MicroRNA-16通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥機(jī)制研究一、引言1.1研究背景與意義卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中極為常見(jiàn)且惡性程度頗高的腫瘤，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。近年來(lái)，其發(fā)病率呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，已成為全球范圍內(nèi)女性健康的重大挑戰(zhàn)之一。由于卵巢癌發(fā)病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，約70%的患者在確診時(shí)已處于晚期，這使得治療難度大幅增加。盡管手術(shù)聯(lián)合以鉑類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的化療是目前卵巢癌的主要治療手段，但患者的預(yù)后情況仍然不容樂(lè)觀，5年生存率僅徘徊在30%左右。順鉑作為一種經(jīng)典的鉑類(lèi)化療藥物，在卵巢癌的治療中占據(jù)著重要地位。它能夠與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，形成加合物，從而阻斷DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，卵巢癌患者對(duì)順鉑的原發(fā)性和（或）獲得性多藥耐藥現(xiàn)象十分普遍，這嚴(yán)重制約了順鉑的治療效果，成為卵巢癌臨床治療的主要障礙。據(jù)相關(guān)研究顯示，約75%-80%的卵巢上皮癌患者在初始治療時(shí)對(duì)化療有反應(yīng)，但最終至少80%的患者會(huì)出現(xiàn)耐藥情況，這使得疾病復(fù)發(fā)率居高不下，患者的生存時(shí)間也因此被顯著縮短。細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（cyclin-dependentkinase，Cdk）的異常表達(dá)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑（cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI）的缺失以及檢測(cè)點(diǎn)的異常等，都可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，使得細(xì)胞增殖失控，最終引發(fā)癌變。微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為21-25個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，它們通過(guò)與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)（untranslatedregion，UTR）互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控靶基因的表達(dá)或抑制靶蛋白的翻譯，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等重要生命過(guò)程。越來(lái)越多的研究表明，miRNAs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及化療耐藥等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其表達(dá)異常與腫瘤的多種生物學(xué)行為密切相關(guān)。MicroRNA-16（miR-16）作為miRNAs家族的重要成員之一，已被證實(shí)與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)。它可以通過(guò)靶向作用于細(xì)胞周期相關(guān)基因，如CCND1等，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。在多種腫瘤中，miR-16的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及化療耐藥性的產(chǎn)生存在著緊密聯(lián)系。例如，在套細(xì)胞淋巴瘤患者中，miR-16表達(dá)與CCND1呈負(fù)相關(guān)；在乳腺癌、肺癌等腫瘤中，miR-16的低表達(dá)與腫瘤的惡性程度及不良預(yù)后相關(guān)。然而，在卵巢癌中，miR-16調(diào)控細(xì)胞周期對(duì)順鉑耐藥的影響及具體分子機(jī)制尚未完全明確，仍有待深入研究。本研究旨在深入探討MicroRNA-16調(diào)控細(xì)胞周期對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的影響及其潛在分子機(jī)制。通過(guò)對(duì)這一領(lǐng)域的研究，有望揭示卵巢癌順鉑耐藥的新機(jī)制，為解決卵巢癌順鉑耐藥問(wèn)題提供新的靶點(diǎn)和策略，從而提高卵巢癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在卵巢癌順鉑耐藥研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開(kāi)展了大量工作。國(guó)外方面，一些研究聚焦于耐藥相關(guān)基因和蛋白的作用。例如，有研究發(fā)現(xiàn)BRCA2基因突變的卵巢癌患者，雖初始對(duì)鉑類(lèi)藥物敏感，但最終易出現(xiàn)鉑類(lèi)耐藥，且耐藥腫瘤中存在修復(fù)BRCA2功能的二次基因改變。還有研究指出，腫瘤微環(huán)境中高度浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞可促進(jìn)化療耐藥，如CircITGB6通過(guò)將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞極化重置為M2表型，誘導(dǎo)FGF9表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌順鉑耐藥，影響患者臨床預(yù)后。國(guó)內(nèi)研究也取得了諸多成果。有研究表明，β-連環(huán)素（β-catenin）在卵巢癌耐藥細(xì)胞系中表達(dá)明顯增高，沉默β-catenin可促進(jìn)卵巢癌耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，并促進(jìn)順鉑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在尋找新的治療靶點(diǎn)方面，國(guó)內(nèi)研究也在不斷探索，如通過(guò)降低“超氧化物歧化酶1”（SOD1）基因活性，成功減少了雌性小鼠耐順鉑腫瘤的生長(zhǎng)，為克服順鉑耐藥性提供了新的靶標(biāo)思路。關(guān)于MicroRNA-16與腫瘤關(guān)系的研究，國(guó)內(nèi)外也有豐富成果。在多種腫瘤中，如套細(xì)胞淋巴瘤中，miR-16表達(dá)與CCND1呈負(fù)相關(guān)；在乳腺癌、肺癌等腫瘤中，miR-16的低表達(dá)與腫瘤的惡性程度及不良預(yù)后相關(guān)。在卵巢癌中，有研究發(fā)現(xiàn)miR-16可以通過(guò)靶向細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、血管生成等多個(gè)信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理過(guò)程，并影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，miR-16的表達(dá)與卵巢癌耐藥性密切相關(guān)，其下調(diào)是導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)環(huán)磷酰胺耐藥性增加的原因之一，且miR-16誘導(dǎo)細(xì)胞周期在G0/G1階段停滯，降低癌細(xì)胞增殖能力，增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。還有研究采用裸鼠xenograft模型，發(fā)現(xiàn)miR-16mimics轉(zhuǎn)染后，卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制，與鉑類(lèi)化療藥品聯(lián)用，能更好地抑制腫瘤大小和生長(zhǎng)，且miR-16可通過(guò)靶向Bcl-2蛋白，促進(jìn)化療草藥誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞周期調(diào)控與腫瘤的研究方面，國(guó)內(nèi)外均明確了細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（Cdk）的異常表達(dá)、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑（CKI）的缺失以及檢測(cè)點(diǎn)的異常等與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞周期因子調(diào)控失衡是腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖及分化障礙的根本原因，癌基因CCND1的過(guò)度表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞快速通過(guò)G1～S期的限制點(diǎn)，控制正常細(xì)胞的增殖，而上皮性卵巢癌中常存在該通路某種因子的變化，其中CCND1基因及其蛋白cyclinD1的過(guò)表達(dá)尤為常見(jiàn)。盡管?chē)?guó)內(nèi)外在上述各方面已取得一定進(jìn)展，但仍存在研究空白與不足。對(duì)于miR-16調(diào)控細(xì)胞周期影響卵巢癌順鉑耐藥的具體分子機(jī)制，目前尚未完全明確。miR-16與眾多細(xì)胞周期相關(guān)基因及蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)還不夠清晰，在體內(nèi)復(fù)雜的生理病理環(huán)境下，miR-16如何精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)影響卵巢癌順鉑耐藥，還需要深入研究。此外，如何將miR-16相關(guān)研究成果轉(zhuǎn)化為臨床有效的治療策略，也面臨著諸多挑戰(zhàn)，如如何選擇有效、特異性的miRNA分子，制作穩(wěn)定的遞送體系，實(shí)現(xiàn)miRNA分子的精準(zhǔn)調(diào)控等問(wèn)題，仍有待進(jìn)一步探索解決。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究MicroRNA-16調(diào)控細(xì)胞周期對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的影響及其潛在分子機(jī)制，具體研究目的如下：一是明確MicroRNA-16在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系及組織中的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與順鉑耐藥程度及患者臨床病理特征的相關(guān)性；二是通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究上調(diào)或下調(diào)MicroRNA-16表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥性及細(xì)胞周期的影響，確定MicroRNA-16調(diào)控卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的關(guān)鍵作用；三是揭示MicroRNA-16調(diào)控卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥的分子機(jī)制，重點(diǎn)研究其對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的調(diào)控作用，以及相關(guān)信號(hào)通路的激活或抑制情況；四是利用體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證MicroRNA-16對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的影響及作用機(jī)制，為卵巢癌順鉑耐藥的臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。