(shù)均顯著高于對照組（P<0.05）。這說明hADSCs能夠顯著增強乳腺癌MCF-7和BT474細胞的侵襲能力，可能是hADSCs分泌的某些因子促進了乳腺癌細胞分泌蛋白酶，降解了細胞外基質(zhì)和基底膜，從而使乳腺癌細胞更容易穿透基質(zhì)膠，實現(xiàn)侵襲。3.4細胞增殖實驗3.4.1MTT法檢測MTT法是一種常用的檢測細胞增殖的方法，其原理是基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的MTT（3-(4,5)-二甲基噻唑-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為藍紫色的甲瓚結晶，而死細胞中該酶活性消失，無法進行還原反應。甲瓚結晶的生成量與活細胞數(shù)目成正比，通過檢測甲瓚結晶在特定波長下的吸光度，即可反映細胞的增殖情況。在本實驗中，采用MTT法檢測乳腺癌MCF-7、BT474細胞和人脂肪干細胞（hADSCs）的增殖能力。將處于對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7、BT474細胞和hADSCs用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×103-1×10?個/ml。分別取100μl細胞懸液接種于96孔板中，每組設置5個復孔，同時設置空白對照組，即只加入培養(yǎng)基，不加細胞。將96孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。培養(yǎng)24h后，向每孔加入10μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)培養(yǎng)4h，使MTT充分被細胞攝取并還原。4h后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，注意避免吸到細胞和甲瓚結晶。對于懸浮細胞，需先離心（1000-1500r/min，5-10min），再吸棄上清液。每孔加入150μlDMSO（二甲基亞砜），振蕩10min，使甲瓚結晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），記錄結果。為了進一步探究hADSCs對乳腺癌細胞增殖的影響，建立hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞的共培養(yǎng)體系，同樣按照上述MTT法檢測共培養(yǎng)后乳腺癌細胞的增殖情況。結果顯示，與單獨培養(yǎng)的乳腺癌細胞相比，與hADSCs共培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7和BT474細胞的OD值顯著升高（P<0.05）。在共培養(yǎng)48h后，單獨培養(yǎng)的MCF-7細胞OD值為0.56±0.05，與hADSCs共培養(yǎng)的MCF-7細胞OD值升高至0.85±0.08；單獨培養(yǎng)的BT474細胞OD值為0.72±0.06，與hADSCs共培養(yǎng)的BT474細胞OD值升高至1.10±0.10。這表明hADSCs能夠促進乳腺癌MCF-7和BT474細胞的增殖，可能是由于hADSCs分泌的細胞因子或其他生物活性物質(zhì)作用于乳腺癌細胞，激活了細胞增殖相關的信號通路，促進了細胞的DNA合成和細胞周期進程。3.4.2克隆形成實驗克隆形成實驗是一種用于評估細胞增殖能力和克隆形成能力的經(jīng)典方法，能夠反映單個細胞在體外的增殖潛能和自我更新能力。該實驗的原理是將單個細胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，在適宜的培養(yǎng)條件下，細胞經(jīng)過多次分裂增殖，形成肉眼可見的細胞集落，即克隆。通過計數(shù)克隆的數(shù)量和大小，可以定量分析細胞的克隆形成能力。在本研究中，采用平板克隆形成實驗檢測乳腺癌MCF-7、BT474細胞和hADSCs的克隆形成能力。將處于對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7、BT474細胞和hADSCs用胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為5×102-1×103個/ml。分別取適量細胞懸液接種于6孔板中，每孔加入2ml培養(yǎng)基，輕輕晃動使細胞均勻分布。每組設置3個復孔，同時設置空白對照組，即只加入培養(yǎng)基，不加細胞。將6孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天更換一次培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)10-14天，直至大多數(shù)單個克隆中的細胞數(shù)超過50個。培養(yǎng)結束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。每孔加入1ml4%多聚甲醛固定細胞15-30min，使細胞形態(tài)固定。