HPLC流動(dòng)相的配制與使用

流動(dòng)相是影響液相色譜的關(guān)鍵因素。一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑

應(yīng)具有低粘度、與檢測(cè)器兼容性好、易于得到純品和低毒性等特征。

高效液相色譜法中的流動(dòng)相主要用水性溶劑、有機(jī)溶劑或它們的混合

液，但是如何配制。選擇配制的方法不同，分析結(jié)果特別是保留時(shí)間，

是會(huì)有顯著差別的。

高效液相色譜法中的流動(dòng)相主要用水性溶劑、有機(jī)溶劑或它們的混合

液，水性溶劑也常用于緩沖液。常因資料上表示的內(nèi)容和實(shí)際的配制

方法不同，而產(chǎn)生流動(dòng)相的差異，影響了色譜圖和分析結(jié)果。一般來

說，溶劑的混合按體積比（V/V）或重量比（W/W）進(jìn)行。溶液的體積

因溫度而變化，所以按重量比混合可調(diào)制再現(xiàn)性較好的混合溶劑，但

由于操作較麻煩，通常多用體積比混合。只要沒有特別標(biāo)明，就可按

體積比進(jìn)行混合，但在特殊情況下，如胺類粘度高的溶液混合時(shí)，有

時(shí)用重量一體積比（W/V）的方法。

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的

目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)：

a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱

中（或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中）。流動(dòng)相溶解度達(dá)不到要求時(shí)，盡量選用流

動(dòng)相中含有的比例較大的成分，以減輕進(jìn)樣對(duì)流動(dòng)相的影響造成基線

不穩(wěn)。

b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，選用流動(dòng)相配置對(duì)色譜峰影響最

c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，

延長(zhǎng)泵的使用壽命（可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度）O

d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用UV檢測(cè)器，

最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。流動(dòng)相組成溶劑均達(dá)不到要求

時(shí)，選取的溶劑應(yīng)保證在設(shè)定波長(zhǎng)內(nèi)尢紫外吸收。

e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。

f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微

量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。

下面21項(xiàng)注意讓你更懂液相流動(dòng)相。

1、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意過濾溶劑

溶劑在使用前一定要用0.5um的過濾器過濾，如果使用固體化學(xué)試

劑（緩沖鹽）配制流動(dòng)相，過濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，

阻塞進(jìn)樣器和柱頭過濾片。本實(shí)驗(yàn)室有水溶性和脂溶性兩種過濾膜供

選擇（反光面朝上），過濾水溶性流動(dòng)相時(shí)（如甲醇/水），先用1?

2mL甲醇潤(rùn)濕過濾膜，有助于快速抽濾。

2、注意保持儲(chǔ)液瓶的清潔

用普通溶劑瓶作流動(dòng)相儲(chǔ)液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，最后一次應(yīng)用HPLC

級(jí)的水或溶劑清洗，不能在清洗過程中留下污跡。

3、注意保證溶劑的質(zhì)量

一定要用HPLC級(jí)的溶劑，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級(jí)，同樣也要使用高純度

的緩沖鹽。

4、注意流動(dòng)相脫氣不充分

流動(dòng)相受熱，或者流動(dòng)相不同組分混合時(shí)會(huì)有氣體產(chǎn)生，氣泡進(jìn)入泵

內(nèi)引起壓力波動(dòng)，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺?？稍囉孟铝蟹椒ń?/p>

決問題：流動(dòng)相再脫氣；采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用；

改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合。HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否

則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泉的工作。

系統(tǒng)中氣泡的產(chǎn)生：流動(dòng)相本身存在，梯度淋洗混合后放出氣泡；氣

泡的影響：存在于管路中，系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有偏差；存在

于單向閥中，易造成液體回流，流量不準(zhǔn)確，甚至是不吸液存在于檢

測(cè)器中，出現(xiàn)鬼峰，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。所以做液相對(duì)流動(dòng)相的氣泡和