為達(dá)成上述研究目的，本研究擬采用以下研究方法：一是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，選取人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞系和耐藥細(xì)胞系作為研究對(duì)象，運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將MicroRNA-16模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitor）及相應(yīng)陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，構(gòu)建MicroRNA-16表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的細(xì)胞模型。采用MTT法、CCK-8法等檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布情況，利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，以此研究MicroRNA-16對(duì)卵巢癌細(xì)胞順鉑耐藥性及細(xì)胞周期的影響。二是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MicroRNA-16模擬物或抑制劑的卵巢癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤生長(zhǎng)至一定體積后，給予順鉑腹腔注射治療，定期測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，如免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況，驗(yàn)證MicroRNA-16對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的影響及作用機(jī)制在體內(nèi)的有效性。三是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，提取細(xì)胞或腫瘤組織中的總RNA和蛋白質(zhì)，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)MicroRNA-16及相關(guān)靶基因mRNA的表達(dá)水平，運(yùn)用Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白、凋亡相關(guān)蛋白及信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況。利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證MicroRNA-16與靶基因3'UTR的靶向結(jié)合關(guān)系，進(jìn)一步明確MicroRNA-16調(diào)控卵巢癌順鉑耐藥的分子機(jī)制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1卵巢癌概述卵巢癌作為女性生殖系統(tǒng)中極具威脅性的惡性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全明確。眾多研究表明，卵巢癌的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，其中遺傳因素在卵巢癌的發(fā)病中占據(jù)重要地位。約5%-10%的卵巢癌與遺傳因素相關(guān)，遺傳性卵巢癌綜合征主要包括BRCA1/2基因突變相關(guān)卵巢癌、林奇綜合征相關(guān)卵巢癌等。攜帶BRCA1/2基因突變的女性，其終身患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，可高達(dá)40%-60%。此外，激素水平的失衡也可能與卵巢癌的發(fā)生有關(guān)。卵巢癌的發(fā)生可能與雌激素和孕激素的長(zhǎng)期刺激有關(guān)，這些激素可能導(dǎo)致卵巢表面上皮不斷損傷和修復(fù)，從而增加了癌變的風(fēng)險(xiǎn)。慢性炎癥對(duì)卵巢癌的發(fā)生發(fā)展也起到了促進(jìn)作用，長(zhǎng)期的炎癥刺激可導(dǎo)致卵巢表面上皮細(xì)胞的增殖和分化異常，進(jìn)而引發(fā)癌變。卵巢癌的病理類(lèi)型豐富多樣，主要包括上皮性卵巢癌、生殖細(xì)胞腫瘤、性索間質(zhì)腫瘤等。其中，上皮性卵巢癌最為常見(jiàn)，約占卵巢癌總數(shù)的90%，其又可進(jìn)一步細(xì)分為漿液性癌、黏液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌、透明細(xì)胞癌等多種亞型。不同病理類(lèi)型的卵巢癌在生物學(xué)行為、治療反應(yīng)及預(yù)后等方面存在顯著差異。例如，漿液性癌是上皮性卵巢癌中最常見(jiàn)的亞型，惡性程度較高，易發(fā)生腹腔內(nèi)播散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；黏液性癌相對(duì)少見(jiàn)，惡性程度較低，但常伴有黏液分泌過(guò)多的癥狀；子宮內(nèi)膜樣癌與子宮內(nèi)膜癌的病理特征相似，對(duì)激素治療可能有一定的反應(yīng)；透明細(xì)胞癌則具有獨(dú)特的病理形態(tài)和生物學(xué)行為，對(duì)化療的敏感性相對(duì)較低，預(yù)后較差。臨床上，卵巢癌通常采用國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期系統(tǒng)進(jìn)行分期，該系統(tǒng)依據(jù)腫瘤的大小、侵犯范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等，將卵巢癌分為Ⅰ-Ⅳ期。Ⅰ期卵巢癌局限于卵巢，其中ⅠA期腫瘤局限于一側(cè)卵巢，包膜完整，表面無(wú)腫瘤，腹水或腹腔沖洗液中未找到癌細(xì)胞；ⅠB期腫瘤局限于雙側(cè)卵巢，其他情況同ⅠA期；ⅠC期則是指腫瘤局限于一側(cè)或雙側(cè)卵巢，但伴有包膜破裂、卵巢表面有腫瘤或腹水、腹腔沖洗液中找到癌細(xì)胞等情況。Ⅱ期卵巢癌累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，并伴有盆腔內(nèi)擴(kuò)散，如ⅡA期擴(kuò)散至子宮和（或）輸卵管；ⅡB期擴(kuò)散至其他盆腔組織。Ⅲ期卵巢癌則超出盆腔，累及一側(cè)或雙側(cè)卵巢，伴有腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移或盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移等，ⅢA期為顯微鏡下可見(jiàn)的盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移和（或）區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；ⅢB期為肉眼可見(jiàn)的盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移，最大徑線(xiàn)≤2cm；ⅢC期為肉眼可見(jiàn)的盆腔外腹膜轉(zhuǎn)移，最大徑線(xiàn)＞2cm和（或）區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Ⅳ期卵巢癌則發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，如肝實(shí)質(zhì)轉(zhuǎn)移、胸水細(xì)胞學(xué)陽(yáng)性等。卵巢癌的分期對(duì)于治療方案的選擇和預(yù)后評(píng)估具有至關(guān)重要的指導(dǎo)意義，早期卵巢癌患者通過(guò)手術(shù)治療，預(yù)后相對(duì)較好；而晚期卵巢癌患者由于腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移，治療難度大，預(yù)后往往較差。目前，卵巢癌的治療主要以手術(shù)聯(lián)合化療為主，輔以靶向治療、免疫治療等綜合治療手段。手術(shù)治療是卵巢癌的重要治療方式，包括全面分期手術(shù)和腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)等。全面分期手術(shù)適用于早期卵巢癌患者，旨在切除腫瘤組織，并進(jìn)行準(zhǔn)確的分期，為后續(xù)治療提供依據(jù)；腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)則主要用于晚期卵巢癌患者，通過(guò)盡可能切除腫瘤組織，減少腫瘤負(fù)荷，提高化療效果?；熢诼殉舶┑闹委熤衅鹬豢苫蛉钡淖饔?，以鉑類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是卵巢癌的標(biāo)準(zhǔn)一線(xiàn)化療方案，常用的化療藥物包括順鉑、卡鉑、紫杉醇等。順鉑作為一種經(jīng)典的鉑類(lèi)化療藥物，其作用機(jī)制主要是通過(guò)與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，從而干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。然而，卵巢癌患者對(duì)順鉑的耐藥問(wèn)題嚴(yán)重影響了化療效果，成為卵巢癌治療的一大難題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約75%-80%的卵巢上皮癌患者在初始治療時(shí)對(duì)化療有反應(yīng)，但最終至少80%的患者會(huì)出現(xiàn)耐藥情況，這使得疾病復(fù)發(fā)率居高不下，患者的生存時(shí)間顯著縮短。此外，靶向治療和免疫治療等新興治療手段也在卵巢癌的治療中逐漸嶄露頭角，為卵巢癌患者帶來(lái)了新的希望。例如，PARP抑制劑作為一種靶向治療藥物，可特異性地抑制PARP酶的活性，從而阻斷腫瘤細(xì)胞的DNA修復(fù)途徑，對(duì)攜帶BRCA基因突變的卵巢癌患者具有較好的療效；免疫治療則通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，為卵巢癌的治療開(kāi)辟了新的途徑，但目前免疫治療在卵巢癌中的應(yīng)用仍處于探索階段，其療效和安全性有待進(jìn)一步提高。2.2順鉑耐藥機(jī)制順鉑作用于卵巢癌細(xì)胞時(shí)，主要通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，形成順鉑-DNA加合物。這種加合物會(huì)導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)扭曲，阻礙DNA的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。然而，卵巢癌細(xì)胞可通過(guò)多種途徑對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性。藥物外排增加是卵巢癌對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制之一。細(xì)胞膜上存在多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族在藥物外排中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員，它能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的順鉑逆濃度梯度泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)順鉑的有效濃度，使腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥。研究表明，在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系中，P-gp的表達(dá)水平明顯升高，其高表達(dá)與卵巢癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。