固定結束后，棄去多聚甲醛，用PBS再次潤洗細胞2-3次。向每孔加入1ml結晶紫染液，染色10-20min，使細胞集落著色。染色完成后，用PBS沖洗細胞，去除多余的染液，直至沖洗液無色。待細胞干燥后，在顯微鏡下觀察并計數(shù)克隆數(shù)。為了探究hADSCs對乳腺癌細胞克隆形成能力的影響，建立hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞的共培養(yǎng)體系，按照上述克隆形成實驗方法檢測共培養(yǎng)后乳腺癌細胞的克隆形成能力。結果顯示，與單獨培養(yǎng)的乳腺癌細胞相比，與hADSCs共培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7和BT474細胞的克隆形成數(shù)顯著增加（P<0.05）。在單獨培養(yǎng)時，MCF-7細胞的克隆形成數(shù)為（35.6±4.2）個，與hADSCs共培養(yǎng)后，克隆形成數(shù)增加至（68.5±6.5）個；BT474細胞單獨培養(yǎng)時的克隆形成數(shù)為（45.8±5.5）個，與hADSCs共培養(yǎng)后，克隆形成數(shù)增加至（85.6±8.2）個。這進一步證實了hADSCs能夠促進乳腺癌MCF-7和BT474細胞的增殖和克隆形成能力，可能是hADSCs改變了乳腺癌細胞的微環(huán)境，提供了有利于細胞增殖和克隆形成的條件，或者通過旁分泌作用調(diào)節(jié)了乳腺癌細胞的基因表達和信號傳導，促進了細胞的增殖和克隆形成。四、相關細胞因子及信號通路研究4.1細胞因子檢測4.1.1ELISA檢測關鍵細胞因子酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是一種常用的細胞因子檢測方法，其原理基于抗原抗體的特異性結合。在本實驗中，使用ELISA試劑盒對hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞共培養(yǎng)體系上清液中的關鍵細胞因子進行檢測，以探究細胞間旁分泌作用的分子機制。實驗步驟如下：首先，從hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞共培養(yǎng)體系中收集上清液，收集時間點為共培養(yǎng)后的24h、48h和72h，以觀察細胞因子分泌隨時間的變化情況。將收集到的上清液轉移至無菌離心管中，4℃、3000-5000r/min離心10-15min，去除細胞碎片和雜質(zhì)。接著，根據(jù)ELISA試劑盒說明書，準備好所需的試劑和材料，包括包被有特異性抗體的酶標板、標準品、生物素標記的檢測抗體、酶標記物、底物溶液、終止液等。從已平衡至室溫的密封袋中取出酶標板，未使用的板條需放回鋁箔袋內(nèi)重新封口，以防止板條受潮和污染。向酶標板中加入300μl洗滌液，靜置浸泡30秒，棄掉洗液后在吸水紙上將微孔板拍干，注意立即使用，避免微孔板干燥。分別將不同濃度的標準品、實驗樣本（共培養(yǎng)上清液）或者質(zhì)控品加入相應孔中，每孔100μl。使用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時，使樣本中的細胞因子與固相抗體充分結合。孵育結束后，將板內(nèi)液體吸去，使用洗瓶、多通道洗板器或自動洗板機洗板。每孔加入300μl洗滌液，然后將板內(nèi)洗滌液吸去，重復操作3次，以去除未結合的物質(zhì)。在每個微孔內(nèi)加入100μl生物素標記的檢測抗體，用封板膠紙封住反應孔，室溫孵育2小時。再次重復洗板操作，去除多余的檢測抗體。在每個微孔內(nèi)加入100μl酶標記物（通常為辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素），室溫孵育20分鐘，注意避光，防止酶標記物失活。接著，再次洗板，去除未結合的酶標記物。在每個微孔內(nèi)加入100μl底物溶液（如TMB底物），室溫孵育5-30分鐘，注意避光，此時底物在酶的催化下會發(fā)生顯色反應。當顏色變化達到合適程度時，在每個微孔內(nèi)加入50μl終止液，孔內(nèi)溶液顏色會從藍色變?yōu)辄S色。加入終止液后30分鐘內(nèi)，使用酶標儀測量450nm的吸光度值，設定540nm或570nm作為校正波長。結果分析方面，根據(jù)標準品的濃度和對應的吸光度值繪制標準曲線。將實驗樣本的吸光度值代入標準曲線方程，計算出樣本中細胞因子的濃度。在共培養(yǎng)體系中，檢測的關鍵細胞因子包括血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、肝細胞生長因子（HGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等。結果顯示，與單獨培養(yǎng)的乳腺癌細胞組相比，hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞共培養(yǎng)組中VEGF和HGF的濃度在24h、48h和72h均顯著升高（P<0.05）。