雜質(zhì)要求比較嚴(yán)格。氣泡會(huì)影響柱的分離效率，檢測(cè)器的靈敏度、基

線穩(wěn)定性，甚至使無法檢測(cè)。（噪聲增大，基線不穩(wěn)，突然跳動(dòng)）。此

外，溶解在流動(dòng)相中的氧還可能與樣品、流動(dòng)相甚至固定相（如烷基

胺）反應(yīng)。溶解氣體還會(huì)引起溶劑pH的變化，對(duì)分離或分析結(jié)果帶

來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如，甲醇、四氫吠喃）形成有紫外吸

收的絡(luò)合物，此絡(luò)合物會(huì)提高背景吸收（特別是在260mn以下），并

導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時(shí)造成基

線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測(cè)中，溶解氧在一定條件下還

會(huì)引起淬滅現(xiàn)象，特別是對(duì)芳香煌、脂肪醛、酮等。在某些情況下，

熒光響應(yīng)可降低達(dá)95機(jī)在電化學(xué)檢測(cè)中（特別是還原電化學(xué)法），

氧的影響更大。除去流動(dòng)相中的溶解氧將大大提高UV檢測(cè)器的性能,

也將改善在一些熒光檢測(cè)應(yīng)用中的靈敏度。

常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氨等。對(duì)混合溶劑，

若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點(diǎn)溶劑揮發(fā)造成的組成變化。

(1)氨氣脫氣：氮?dú)饷摎馐呛苡行У拿摎夥椒?。氮?dú)饩従彽耐ㄟ^流

動(dòng)相趕去溶入的空氣，如果使用得當(dāng)，在lOmin內(nèi)可除去8096?90%

的溶入氣體。由于氨氣在流動(dòng)相中的溶解度極低，所以用氮?dú)饷摎獗?/p>

護(hù)的流動(dòng)相可以認(rèn)為是一個(gè)無氣體溶解體系。其缺點(diǎn)是氨氣價(jià)格比較

昂貴，會(huì)增加檢驗(yàn)成本。一般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水溶

液中的氣體較頑固。在溶液中吹氮是相當(dāng)有效的脫氣方法，這種連續(xù)

脫氣法在電化學(xué)檢測(cè)時(shí)經(jīng)常使用。但氮?dú)獍嘿F，難于普及。

(2)真空脫氣：也是比較常用的脫氣方法?，F(xiàn)在多數(shù)企業(yè)都最常用

這種辦法，貯液器被抽成部分真空，溶入的氣體蒸發(fā)形成氣泡溢出，

其效果僅次于氯氣脫氣。象Agilengl200液相色譜使用的是在線脫氣

機(jī)。在線脫氣只適合脫完氣之后的流動(dòng)相，在使用過程中的微量脫氣。

(3)超聲波脫氣:將配制好的流動(dòng)相連容器放入超聲水槽中脫氣10?

20mino這種方法比較簡(jiǎn)便，又基本上能滿足日常分析操作的要求，

所以，目前仍廣泛采用。這種方法只能除去30%的溶解氣體，有時(shí)還

會(huì)引起氣體溶解度的增加。對(duì)氧敏感的檢測(cè)器不宜用此法。超聲脫氣

比較好，10~20分鐘的超聲處理對(duì)許多有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水混合

液的脫氣是足夠了(一般500ml溶液需超聲20、30min方可)，關(guān)于超

聲時(shí)間問題眾說紛紜，各實(shí)驗(yàn)室內(nèi)5?30分鐘不等，一般來說流動(dòng)相

組成為無機(jī)(緩沖鹽溶液)時(shí)，5?15分鐘即可，流動(dòng)相為是水和有

機(jī)容積混合時(shí)，超聲時(shí)間要相對(duì)長(zhǎng)一些，這個(gè)方法只能除去30%的溶

解氣體，時(shí)間的延長(zhǎng)不和效果成正比，且其中氣泡對(duì)色譜峰基線穩(wěn)定

性與信噪比有一定影響，一般來說影響不大，15min超聲即可足夠。

此法不影響溶劑組成。超聲時(shí)應(yīng)注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接

觸，以免玻璃瓶破裂，容器內(nèi)液面不要高出水面太多。

（4）加熱回流脫氣：該方法雖然效果很好，但是適用范圍較窄。對(duì)