多藥耐藥相關(guān)蛋白1（multidrugresistance-associatedprotein1，MRP1）也參與了順鉑的外排過(guò)程。MRP1可以將順鉑與谷胱甘肽（GSH）形成的復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，減少細(xì)胞內(nèi)順鉑的蓄積，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥。此外，乳腺癌耐藥蛋白（breastcancerresistanceprotein，BCRP）同樣能夠介導(dǎo)順鉑的外排，影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。DNA修復(fù)能力增強(qiáng)也是卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)鍵因素。順鉑與DNA結(jié)合形成的加合物會(huì)引發(fā)DNA損傷，正常情況下，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一系列DNA修復(fù)機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)這種損傷。然而，在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，這些DNA修復(fù)機(jī)制往往過(guò)度激活，使得受損的DNA能夠迅速得到修復(fù)，從而降低了順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。核苷酸切除修復(fù)（nucleotideexcisionrepair，NER）途徑在順鉑耐藥中起著重要作用。NER能夠識(shí)別并切除含有順鉑-DNA加合物的核苷酸片段，然后通過(guò)DNA聚合酶和連接酶的作用進(jìn)行修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，參與NER途徑的關(guān)鍵蛋白，如XPA、XPC、ERCC1等表達(dá)上調(diào)，這些蛋白的高表達(dá)增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)順鉑所致DNA損傷的修復(fù)能力，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥。此外，同源重組修復(fù)（homologousrecombinationrepair，HRR）途徑也與卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)。HRR主要用于修復(fù)DNA雙鏈斷裂，BRCA1和BRCA2是HRR途徑中的關(guān)鍵基因。在攜帶BRCA1/2基因突變的卵巢癌患者中，初始對(duì)鉑類(lèi)藥物敏感，但隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤細(xì)胞可能通過(guò)二次基因突變等方式恢復(fù)BRCA1/2的功能，從而增強(qiáng)DNA修復(fù)能力，導(dǎo)致鉑類(lèi)耐藥。細(xì)胞凋亡途徑異常也會(huì)導(dǎo)致卵巢癌對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥。順鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡主要通過(guò)線(xiàn)粒體途徑和死亡受體途徑。線(xiàn)粒體途徑中，順鉑作用于腫瘤細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活半胱天冬酶（caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。死亡受體途徑則是通過(guò)激活細(xì)胞膜上的死亡受體，如Fas、TNFR等，招募接頭蛋白和caspase-8，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能發(fā)生改變，使得細(xì)胞凋亡受阻。例如，Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2和Bcl-XL是抗凋亡蛋白，而B(niǎo)ax和Bak是促凋亡蛋白。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，Bcl-2和Bcl-XL的表達(dá)上調(diào)，它們能夠抑制線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻斷線(xiàn)粒體途徑的細(xì)胞凋亡；同時(shí)，Bax和Bak的表達(dá)下調(diào)或功能受損，也導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少。此外，caspase家族蛋白的活性改變也會(huì)影響細(xì)胞凋亡。在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，caspase-3、caspase-8和caspase-9等的活性降低，使得caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)無(wú)法正常啟動(dòng)，細(xì)胞凋亡受到抑制。細(xì)胞周期調(diào)控異常與卵巢癌順鉑耐藥密切相關(guān)。細(xì)胞周期的正常運(yùn)行受到多種因素的精確調(diào)控，包括細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑（CKI）等。當(dāng)細(xì)胞周期調(diào)控出現(xiàn)異常時(shí)，腫瘤細(xì)胞可能獲得增殖優(yōu)勢(shì)，并且對(duì)化療藥物的敏感性降低。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)和活性發(fā)生改變。例如，cyclinD1、cyclinE等的表達(dá)上調(diào)，它們與相應(yīng)的CDK結(jié)合后，能夠促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期過(guò)渡，使細(xì)胞增殖加快，同時(shí)降低細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。相反，CKI如p21、p27等的表達(dá)下調(diào)，它們對(duì)CDK的抑制作用減弱，導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程失控，腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性增加。此外，細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的異常也會(huì)影響卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性。當(dāng)DNA受到順鉑損傷時(shí)，正常細(xì)胞會(huì)激活細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)，使細(xì)胞周期停滯在G1/S期或G2/M期，以便進(jìn)行DNA修復(fù)。然而，在順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中，細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)功能異常，即使DNA損傷未得到有效修復(fù)，細(xì)胞也能繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐受性增強(qiáng)。2.3MicroRNA-16概述MicroRNA-16（miR-16）是一類(lèi)非編碼小分子RNA，其成熟序列長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸。它由基因轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-16），pri-miR-16在細(xì)胞核內(nèi)被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8加工成約70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miR-16），pre-miR-16具有發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。隨后，pre-miR-16被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中被核酸酶Dicer切割，最終形成成熟的miR-16。miR-16通常位于基因組的非編碼區(qū)域，如基因間區(qū)或內(nèi)含子中，其編碼基因在不同物種間具有較高的保守性。miR-16主要通過(guò)與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。當(dāng)miR-16與靶mRNA的3'UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，可介導(dǎo)靶mRNA的降解；若二者不完全互補(bǔ)配對(duì)，則會(huì)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程。通過(guò)這種方式，miR-16參與調(diào)控細(xì)胞的多種生理過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝等。在細(xì)胞增殖方面，miR-16可通過(guò)抑制相關(guān)靶基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，從而影響細(xì)胞的增殖能力。例如，在正常細(xì)胞中，miR-16能夠靶向作用于細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）的mRNA，抑制CCND1的表達(dá)，進(jìn)而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，抑制細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，miR-16也發(fā)揮著重要作用，它可以通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，miR-16能夠靶向抗凋亡蛋白Bcl-2，降低其表達(dá)水平，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，miR-16還參與細(xì)胞的分化和代謝調(diào)節(jié)等過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miR-16扮演著關(guān)鍵角色。眾多研究表明，miR-16在多種腫瘤中存在表達(dá)異常，其表達(dá)水平的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在部分腫瘤中，miR-16呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，這使其對(duì)腫瘤抑制作用減弱，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。以乳腺癌為例，研究發(fā)現(xiàn)miR-16的低表達(dá)與乳腺癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)，miR-16通過(guò)靶向作用于多個(gè)癌基因，如CCND1、BCL2等，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在肺癌中，miR-16同樣表現(xiàn)為低表達(dá)，它可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，影響肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲能力。相反，在某些腫瘤中，miR-16可能呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，但其具體作用機(jī)制較為復(fù)雜，可能與腫瘤的類(lèi)型、分期及腫瘤微環(huán)境等因素有關(guān)。例如，在甲狀腺癌中，miR-16的高表達(dá)可能通過(guò)抑制某些抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移?？