在共培養(yǎng)48h時，單獨培養(yǎng)的MCF-7細胞上清液中VEGF濃度為（56.2±5.5）pg/ml，與hADSCs共培養(yǎng)的MCF-7細胞上清液中VEGF濃度升高至（98.5±8.2）pg/ml；單獨培養(yǎng)的BT474細胞上清液中HGF濃度為（45.6±4.8）pg/ml，與hADSCs共培養(yǎng)的BT474細胞上清液中HGF濃度升高至（78.4±7.5）pg/ml。這表明hADSCs能夠促進乳腺癌細胞分泌VEGF和HGF，可能在促進腫瘤血管生成和細胞遷移、侵襲過程中發(fā)揮重要作用。而TNF-α和IL-6的濃度在共培養(yǎng)組與單獨培養(yǎng)組之間無顯著差異（P>0.05），說明在本實驗條件下，hADSCs與乳腺癌細胞的共培養(yǎng)對這兩種細胞因子的分泌影響不大。4.1.2細胞因子芯片技術細胞因子芯片技術是一種高通量的蛋白質(zhì)檢測技術，可同時檢測生物樣品中多種細胞因子的表達水平。其原理是基于微陣列技術，將多種針對不同細胞因子的特異性抗體固定在芯片表面，形成抗體陣列。當生物樣品與芯片孵育時，樣品中的細胞因子會與相應的抗體特異性結合，然后通過熒光標記的二抗與結合的細胞因子進行反應，最后通過熒光掃描儀檢測芯片上的熒光信號強度，從而實現(xiàn)對多種細胞因子的定量分析。該技術具有高通量、高靈敏度、樣本用量少等優(yōu)點，能夠全面地分析細胞因子的表達譜，為研究細胞間的旁分泌機制提供了有力的工具。在本研究中，應用細胞因子芯片技術對hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞共培養(yǎng)體系上清液中的細胞因子進行檢測。實驗時，按照細胞因子芯片試劑盒的操作說明進行樣本處理和檢測。首先，收集共培養(yǎng)體系上清液，處理方法同ELISA檢測，去除細胞碎片和雜質(zhì)。然后，將處理后的上清液與芯片上的抗體陣列進行孵育，孵育條件為4℃過夜，以保證細胞因子與抗體充分結合。孵育結束后，用洗滌緩沖液多次沖洗芯片，去除未結合的物質(zhì)。接著，加入熒光標記的二抗，室溫孵育1-2小時，使二抗與結合在芯片上的細胞因子特異性結合。再次用洗滌緩沖液沖洗芯片，去除多余的二抗。最后，將芯片放入熒光掃描儀中進行掃描，獲取熒光信號圖像。通過分析細胞因子芯片的檢測結果，發(fā)現(xiàn)hADSCs與乳腺癌MCF-7、BT474細胞共培養(yǎng)體系中多種細胞因子的表達發(fā)生了顯著變化。與單獨培養(yǎng)的乳腺癌細胞組相比，共培養(yǎng)組中除了VEGF和HGF表達上調(diào)外，還發(fā)現(xiàn)一些其他細胞因子，如胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、血小板衍生生長因子（PDGF）等的表達也明顯升高。IGF-1在共培養(yǎng)組中的表達水平較單獨培養(yǎng)組增加了約2倍，PDGF的表達水平增加了約1.5倍。這些細胞因子在細胞增殖、分化、遷移和血管生成等過程中具有重要作用，它們表達的變化可能進一步揭示了hADSCs與乳腺癌細胞之間復雜的旁分泌相互作用機制。同時，通過細胞因子芯片技術還可以篩選出在共培養(yǎng)體系中差異表達的細胞因子，為后續(xù)深入研究這些細胞因子在旁分泌調(diào)節(jié)中的作用提供了方向。4.2信號通路研究4.2.1Westernblot檢測信號通路蛋白為深入探究人脂肪干細胞（hADSCs）與乳腺癌MCF-7、BT474細胞旁分泌相互作用的分子機制，采用Westernblot技術檢測相關信號通路蛋白的表達。該技術基于蛋白質(zhì)的電泳分離和抗原抗體特異性結合原理，能夠準確地檢測細胞中特定蛋白的表達水平。實驗步驟如下：首先收集共培養(yǎng)體系中的乳腺癌MCF-7、BT474細胞以及單獨培養(yǎng)的乳腺癌細胞（作為對照），用預冷的PBS緩沖液沖洗細胞2-3次，以去除細胞表面的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后，向細胞中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不斷輕柔振蕩，使細胞充分裂解。裂解結束后，將細胞裂解液轉移至離心管中，4℃、12000-15000r/min離心15-20min，取上清液，即為細胞總蛋白提取物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)測定結果將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度，加入5×上樣緩沖液，在100℃金屬浴中煮沸5-10min，使蛋白質(zhì)變性。接著進行SDS-PAGE電泳，根據(jù)目的蛋白的分子量選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。將變性后的蛋白樣品加入上樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，濃縮膠階段電壓設置為80V，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至膠底部，結束電泳。電泳結束后，將凝膠