十有機(jī)溶劑或混合流動(dòng)相不適合用此法，因?yàn)閾]發(fā)性組分會(huì)損失掉，

改變流動(dòng)相的組成。

綜合來說，用真空抽濾后，再用超聲脫氣還是最常用的辦法，用氫氣

的方法是效果最好的辦法，而在線脫氣本身也是真空脫氣，但它可以

放到儀器上使用，是一種保證性的辦法。

A.離線（系統(tǒng)外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態(tài)，在你停止脫氣后，

氣體立即開始回到溶劑中。在「4小時(shí)內(nèi)，溶劑又將被環(huán)境氣體所飽

和。

B.在線（系統(tǒng)內(nèi)）脫氣法無此缺點(diǎn)。最常用的在線脫氣法為鼓泡，即

在色譜操作前和進(jìn)行時(shí)，將惰性氣體噴入溶劑中。嚴(yán)格來說，此方法

不能將溶劑脫氣，它只是用一種低溶解度的惰性氣體（通常是氮）將

空氣替換出來。此外還有在線脫氣機(jī)。

5、注意流動(dòng)相供給不暢

流動(dòng)相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)、。應(yīng)經(jīng)常觀察儲(chǔ)液器中

流動(dòng)相的量，加足流動(dòng)相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉

子沉至瓶底，儲(chǔ)液器蓋上留一小孔正好夾住進(jìn)液管，使其不能上下移

動(dòng)。

過濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過濾器被微粒所阻塞或

長(zhǎng)霉，去掉過濾器后如果系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正?！?，說明已找出問題，換上新的

過濾器則可。有時(shí)候換上新的過濾器仍然不暢，那就需要查查流動(dòng)相

的制備過程，或者換大孔徑的過濾器。不管如何，流動(dòng)相都需要重新

過濾。流速過高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過濾器孔徑、管

道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min,常會(huì)

出現(xiàn)這種現(xiàn)象。使用下列方法解決：

(1)使用低流速；

(2)換大孔徑的過濾器；

(3)增加進(jìn)液管道內(nèi)徑；

(4)抬高或加壓儲(chǔ)液器；

(5)不用過濾器，但流動(dòng)相一定要先過濾；

(6)儲(chǔ)液器蓋子太緊，在儲(chǔ)液器內(nèi)形成真空，打出的流動(dòng)相不連續(xù)。

應(yīng)松開蓋子或留有1mm的縫隙；

(7)進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換

新的。其它問題包括滲漏或接頭松動(dòng)、泵部件損壞等，都能引起供液

不正常。

6、注意防止流動(dòng)相和儲(chǔ)液器被污染

由于污染，噪音越來越大，檢測(cè)器基線上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定

的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來，所以在色譜圖中不出多

余的峰。用梯度洗脫時(shí)弱流動(dòng)相可以使污染物聚在柱頂，流動(dòng)相強(qiáng)度

增加后污染物可能被洗脫出來一個(gè)大的偽峰。有時(shí)基線噪音突然增大

或突然提高，都是因?yàn)榉磸?fù)加進(jìn)新的流動(dòng)相或系統(tǒng)用得太久(通宵)

所造成的。

新加進(jìn)的流動(dòng)相有污染物或者流動(dòng)相長(zhǎng)霉，繁殖了細(xì)菌。臟的儲(chǔ)液器

會(huì)污染清潔的流動(dòng)相。每種流動(dòng)相備有專用的儲(chǔ)液器，或者定期報(bào)廢

儲(chǔ)液器。

流動(dòng)相污染來自這兒個(gè)方面：試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格；微生

物的影響；配制流動(dòng)相時(shí)操作不當(dāng)?shù)?，因此要求高純度化學(xué)試劑和

HPLC級(jí)溶劑。要注意玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈；為防止微生物生長(zhǎng)，

每天要用甲醇清洗系統(tǒng)；懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長(zhǎng)了微生物，可用稀硝酸沖洗

即可（注意不要損壞柱和管道系統(tǒng)）；真空脫氣時(shí)防止泵油帶入流動(dòng)

相；用清潔的惰性塞子、攪棒、過濾器和玻璃器皿配制流動(dòng)相；已經(jīng)