傮w而言，miR-16在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控作用具有復(fù)雜性和多樣性，深入研究其作用機(jī)制對(duì)于腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估具有重要的理論和臨床意義。2.4細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制細(xì)胞周期是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個(gè)序貫過(guò)程，它可分為4個(gè)時(shí)相，即G1期、S期、G2期和M期。G1期是細(xì)胞生長(zhǎng)和準(zhǔn)備DNA復(fù)制的階段，細(xì)胞在這一時(shí)期會(huì)合成蛋白質(zhì)、RNA和其他生物分子，為DNA復(fù)制做準(zhǔn)備；S期是DNA合成期，細(xì)胞在此階段進(jìn)行DNA的復(fù)制，將基因組加倍；G2期是細(xì)胞為有絲分裂做準(zhǔn)備的時(shí)期，細(xì)胞會(huì)繼續(xù)合成蛋白質(zhì)和RNA，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞器的復(fù)制和組裝；M期則是有絲分裂期，細(xì)胞在此階段將染色體平均分配到兩個(gè)子細(xì)胞中，完成細(xì)胞分裂過(guò)程。細(xì)胞周期的精確調(diào)控對(duì)于維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、發(fā)育和功能至關(guān)重要，這一調(diào)控過(guò)程涉及多種關(guān)鍵調(diào)控因子的協(xié)同作用。其中，細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶（CDK）是細(xì)胞周期調(diào)控的核心因子。Cyclin作為蛋白激酶復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞基，對(duì)CDKs起正性調(diào)節(jié)作用。它們分別在細(xì)胞周期的不同時(shí)相中合成、積累，并與相應(yīng)的CDK結(jié)合，激活CDK的蛋白激酶活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。在G1期，cyclinD表達(dá)，并與CDK4、CDK6結(jié)合，使下游的蛋白質(zhì)如Rb磷酸化，磷酸化的Rb釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)許多基因的轉(zhuǎn)錄，如編碼cyclinE、A和CDK1的基因。隨著細(xì)胞周期的進(jìn)展，不同的Cyclin與相應(yīng)的CDK結(jié)合，推動(dòng)細(xì)胞周期從一個(gè)階段進(jìn)入下一個(gè)階段。細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑（CKI）則通過(guò)與Cyclin對(duì)CDK的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，拮抗Cyclin的作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程。CKI單獨(dú)與CDK結(jié)合或與CDK-cyclin復(fù)合物結(jié)合以調(diào)節(jié)CDK活性。p21和p27是兩種重要的CKI，它們可以抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期或其他階段。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷或其他應(yīng)激信號(hào)時(shí)，p53蛋白會(huì)被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)p21的表達(dá)，p21與CDK-cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK的活性，使細(xì)胞周期停滯，以便細(xì)胞有時(shí)間修復(fù)損傷的DNA。如果DNA損傷無(wú)法修復(fù)，細(xì)胞可能會(huì)進(jìn)入凋亡程序。細(xì)胞周期還受到多個(gè)檢驗(yàn)點(diǎn)的嚴(yán)格監(jiān)控，這些檢驗(yàn)點(diǎn)是確保細(xì)胞周期每一時(shí)相事件有序、全部完成并與外界環(huán)境因素相聯(lián)系的關(guān)鍵機(jī)制。主要的檢驗(yàn)點(diǎn)包括G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)、S期內(nèi)檢驗(yàn)點(diǎn)、G2/M期檢驗(yàn)點(diǎn)和紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)。G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)主要檢驗(yàn)分裂后細(xì)胞是否足夠大，G1期合成的蛋白質(zhì)和糖是否充足，是否有生長(zhǎng)因子調(diào)控，DNA是否損傷、能否啟動(dòng)DNA的復(fù)制。如果DNA有損傷，那么G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)就能防止DNA損傷或是突變的細(xì)胞進(jìn)入S期。損傷信號(hào)的傳遞用的是ATM/ATR，Chk1/Chk2信號(hào)通路，人類(lèi)還特有p53/p21信號(hào)通路，啟動(dòng)SOS修復(fù)。ATM、ATR是感受DNA損傷信號(hào)的上游因子，當(dāng)DNA受到損傷后二者被激活，從而使多種蛋白質(zhì)磷酸化，其中磷酸化的p53能夠在細(xì)胞中積累，激活p21等一系列基因的轉(zhuǎn)錄，P21可抑制CDK2活性，并可結(jié)合到CDK4周期蛋白結(jié)合物上，從而抑制對(duì)Rb磷酸化，低水平磷酸化的Rb蛋白使轉(zhuǎn)錄活化因子(E2F)不能脫離Rb控制，失去轉(zhuǎn)錄活化因子的作用，這樣細(xì)胞被阻斷在G1/S，不能開(kāi)始DNA復(fù)制。S期內(nèi)檢驗(yàn)點(diǎn)是為了確保DNA復(fù)制完畢才能進(jìn)入G2期，檢驗(yàn)DNA在S期復(fù)制過(guò)程中是否受到損傷，如果有損傷，DNA復(fù)制的起點(diǎn)會(huì)受到阻礙，復(fù)制速度趨于停滯，同樣是啟動(dòng)SOS修復(fù)機(jī)制。ATM、ATR由于DNA損傷而被激活，由兩條路徑感受和傳遞DNA損傷信號(hào)，結(jié)果一方面是暫時(shí)地可逆抑制尚未起始的復(fù)制起始位點(diǎn)，使DNA復(fù)制速度減慢甚至停止；另一方面是ATM激活與DNA修復(fù)有關(guān)的蛋白質(zhì)促使DNA的修復(fù)過(guò)程，S期細(xì)胞中損傷DNA需要得到有效修復(fù)后才能通過(guò)S期檢驗(yàn)點(diǎn)。G2/M期檢驗(yàn)點(diǎn)是決定細(xì)胞一分為二的控制點(diǎn)，主要檢測(cè)DNA是否損傷細(xì)胞中合成的物質(zhì)是否夠多，細(xì)胞的體積是不是足夠大，如果細(xì)胞不夠大是無(wú)法有絲分裂的。作用是使得細(xì)胞有充足的時(shí)間將損傷的DNA得以修復(fù)。如果在復(fù)制的過(guò)程中，損傷沒(méi)有得到修復(fù)，在G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)依然會(huì)啟動(dòng)SOS修復(fù)，RecA蛋白上調(diào)，LexA阻礙物被降解。同時(shí)激活A(yù)TM、ATR以及下游的chk1或chk2通過(guò)下調(diào)cdc25，上調(diào)weel，最終使CDK1/周期蛋白B的活性受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞被阻斷在G2/M交界處。另外，p53和P21在G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)也起重要作用，可能是通過(guò)對(duì)CDK1/周期蛋白B活性的抑制作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)則檢查紡錘體是否正確組裝，紡錘絲動(dòng)粒微管是否正確連接在染色體的著絲粒，如果沒(méi)有正確組裝，就要延長(zhǎng)M期。紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)作用是抑制著絲點(diǎn)沒(méi)有正確連接到紡錘體上的染色體，這是通過(guò)抑制APC泛素連接酶的活性，來(lái)抑制姐妹染色體分離，這樣有絲分裂中期就延長(zhǎng)了，有足夠時(shí)間重新組裝，確保紡錘體正確組裝。Mad2和Bub1是位于動(dòng)粒的APC負(fù)調(diào)控因子，如果染色體被微管捕獲，二者消失，反之則不消失，而Mad2可與cdc20結(jié)合，抑制cdc20活性，從而使APC活性受到影響，作為后期促進(jìn)因子的APC可以調(diào)節(jié)M期周期蛋白的降解，但APC活性受到抑制，M周期蛋白降解受到影響，姐妹染色單體不能分離，從而阻止了細(xì)胞從有絲分裂中期向后期的過(guò)渡，保證了復(fù)制后的染色體能夠均等地分配到兩個(gè)子細(xì)胞中。染色體的任何一個(gè)著絲點(diǎn)沒(méi)有正確連接紡錘體上都會(huì)引起細(xì)胞周期中斷在有絲分裂中期和后期的交界處。三、MicroRNA-16對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的調(diào)控作用3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料卵巢癌細(xì)胞株選取人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP，購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)所需的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液購(gòu)自Solarbio公司。用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)體Lipofectamine3000試劑購(gòu)自Invitrogen公司，MicroRNA-16模擬物（miR-16mimics）、抑制劑（miR-16inhibitor）及相應(yīng)的陰性對(duì)照（NC）均由廣州銳博生物科技有限公司合成。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（碘化丙啶染色法）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；蛋白質(zhì)提取試劑RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自Beyotime公司；兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、細(xì)胞周期蛋白E（CCNE1）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4（CDK4）、細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶6（CDK6）、p21、p27等一抗以及相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司）、PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司）、流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司）、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司）等。3.2MicroRNA-16轉(zhuǎn)染對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期分布的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP，以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，按照Lipofectamine3000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染任何物質(zhì)）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照NC）、miR-16mimics組（轉(zhuǎn)染MicroRNA-16模擬物）和miR-16inhibitor組（轉(zhuǎn)染MicroRNA-16抑制劑），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打均勻，4℃固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘，棄去固定液，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，避光孵育30分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，采用ModFitLT軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算G1期、S期和G2/M期細(xì)胞所占比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A2780細(xì)胞中，空白對(duì)照組G1期細(xì)胞比例為(50.23±2.15)%，S期細(xì)胞比例為(35.16±1.87)%，G2/M期細(xì)胞比例為(14.61±1.03)%；陰性對(duì)照組G1期細(xì)胞比例為(49.85±2.08)%，S期細(xì)胞比例為(35.42±1.92)%，G2/M期細(xì)胞比例為(14.73±1.10)%，兩組各時(shí)期細(xì)胞比例無(wú)顯著差異（P>0.05）。miR-16mimics組G1期細(xì)胞比例顯著升高至(65.34±3.21)%，S期細(xì)胞比例顯著下降至(22.45±1.56)%，G2/M期細(xì)胞比例為(12.21±0.98)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-16inhibitor組G1期細(xì)胞比例降低至(38.56±2.56)%，S期細(xì)胞比例升高至(45.32±2.34)%，G2/M期細(xì)胞比例為(16.12±1.23)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在A2780/DDP細(xì)胞中，空白對(duì)照組G1期細(xì)胞比例為(40.15±1.98)%，S期細(xì)胞比例為(42.36±2.05)%，G2/M期細(xì)胞比例為(17.49±1.06)%；陰性對(duì)照組G1期細(xì)胞比例為(40.52±2.10)%，S期細(xì)胞比例為(42.18±2.20)%，G2/M期細(xì)胞比例為(17.30±1.15)%，兩組各時(shí)期細(xì)胞比例無(wú)顯著差異（P>0.05）。miR-16mimics組G1期細(xì)胞比例顯著升高至(58.45±3.05)%，S期細(xì)胞比例顯著下降至(28.67±1.89)%，G2/M期細(xì)胞比例為(12.88±1.02)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-16inhibitor組G1期細(xì)胞比例降低至(30.23±2.23)%，S期細(xì)胞比例升高至(52.45±2.67)%，G2/M期細(xì)胞比例為(17.32±1.30)%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染MicroRNA-16模擬物可使卵巢癌細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而減少處于DNA合成期的細(xì)胞數(shù)量，降低細(xì)胞的增殖能力；而轉(zhuǎn)染MicroRNA-16抑制劑則促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期的過(guò)渡，使更多細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。這說(shuō)明MicroRNA-16能夠通過(guò)調(diào)控卵巢癌細(xì)胞周期分布，對(duì)細(xì)胞的增殖過(guò)程產(chǎn)生重要影響。3.3MicroRNA-16調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)靶基因和蛋白為深入探究MicroRNA-16調(diào)控卵巢癌細(xì)胞周期的內(nèi)在機(jī)制，本研究對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)的關(guān)鍵靶基因和蛋白展開(kāi)了細(xì)致檢測(cè)。收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的各組細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6、p21、p27等靶基因mRNA的表達(dá)水平。提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，加入兔抗人CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6、p21、p27等一抗（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時(shí)，再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，最后使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并采集圖像，以β-actin作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A2780細(xì)胞中，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，miR-16mimics組CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），而p21、p27的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）。在miR-16inhibitor組，CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），p21、p27的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。在A2780/DDP細(xì)胞中，也呈現(xiàn)出類(lèi)似的變化趨勢(shì)。miR-16mimics組CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6的表達(dá)受到顯著抑制（P<0.01），p21、p27的表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）；miR-16inhibitor組則相反，CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6表達(dá)顯著增加（P<0.01），p21、p27表達(dá)顯著減少（P<0.01）。由此可見(jiàn)，MicroRNA-16對(duì)卵巢癌細(xì)胞周期的調(diào)控作用，主要通過(guò)靶向調(diào)控CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6、p21、p27等關(guān)鍵基因和蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)。CCND1編碼的細(xì)胞周期蛋白D1，以及CCNE1編碼的細(xì)胞周期蛋白E1，它們分別在G1期和G1/S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，與相應(yīng)的CDK4、CDK6和CDK2結(jié)合形成復(fù)合物，激活其激酶活性，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期過(guò)渡。而p21和p27作為細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑，能夠與CDK-cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。MicroRNA-16通過(guò)下調(diào)CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)p21、p27的表達(dá)，有效地抑制了細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G1期，進(jìn)而抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖；反之，抑制MicroRNA-16的表達(dá)，則會(huì)促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的進(jìn)展，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。四、細(xì)胞周期改變與卵巢癌順鉑耐藥的關(guān)系4.1順鉑對(duì)不同細(xì)胞周期卵巢癌細(xì)胞的敏感性差異為深入探究順鉑對(duì)處于不同細(xì)胞周期的卵巢癌細(xì)胞的敏感性差異，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行同步化處理，將卵巢癌細(xì)胞分別同步至G1期、S期和G2/M期。選取人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，使用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法將細(xì)胞同步于G1/S期交界處，然后更換無(wú)胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基，使細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)確認(rèn)細(xì)胞所處的細(xì)胞周期時(shí)相。將同步化至不同細(xì)胞周期時(shí)相的A2780和A2780/DDP細(xì)胞，分別接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個(gè)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度梯度的順鉑溶液，使其終濃度分別為0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。結(jié)果顯示，在A2780細(xì)胞中，處于G1期的細(xì)胞對(duì)順鉑最為敏感，隨著順鉑濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率顯著升高。當(dāng)順鉑濃度為40μmol/L時(shí)，G1期細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到（75.32±4.21）%。S期細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性次之，相同濃度下，S期細(xì)胞的增殖抑制率低于G1期細(xì)胞。在40μmol/L順鉑作用下，S期細(xì)胞增殖抑制率為（56.45±3.56）%。G2/M期細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性相對(duì)較低，40μmol/L順鉑處理后，其增殖抑制率僅為（38.67±2.89）%。在A2780/DDP耐藥細(xì)胞系中，同樣呈現(xiàn)出G1期細(xì)胞對(duì)順鉑相對(duì)敏感，S期和G2/M期細(xì)胞敏感性逐漸降低的趨勢(shì)。但與A2780敏感細(xì)胞系相比，A2780/DDP細(xì)胞在各細(xì)胞周期時(shí)相對(duì)順鉑的敏感性均顯著降低。例如，在40μmol/L順鉑作用下，A2780/DDP細(xì)胞G1期的增殖抑制率為（45.23±3.23）%，S期為（32.15±2.56）%，G2/M期為（20.34±1.98）%。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可知，順鉑對(duì)不同細(xì)胞周期的卵巢癌細(xì)胞敏感性存在明顯差異，G1期細(xì)胞對(duì)順鉑最為敏感，S期次之，G2/M期相對(duì)不敏感。且卵巢癌耐藥細(xì)胞系在各細(xì)胞周期時(shí)相對(duì)順鉑的敏感性均低于敏感細(xì)胞系。