污染的流動(dòng)相一定要廢棄掉。

7、注意選擇流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)

低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶

脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱

系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。

8、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意純度

色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上

積累時(shí)。

9、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意必須與檢測(cè)器匹配

使用UV檢測(cè)器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測(cè)波長(zhǎng)下應(yīng)沒有吸收，或吸收很

小。當(dāng)使用示差折光檢測(cè)器時(shí)，應(yīng)選擇折光系數(shù)與樣品差別較大的溶

劑作流動(dòng)相，以提高靈敏度。

10、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意粘度要低（應(yīng)＜2cp）：

高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，

使分離時(shí)間延長(zhǎng)，最好選擇沸點(diǎn)在100C以下的流動(dòng)相。

11、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意對(duì)樣品的溶解度要適宜

如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使

柱子惡化。

12、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意樣品易于回收

應(yīng)選用揮發(fā)性溶劑

13、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意由強(qiáng)到弱

一般先用9096的乙脂（或甲醇）/水（或緩沖溶液）進(jìn)行試驗(yàn)，這樣可以

很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑（乙月青或甲醇）

的比例。

14、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意三倍規(guī)則

每減少10%的有機(jī)溶劑（甲醇或乙月青）的量，保留因子約增加3倍，此

為三倍規(guī)則。這是一個(gè)聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀

察各個(gè)峰的分離情況。

15、選擇流動(dòng)相應(yīng)注意粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)

當(dāng)分離達(dá)到一定程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%,并據(jù)此

規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。

16、流動(dòng)相的配制注意有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合方法

有機(jī)溶劑和水性溶劑的混合液作為流動(dòng)相是經(jīng)常的，但由于混合方法

不同，有時(shí)分析結(jié)果相差很大。如20mM磷酸鈉緩沖液（pH2.5）90%

與乙睛10%的混合液，混合比為9：1時(shí)，20mM磷酸鈉緩沖液（PH2.5）

90%與乙臘10%的體積比為9：1,也就是可以解釋為各自按體積比例

的相當(dāng)量稱取后進(jìn)行混合。另外，按10%乙月青解釋，用20mM磷酸鈉

緩沖液（P1I2.5）,將乙睛稀釋調(diào)制也可以成立。在后者情況下，產(chǎn)生

混合體積減少部分，余下的添加20mM磷酸鈉緩沖液。兩者雖然沒有

太大的差別，但由于混合方式不同，分析結(jié)果，特別是保留時(shí)間，也

會(huì)有顯著的差別，這點(diǎn)必須注意。

17、50%或（V/V=l/1）乙晴水溶液的配制方法

對(duì)于用V/V=l/1的表示配制乙月青水溶液，多按這種方法進(jìn)行：用量

筒測(cè)定乙臍500mL,用另一量筒測(cè)定水500mL,兩種液體在瓶?jī)?nèi)充分

搖晃混合。不過50%乙懵水溶液的表示時(shí)，同樣也多是按上述方法配

制，但查化學(xué)辭典時(shí)，實(shí)際上是按這種方法進(jìn)行配制：首先將500mL

乙月青，注入1L的量瓶中，量瓶邊攪拌邊加水，等待液溫達(dá)到室溫，

用全量水，使溶液到ILo這樣一來，用％表示和“V/V”體積比表示，

最終得出的流動(dòng)相組成不同。也就是說，混合溶劑的密度，與由原溶

劑密度計(jì)算的單純平均值不相同，所以用上述兩種方法調(diào)制的流動(dòng)相

組成差異。如在室溫（25℃）附近水50mL和乙脂50mL混合時(shí)體積不

是100mL,而有所減少，約為96mL。在一般情況下，多用操作簡(jiǎn)便的

第一種方法。

18、流動(dòng)相的配制注意溶劑體積的溫度影響

溶液的密度受周圍溫度的影響。剛從溶劑冷臧箱拿出來的溶液溫度與

實(shí)驗(yàn)室的室溫相比，要低不少，乙月青和水混合液因發(fā)熱反應(yīng)，溶液溫

度升高。因此，為能調(diào)制再現(xiàn)