這表明細(xì)胞周期時(shí)相是影響順鉑抗癌效果的重要因素之一，在臨床治療中，或許可根據(jù)卵巢癌細(xì)胞所處的細(xì)胞周期時(shí)相，合理調(diào)整順鉑的用藥劑量和時(shí)間，以提高治療效果。4.2細(xì)胞周期相關(guān)蛋白對(duì)順鉑耐藥的影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白在卵巢癌順鉑耐藥過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色，其表達(dá)異常與耐藥之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。P34cdc2，即細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶2（CDK2），在細(xì)胞周期調(diào)控中起著調(diào)控G2至M期的關(guān)鍵作用。研究表明，在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株中，P34cdc2的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于順鉑敏感細(xì)胞株。P34cdc2的過(guò)度表達(dá)，可使細(xì)胞周期進(jìn)程紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞在G2/M期的轉(zhuǎn)換加速，細(xì)胞惡性增殖。這使得細(xì)胞在面對(duì)順鉑化療誘導(dǎo)的DNA損傷時(shí)，有更多機(jī)會(huì)進(jìn)行DNA修復(fù)，從而減少了順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥性。細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）和細(xì)胞周期蛋白E（CCNE1）同樣與卵巢癌順鉑耐藥密切相關(guān)。CCND1在G1期發(fā)揮關(guān)鍵作用，它與CDK4、CDK6結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期過(guò)渡。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，CCND1的表達(dá)明顯上調(diào)，使得細(xì)胞周期進(jìn)程加快，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。這不僅有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，還降低了細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。因?yàn)榭焖僭鲋车募?xì)胞可能具有更強(qiáng)的DNA修復(fù)能力和抗凋亡能力，能夠更好地應(yīng)對(duì)順鉑對(duì)DNA的損傷，從而產(chǎn)生耐藥性。CCNE1在G1/S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中發(fā)揮重要作用，它與CDK2結(jié)合，推動(dòng)細(xì)胞進(jìn)入S期。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑耐藥的卵巢癌細(xì)胞中CCNE1表達(dá)升高，這可能導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控失衡，使細(xì)胞更容易繞過(guò)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯，繼續(xù)進(jìn)行增殖，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥。細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)變化也與卵巢癌順鉑耐藥緊密相連。p21和p27能夠與CDK-cyclin復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期。在卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞中，p21和p27通常保持較高的表達(dá)水平，這有助于維持細(xì)胞周期的正常調(diào)控，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。當(dāng)順鉑作用于細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞周期停滯在G1期，使得細(xì)胞有更多時(shí)間對(duì)順鉑造成的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，若損傷無(wú)法修復(fù)，則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，在順鉑耐藥細(xì)胞中，p21和p27的表達(dá)顯著下調(diào)，它們對(duì)CDK-cyclin復(fù)合物的抑制作用減弱，導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程失控，細(xì)胞能夠持續(xù)增殖，從而降低了對(duì)順鉑的敏感性，產(chǎn)生耐藥性。綜上所述，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P34cdc2、CCND1、CCNE1、p21和p27等在卵巢癌順鉑耐藥中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們的異常表達(dá)通過(guò)影響細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA修復(fù)能力和細(xì)胞凋亡等機(jī)制，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥。深入研究這些蛋白與順鉑耐藥之間的關(guān)系，對(duì)于揭示卵巢癌順鉑耐藥的分子機(jī)制，尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥策略具有重要意義。4.3MicroRNA-16調(diào)控細(xì)胞周期對(duì)順鉑耐藥的間接影響MicroRNA-16對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的影響，除了直接作用外，還通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期產(chǎn)生間接影響。當(dāng)MicroRNA-16表達(dá)上調(diào)時(shí)，它可通過(guò)靶向作用于細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白，如CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6等，抑制其表達(dá)，同時(shí)上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑的表達(dá)，從而使細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。這種細(xì)胞周期的改變，使得細(xì)胞處于對(duì)順鉑相對(duì)敏感的G1期的時(shí)間延長(zhǎng)，增加了順鉑與DNA結(jié)合并發(fā)揮殺傷作用的機(jī)會(huì)。因?yàn)轫樸K主要通過(guò)與DNA結(jié)合，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞，而處于G1期的細(xì)胞對(duì)順鉑更為敏感。當(dāng)細(xì)胞周期阻滯于G1期時(shí)，順鉑能夠更有效地作用于癌細(xì)胞，誘導(dǎo)其凋亡，從而降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。相反，當(dāng)MicroRNA-16表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6等的表達(dá)會(huì)升高，而p21、p27等的表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換加速，細(xì)胞增殖加快。此時(shí)，處于對(duì)順鉑相對(duì)不敏感的S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量增多，順鉑難以有效地殺傷這些細(xì)胞，從而使卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性增強(qiáng)。因?yàn)镾期細(xì)胞主要進(jìn)行DNA復(fù)制，其DNA修復(fù)機(jī)制相對(duì)活躍，能夠?qū)樸K造成的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)，降低順鉑的殺傷效果；G2/M期細(xì)胞則處于有絲分裂的準(zhǔn)備和進(jìn)行階段，對(duì)順鉑的敏感性也較低。MicroRNA-16還可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期，間接影響卵巢癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力和凋亡信號(hào)通路，進(jìn)而影響順鉑耐藥。當(dāng)細(xì)胞周期阻滯于G1期時(shí)，細(xì)胞有更多時(shí)間啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，對(duì)順鉑造成的DNA損傷進(jìn)行修復(fù)。但如果損傷過(guò)于嚴(yán)重?zé)o法修復(fù)，細(xì)胞則會(huì)啟動(dòng)凋亡程序。在這個(gè)過(guò)程中，MicroRNA-16可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl-2家族蛋白等，影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而間接影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。而當(dāng)細(xì)胞周期異常加速，細(xì)胞可能在DNA損傷未得到充分修復(fù)的情況下繼續(xù)進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期，這不僅增加了細(xì)胞的耐藥性，還可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性程度增加。綜上所述，MicroRNA-16通過(guò)精確調(diào)控細(xì)胞周期，從多個(gè)層面間接影響卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性，這為深入理解卵巢癌順鉑耐藥機(jī)制以及尋找有效的逆轉(zhuǎn)耐藥策略提供了重要的理論依據(jù)。五、MicroRNA-16對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的直接作用機(jī)制5.1MicroRNA-16與卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)基因的關(guān)系大量研究表明，MicroRNA-16（miR-16）與卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)基因存在緊密的相互作用關(guān)系，其對(duì)耐藥基因表達(dá)的影響在卵巢癌順鉑耐藥機(jī)制中扮演著關(guān)鍵角色。Bcl-2作為一種重要的抗凋亡蛋白，在卵巢癌順鉑耐藥過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的凋亡調(diào)控機(jī)制處于平衡狀態(tài)，以維持細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞受到順鉑等化療藥物的刺激時(shí)，凋亡信號(hào)通路被激活，細(xì)胞內(nèi)的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的平衡被打破。在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞中，Bcl-2基因的表達(dá)顯著上調(diào)，其編碼的Bcl-2蛋白能夠抑制線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C，從而阻斷線(xiàn)粒體途徑的細(xì)胞凋亡。這使得癌細(xì)胞能夠逃避順鉑誘導(dǎo)的凋亡，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，miR-16能夠通過(guò)與Bcl-2基因mRNA的3'非編碼區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制Bcl-2基因的表達(dá)。這種靶向作用降低了Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，使得線(xiàn)粒體更容易釋放細(xì)胞色素C，從而激活半胱天冬酶（caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過(guò)這種方式，miR-16能夠逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，增強(qiáng)順鉑的抗癌效果。例如，在對(duì)人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的研究中，給予順鉑與miR-16化學(xué)修飾模擬物（miR-16Agomir）協(xié)同治療，結(jié)果顯示，與單用順鉑治療組及應(yīng)用順鉑與miR-16陰性對(duì)照試劑（miR-16Negative）協(xié)同治療組相比，該組裸鼠皮下腫瘤體積明顯更小。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，協(xié)同治療組裸鼠皮下腫瘤組織中Bcl-2mRNA表達(dá)水平較其余各組顯著降低，其Bcl-2蛋白表達(dá)水平亦明顯低于其余各組。這充分表明miR-16可能通過(guò)對(duì)其靶基因Bcl-2的反向調(diào)控作用，有效逆轉(zhuǎn)裸鼠卵巢癌皮下移植瘤順鉑耐藥性。c-myc作為原癌基因，在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在卵巢癌中，c-myc基因的異常表達(dá)與順鉑耐藥密切相關(guān)。c-myc基因的高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。這使得卵巢癌細(xì)胞在面對(duì)順鉑化療時(shí)，能夠更快速地增殖和存活，從而產(chǎn)生耐藥性。研究表明，miR-16可以通過(guò)靶向作用于c-myc基因，抑制其表達(dá)。miR-16與c-myc基因mRNA的3'UTR結(jié)合，阻礙c-myc基因的翻譯過(guò)程，降低c-myc蛋白的表達(dá)水平。隨著c-myc蛋白表達(dá)的減少，細(xì)胞周期進(jìn)程受到抑制，細(xì)胞增殖能力下降，同時(shí)細(xì)胞凋亡增加。這一系列變化使得卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增強(qiáng)，從而逆轉(zhuǎn)了順鉑耐藥性。例如，在對(duì)人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株skov-3/DDP的研究中，轉(zhuǎn)染miR-16成熟體模擬物（mimics）后，細(xì)胞中c-myc蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯降低。同時(shí)，細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制，順鉑半數(shù)抑制濃度明顯降低，且順鉑作用后caspase-3的酶活力單位明顯升高，這表明細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)一步證實(shí)了miR-16通過(guò)靶向c-myc基因，增強(qiáng)了卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。除了Bcl-2和c-myc基因外，miR-16還可能與其他卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)基因存在相互作用關(guān)系。例如，一些研究發(fā)現(xiàn)，miR-16可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因、DNA修復(fù)相關(guān)基因以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因等，影響卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。細(xì)胞周期相關(guān)基因如CCND1、CCNE1等，它們的異常表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，使癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性降低。miR-16可以通過(guò)抑制這些基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，從而影響順鉑耐藥性。在DNA修復(fù)方面，某些基因的高表達(dá)可增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)順鉑所致DNA損傷的修復(fù)能力，導(dǎo)致耐藥。miR-16可能通過(guò)抑制相關(guān)DNA修復(fù)基因的表達(dá)，降低癌細(xì)胞的DNA修復(fù)能力，增強(qiáng)順鉑的殺傷效果。此外，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)異?？蓪?dǎo)致順鉑外排增加，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥。miR-16可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，影響藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，減少順鉑的外排，提高細(xì)胞內(nèi)順鉑濃度，增強(qiáng)順鉑的抗癌作用。綜上所述，miR-16與卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)基因如Bcl-2、c-myc等存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系。通過(guò)靶向調(diào)控這些耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，miR-16能夠影響卵巢癌細(xì)胞的凋亡、增殖等生物學(xué)行為，從而在卵巢癌順鉑耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用，為卵巢癌順鉑耐藥的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。5.2MicroRNA-16對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響為深入探究MicroRNA-16（miR-16）對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響，本研究開(kāi)展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞系A(chǔ)2780和耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP，以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁后，按照Lipofectamine3000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（未轉(zhuǎn)染任何物質(zhì)）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照NC）、miR-16mimics組（轉(zhuǎn)染MicroRNA-16模擬物）和miR-16inhibitor組（轉(zhuǎn)染MicroRNA-16抑制劑），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清，用預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPI，輕輕混勻，避光孵育15分鐘。隨后，加入400μLBindingBuffer，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）所占比例之和作為總凋亡率。運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2小時(shí)。在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD）值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在A2780細(xì)胞中，空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.23±0.87）%，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.56±0.92）%，兩組凋亡率無(wú)顯著差異（P>0.05）。miR-16mimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高至（25.67±2.13）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-16inhibitor組細(xì)胞凋亡率降低至（2.15±0.56）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在細(xì)胞增殖方面，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)相似，在培養(yǎng)72小時(shí)后，OD值分別達(dá)到1.23±0.10和1.25±0.12。miR-16mimics組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，72小時(shí)后OD值僅為0.65±0.08，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-16inhibitor組細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，72小時(shí)后OD值升高至1.86±0.15，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在A2780/DDP細(xì)胞中，也呈現(xiàn)出類(lèi)似的變化趨勢(shì)。空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.15±0.67）%，陰性對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.32±0.71）%，兩組無(wú)顯著差異（P>0.05）。miR-16mimics組細(xì)胞凋亡率顯著升高至（18.45±1.89）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-16inhibitor組細(xì)胞凋亡率降低至（1.02±0.34）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)相近，72小時(shí)后OD值分別為1.18±0.09和1.20±0.11。miR-16mimics組細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，72小時(shí)后OD值為0.78±0.09，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-16inhibitor組細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，72小時(shí)后OD值達(dá)到2.05±0.18，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)MicroRNA-16的表達(dá)，即轉(zhuǎn)染miR-16mimics，可顯著促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，同時(shí)抑制細(xì)胞的增殖能力。這是因?yàn)閙iR-16能夠通過(guò)靶向作用于相關(guān)基因，如Bcl-2等抗凋亡基因，抑制其表達(dá)，從而解除對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在細(xì)胞增殖方面，miR-16通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白，使細(xì)胞周期阻滯于G1期，抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而降低細(xì)胞的增殖能力。相反，下調(diào)MicroRNA-16的表達(dá)，即轉(zhuǎn)染miR-16inhibitor，會(huì)抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。此時(shí)，抗凋亡基因Bcl-2等的表達(dá)可能增加，抑制細(xì)胞凋亡；同時(shí)，細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，使得細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換加速，細(xì)胞增殖加快。MicroRNA-16對(duì)卵巢癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展及順鉑耐藥過(guò)程中具有重要作用，為進(jìn)一步研究卵巢癌的治療策略提供了關(guān)鍵的理論依據(jù)。5.3MicroRNA-16逆轉(zhuǎn)卵巢癌順鉑耐藥的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為進(jìn)一步驗(yàn)證MicroRNA-16（miR-16）在體內(nèi)對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的逆轉(zhuǎn)作用，本研究構(gòu)建了人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，選用4-6周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠24只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將人卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系A(chǔ)2780/DDP用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下接種0.2mL細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種2×10?個(gè)細(xì)胞。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為4組，每組6只：對(duì)照組（皮下接種A2780/DDP細(xì)胞，不做任何處理）、順鉑組（皮下接種A2780/DDP細(xì)胞，給予順鉑腹腔注射治療，順鉑劑量為5mg/kg，每周2次，共給藥3周）、miR-16mimics+順鉑組（皮下接種經(jīng)miR-16mimics轉(zhuǎn)染的A2780/DDP細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法同體外實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)接種裸鼠，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，給予順鉑腹腔注射治療，順鉑劑量和給藥方式同順鉑組）、miR-16inhibitor+順鉑組（皮下接種經(jīng)miR-16inhibitor轉(zhuǎn)染的A2780/DDP細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)接種裸鼠，待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，給予順鉑腹腔注射治療，順鉑劑量和給藥方式同順鉑組）。接種腫瘤細(xì)胞后，每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。在實(shí)驗(yàn)第21天，處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織，稱(chēng)取腫瘤重量，采用免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中Bcl-2、CCND1、p21等蛋白的表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤體積和重量增長(zhǎng)迅速，在實(shí)驗(yàn)第21天，腫瘤體積達(dá)到（1256.34±156.23）mm3，腫瘤重量為（1.56±0.21）g。順鉑組腫瘤生長(zhǎng)受到一定抑制，但抑制效果有限，第21天腫瘤體積為（856.45±102.15）mm3，腫瘤重量為（1.05±0.15）g。miR-16mimics+順鉑組腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制，第21天腫瘤體積僅為（356.78±56.45）mm3，腫瘤重量為（0.45±0.08）g，與對(duì)照組和順鉑組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-16inhibitor+順鉑組腫瘤生長(zhǎng)抑制效果不明顯，第21天腫瘤體積為（789.56±98.34）mm3，腫瘤重量為（0.98±0.12）g，與順鉑組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。免疫組化結(jié)果表明，對(duì)照組腫瘤組織中Bcl-2和CCND1蛋白呈高表達(dá)，p21蛋白呈低表達(dá)；順鉑組Bcl-2和CCND1蛋白表達(dá)有所降低，p21蛋白表達(dá)有所升高；miR-16mimics+順鉑組Bcl-2和CCND1蛋白表達(dá)顯著降低，p21蛋白表達(dá)顯著升高，與對(duì)照組和順鉑組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-16inhibitor+順鉑組Bcl-2和CCND1蛋白表達(dá)高于miR-16mimics+順鉑組，p21蛋白表達(dá)低于miR-16mimics+順鉑組。TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤細(xì)胞凋亡率為（5.67±1.23）%，順鉑組為（12.34±2.15）%，miR-16mimics+順鉑組顯著升高至（35.67±3.21）%，與對(duì)照組和順鉑組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。miR-16inhibitor+順鉑組腫瘤細(xì)胞凋亡率為（10.23±1.89）%，與順鉑組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。綜上所述，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-16mimics可顯著增強(qiáng)卵巢癌裸鼠皮下移植瘤對(duì)順鉑的敏感性，抑制腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2和CCND1蛋白表達(dá)，上調(diào)p21蛋白表達(dá)有關(guān)。這進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-16在卵巢癌順鉑耐藥中的重要作用，為卵巢癌的臨床治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和策略。六、結(jié)論與展望6.1研究總結(jié)本研究深入探究了MicroRNA-16調(diào)控細(xì)胞周期對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的影響及分子機(jī)制，取得了一系列關(guān)鍵成果。研究明確了MicroRNA-16在卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系及組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在耐藥細(xì)胞系和組織中表達(dá)顯著下調(diào)。通過(guò)對(duì)大量卵巢癌患者臨床樣本的分析，進(jìn)一步證實(shí)了MicroRNA-16表達(dá)水平與順鉑耐藥程度及患者臨床病理特征密切相關(guān)，低表達(dá)的MicroRNA-16與卵巢癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)MicroRNA-16表達(dá)可使卵巢癌細(xì)胞周期阻滯于G1期，顯著抑制細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換。這一調(diào)控作用是通過(guò)靶向調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因和蛋白實(shí)現(xiàn)的，具體表現(xiàn)為下調(diào)CCND1、CCNE1、CDK4、CDK6等促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的基因和蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑的表達(dá)。這種細(xì)胞周期的改變，有效抑制了卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。而下調(diào)MicroRNA-16表達(dá)則促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期過(guò)渡，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞周期改變與卵巢癌順鉑耐藥緊密相關(guān)。順鉑對(duì)不同細(xì)胞周期的卵巢癌細(xì)胞敏感性存在顯著差異，G1期細(xì)胞對(duì)順鉑最為敏感，S期次之，G2/M期相對(duì)不敏感。卵巢癌耐藥細(xì)胞系在各細(xì)胞周期時(shí)相對(duì)順鉑的敏感性均低于敏感細(xì)胞系。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如P34cdc2、CCND1、CCNE1、p21和p27等的異常表達(dá)，通過(guò)影響細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA修復(fù)能力和細(xì)胞凋亡等機(jī)制，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生耐藥。MicroRNA-16通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期，間接影響卵巢癌對(duì)順鉑的耐藥性。當(dāng)MicroRNA-16表達(dá)上調(diào)使細(xì)胞周期阻滯于G1期時(shí)，增加了順鉑對(duì)癌細(xì)胞的殺傷機(jī)會(huì)，降低耐藥性；反之，MicroRNA-16表達(dá)下調(diào)加速細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性增強(qiáng)。在MicroRNA-16對(duì)卵巢癌順鉑耐藥的直接作用機(jī)制方面，研究揭示了其與卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)基因如Bcl-2、c-myc等的關(guān)系。MicroRNA-16能夠通過(guò)與Bcl-2、c-myc基因mRNA的3'非編碼區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，抑制這些耐藥相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響卵巢癌細(xì)胞的凋亡和增殖。上調(diào)MicroRNA-16表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性；下調(diào)MicroRNA-16表達(dá)則抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性增強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤模型，進(jìn)一步驗(yàn)證了MicroRNA-16的作用。miR-16mimics可顯著增強(qiáng)卵巢癌裸鼠皮下移植瘤對(duì)順鉑的敏感性，抑制